3 期眭照顺等 : 蜡梅花 cdna 文库构建及其高频出现脂转移蛋白 cdna 的表达 645 香宜人的园林植物, 被列为中国传统名花蜡梅花开冬季, 且能正常完成重要的开花结实生殖阶

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栽廉
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1 中国农业科学 2007, 40(3): Scientia Agricultura Sinica 蜡梅花 cdna 文库构建及其高频出现脂转移蛋白 cdna 的表达眭顺照, 李名扬, 蒋安, 王洋, 秦华, 皮伟, 任琛 ( 西南大学园艺园林学院, 西南大学花卉研究所, 重庆 ) 摘要 : 目的构建蜡梅花 cdna 文库, 分析蜡梅脂转移蛋白基因的表达, 为探索蜡梅冬季开花分子机理, 分离克隆特色基因奠定基础方法以蜡梅花器官为材料, 用 SMART cdna Library Construction Kit 构建文库, RT-PCR 分析基因表达结果经测定原始文库滴度达到 pfu/ml, 扩增总文库滴度约为 pfu/ml, 重组率达到 96%, 插入片段在 0.5 kb 以上, 平均约 1.1 kb, 通过 PCR 检测, 从总文库中检测到了表达丰度不同的蜡梅 PI AP3 和 LTP 基因的特异片段, 说明所构建的文库覆盖度高代表性强,LTP 基因具有内含子, 而总文库中扩增出的 LTP 基因不含内含子, 说明所构建的 cdna 文库无基因组 DNA 污染, LTP 基因在蜡梅开花各个时期均表现较高的转录水平, 与 EST 分析时高频率出现 LTP 序列的情况相符, 证实所构建的文库能够反映蜡梅开花过程基因表达的基本情况结论已获得高质量的蜡梅花 cdna 文库, 可以用于进一步的基因克隆或 EST 测序分析, 这是首次正式报道蜡梅 cdna 文库的构建 LTP 基因在蜡梅开花过程中可能具有重要的生物学功能, 为探索蜡梅冬季开花分子机理提供了线索关键词 : 蜡梅 ;cdna 文库 ; 脂转移蛋白基因 ;RT-PCR Construction of Chimonanthus praecox Flower cdna Library and Expression Analysis of High-Abundancy cdna of Lipid Transfer Protein (LTP) SUI Shun-zhao, LI Ming-yang, JIANG An, WANG Yang, QIN Hua, PI Wei, REN Chen (College of Horticulture and Landscape, Institute of Ornamental Research,Southwest University, Chongqing ) Abstract: Objective The study was conducted to construct the cdna library of Chimonanthus praecox flower and analyze the expression of LTP cdna. Method The cdna library was constructed from flowers of Chimonanthus praecox, using the SMART cdna library construction kit. The expression of LTP cdna was analyzed through reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Result The primary library has a high titer of pfu/ml, in which 98% clones are recombinant and the insert cdnas are more than 0.5 kb, with an average of 1.1 kb. The amplified library has a titer of pfu/ml. The positive signals of PI, AP3 and LTP genes were detected by PCR in the amplified library, though they were expressed at different abundances. The LTP gene from the amplified library had no intron and showed no genomic DNA in the library. RT-PCR showed LTP gene had high transcript levels during the different blooming stages, which is consistent with the fact that it was expressed at high abundance in the mini EST library. Conclusion This high quality cdna library can be further used for gene clone and ESTs analysis and provides a useful tool for the study of the molecular mechanisms of winter-blooming of Chimonanthus praecox. Key words: Chimonanthus praecox; cdna Library; LTP; RT-PCR 0 引言研究意义蜡梅 (Chimonanthus praecox Link) 是蜡梅科蜡梅属的落叶灌木, 为原产中国的一种古老植物, 不仅是第三纪孑遗植物和中国国家二级珍稀濒危植物, 也是世界上少有的真正意义上冬季开花且芳收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 重庆市自然基金项目 (2006BB1336) 和重庆市教委科学技术研究项目 (Kj ) 作者简介 : 眭顺照 (1971-), 男, 四川岳池人, 副研究员, 博士, 研究方向为植物分子生物学 Tel: ; sszcq@126.com 通讯作者李名扬 (1956-), 男, 四川安岳人, 教授, 研究方向为农业生物技术 Tel: ; myl:0628@sina.com

2 3 期眭照顺等 : 蜡梅花 cdna 文库构建及其高频出现脂转移蛋白 cdna 的表达 645 香宜人的园林植物, 被列为中国传统名花蜡梅花开冬季, 且能正常完成重要的开花结实生殖阶段, 证明它对环境的适应具有特殊性, 至少具有特殊的抗寒性目前, 抗寒分子机理的研究结果多数来源于模式植物拟南芥和低温敏感草本植物, 缺乏对木本植物和花器官抗寒分子机理的研究 [1] 探索蜡梅开花的抗寒机理, 克隆相应基因, 对于园林植物观赏性状的改良和作物抗寒育种具有重要意义前人研究进展长期以来, 中国蜡梅研究具有明显优势, 重点对蜡梅科植物的生物学特性野生群落结构及分布的调查种属一级的分类繁殖以及花和叶生物化学等方面的许多重要问题进行了研究, 并取得了不同程度的研究结果 [2] 但关于蜡梅开花过程的研究一直停留在形态观察水平上, 将其单花开放的过程分为萌动期蕾期露瓣期初开期盛开期和落花期 6 个阶段 [3] 对蜡梅开花的分子生物学和重要基因分离克隆的研究未见报道在 NCBI 的基因数据库中, 以 Chimonanthus praecox Link 为关键词仅检索到 1 条序列 (AY622993,ribosomal RNA gene,partial sequence) 相对于其它名花, 蜡梅的研究和利用还存在较大差距本研究切入点为探索蜡梅冬季开花分子机理, 分离克隆其特色基因以用于植物分子育种, 笔者构建了国内外第一个蜡梅花 cdna 文库, 在进行 EST(expression sequence tag, EST) 分析 ( 结果将另文报道 ) 时, 发现一个脂转移蛋白 (lipid transfer protein,ltp) 基因 (cdna) 在蜡梅花 cdna 文库中出现频率最高, 这一基因可能在蜡梅开花过程中有重要的作用, 引起笔者的关注 LTP 在蜡梅开花过程中表达情况如何与正确评价文库质量有密切关系, 对于探索蜡梅开花机理以及脂转移蛋白功能具有指导意义拟解决的关键问题利用 SMART ( switching mechanism at 5'end of RNA transcript) 技术构建了蜡梅花 cdna 文库, 通过分析文库基本参数, 分析 LTP 的表达, 对蜡梅花 cdna 文库质量进行了评价, 初步明确了 LTP 在蜡梅开花过程中的表达特点 1 材料与方法 1.1 试验材料本研究于 2004 至 2005 年在西南大学花卉研究所进行植物材料供试蜡梅品种为罄口蜡梅, 种植于西南大学校园内, 常规管理蜡梅 C. praecox(linn.) Link 常见变种有 : 素心蜡梅 var. concolor Makino, 罄口蜡梅 var. grandiflora Makino, 红心蜡梅 var. intermedius Makino 和小花蜡梅 var. parviflorus Turrill 其中, 罄口蜡梅叶长达 20 cm, 花径 3~3.5 cm, 内轮花被有紫红色边缘和条纹, 香味浓其花色花香和花形在蜡梅中具有代表性 [4] 试剂文库构建试剂盒 SMART cdna Library Construction Kit(K1051-1) 购自 CLONTECH 公司, 包装蛋白 GigapackIII Gold Packaging Extract (200201) 购自 Stratagene 公司,RNA 提取试剂盒购自 WATSON(W6771),cDNA 一链合成试剂盒 Revertaid TM First Strand cdna Synthesis Kit(MBI, K1622) 购自晶美生物工程有限公司, 其它常规试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司引物设计检测文库插入片段大小的 PCR 引物根据文库载体 λtripiex2 的 MCS 位点已知序列设计合成 : λp1:5'- TCC GAG ATC TGG ACG AGC-3'; λp2:5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3' 检测文库覆盖度的基因特异引物根据蜡梅 PI AP3 LTP 基因特异探针 ( 本实验室克隆, 将另文发表 ) 设计合成 : CPI1:5'-GGAGGAATACTGAAAAAGGCAAAG GAG-3'; CPI2:5'-TCCTGATGCAGATTAGGCTGAATTG G-3'; CAP31: 5'- AGTATTGCAGCCCTCCAACTACC AC-3'; CAP32:5' - CGTTGGAGCCATACGCAATTTCG TG-3'; CLTP1:5'-TGACTGAGTAAGTAAGCGGAGA TG-3'; CLTP2:5'-GGACTAGCAAACTAGCAAGAGC A-3' 1.2 试验方法取材与 RNA DNA 提取按照文献 [3] 的蜡梅分期方法, 采摘萌动期蕾期露瓣期初开期盛开期和落花期蜡梅花 ( 芽 ), 去掉花托, 立即用液氮速冻研磨, 按照试剂盒说明提取各个时期的总 RNA 采用核酸浓度测定仪 (SHIMADZU 产品 : Bio-specmini) 检测总 RNA 的质量, 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性和稳定性 [5] 以幼嫩叶片为材料, 按照 CTAB 法提取基因组 DNA

3 646 中国农业科学 40 卷文库构建分别取蕾期露瓣期初开期盛开期的总 RNA 1.5 µl, 充分混匀, 然后取 3.0 µl( 约 2.0g), 按照试剂盒说明构建文库文库质量鉴定原始文库与扩增文库滴度测定与文库插入片段大小及重组率 PCR 检测参照文献 [6] 进行扩增文库中目的基因 PCR 检测 : 在 95 变性 10 min 裂解噬菌体, 加入 PCR 反应混合物, 并按以下程序扩增 :94 预变性 45 s;94 变性 45 s,56 退火 1 min, 72 延伸 1 min,30 循环 ; 72 延伸 10 min 以各自片段克隆质粒为阳性对照, 用相同的扩增条件另外, 以基因组 DNA 为模板,CLTP1 CLTP2 为引物, 同样条件扩增, 检测 LTP 基因内含子的大小 LTP 的 RT-PCR 分析用 cdna 一链合成试剂盒 (MBI) 合成不同时期的蜡梅花 ( 芽 )RNA 的一链 cdna 操作均按试剂盒说明书进行, 取 0.5 µl 一链产物为模板进行 PCR 扩增,25 µl 体系包括 1 PCR Buffer,0.2 mmol L -1 dntps,1.5 mmol L -1 MgCl 2, 上下游引物各 0.4 µmol L -1, 1U Taq DNA 聚合酶 (TaKaRa) 温度循环参数为 94 预变性 5 min;94 45 s,53 45 s,72 1 min,22 个循环 ;72 延伸 5 min 用 Ubiquitin 基因作内标, 上游引物 : 5'-AGATATTCGTGAAGACC CTGACC-3', 下游引物 : 5'-TTGGTCGCAGCTGATTG CTGTG-3', Tm=60, 其余条件同脂转移蛋白基因表明原始文库滴度为 pfu/ml 扩增总文库滴度约为 pfu/ml, 表明该扩增文库的库容量很大, 可以满足克隆极低丰度 cdna 以及目的基因对库容的要求随机挑选的 50 个单噬菌斑进行 PCR, 插入片段分布在 0.5~2.5 kb 之间,1 kb 以上的占 60%, 平均约 1.1 kb, 重组率达到 96%( 图 2) 以蜡梅花器官特性基因 PI AP3 的特异引物从总文库中分别扩增出了与各自的阳性对照大小相同的片段 (PI 554 bp,ap3 462 bp) 用 LTP 的特异引物也从总文库中扩增出了与阳性对照大小相同的片段 (446 bp)( 图 3) AP3 PI LTP 表达量不同, 但均能检测到阳性, 这表明文库的覆盖度较高以基因组 DNA 为模板的扩增结果表明,LTP 有约 450 bp 的内含子, 用 LTP 的特异引物仅从总文库中扩增出了与阳性对照大小相同的特异片段, 没有扩增出比阳性对照大的其它片段, 这说明文库没有基因组 DNA 污染以上各指标都表明已获得高质量的 cdna 文库, 可用于进一步的文库筛选或 EST 分析 2.4 蜡梅 LTP 基因的表达分析提取不同时期蜡梅花器官的总 RNA, 以 Ubiquitin 基因作内标, 进行 RT-PCR 分析, 结果表明 ( 图 4), LTP 基因在蜡梅开花全过程的 6 个时期均有较高水平 2 结果与分析 2.1 RNA 提取在普通琼脂糖凝胶电泳中,28S rrna 与 18S rrna 的比例约为 2 左右, 没有明显的 5S rrna, 表明总 RNA 比较完整 ( 图 1-A) 测得 A 260 /A 280 >1.8, 表明 RNA 的纯度很高 RNA 于 37 下保育 2 h, 与对照无明显的差异, 表明 RNA 的稳定性良好, 符合建库要求 2.2 文库 cdna 第 1 链的 LD-PCR cdna 第 1 链的 LD-PCR(long distance PCR) 是文库构建的关键检测步骤 LD-PCR 产物主要集中在 0.5~4.0 kb 之间, 丰度重心在 0.6~1 kb 之间 ( 图 1-B) 符合植物 mrna 相对较短的分布特征, 反映出所提取的 RNA 和所合成的 cdna 较为完整, 质量较好, 可保证获得较高质量的文库 2.3 cdna 文库的质量评价将包装产物稀释后进行原始文库滴度检测, 结果 1. 总 RNA; 2. 在 37 下温浴 2h 的总 RNA; M1.DL2000; M2.λDNA/Hind Ⅲ;C P. 蜡梅 cdna 1.Total RNA; 2. Total RNA incubatedat 37 for 2 h; M1. DL2000; M2. λdna/hindⅢ;c P.cDNA of C. Praecox 图 1 RNA(A) 与 LD-PCR cdna(b) 电泳检测 Fig. 1 Total RNA from C. Praecox(A)and LD-PCR cdn (B)on 1.1% agarose

4 3 期眭照顺等 : 蜡梅花 cdna 文库构建及其高频出现脂转移蛋白 cdna 的表达讨论 M. DL2 000; -CK. 阴性对照 ; 1~23. 单噬菌斑编号 M. DL2 000; -CK. Negative control; The number of single plaques 图 2 cdna 文库插入片段大小及重组率检测 Fig. 2 Detection of inserts of the library and the combining rate M.DL2 000; +CK. 阳性对照 ; -CK. 阴性对照 ; PI. 雌蕊基因 ;AP3. 无花瓣基因 3; LTP. 蜡梅脂转移蛋白基因 ; LTP DNA. 以基因组 DNA 为模板扩增到的脂转移蛋白基因 M. DL2 000; +CK. Positive control; -CK. Negative control; PI.Pistillata; AP3. Apetala3; LTP. Lipid transfer protein gene; LTP DNA. Amplified LTP using genomic DNA as model 图 3 文库特异基因检测 Fig. 3 Gene special detection of the library 1. 萌动期 ;2. 蕾期 ;3. 露瓣期 ;4. 初开期 ;5. 盛开期 ;6. 落花期 1.Sprout period; 2.Flower-bud period; 3. Display-petal period; 4. Initiating bloom period; 5. Bloom period; 6. Wither period 图 4 蜡梅 LTP 基因的 RT-PCR 分析 Fig. 4 The RT-PCR analysis of the expressions of CpLTP 的表达, 并且各时期间几乎没有差异在进行 EST (expression sequence tag,est) 分析时发现,LTP 在蜡梅花 cdna 文库中出现频率最高, 这与 RT-PCR 分析结果一致说明笔者构建的文库比较真实地反映了蜡梅开花过程基因表达的情况, 文库质量可靠蜡梅花在隆冬季节开放的过程中, 除了受低温等气候因素综合作用外, 还可能受蜡梅花发育进程的调控本研究在蜡梅花自然开放的过程中选择典型时期混合采样, 构建 cdna 文库, 目的是综合反应这一时期的基因自然表达情况这有别于一般的用某种因素胁迫处理后采样构建 cdna 文库的策略, 主要是基于以下两方面的考虑 : 一方面, 由于目前对于蜡梅开花机理了解甚少, 无法明确蜡梅开花过程的主导因素 ; 另外, 蜡梅从萌芽到开花的时间跨度长, 外界环境变化大, 蜡梅花自身也发生了极其复杂的变化, 即使明确了某种因素, 也不方便开展相应的胁迫处理本文构建的 cdna 文库恰恰反映了蜡梅花从萌芽到开花的自然过程涉及到大量基因参与和相互作用的实际情况, 为在基因组水平上开展基因表达技术 ( 如基因芯片技术 EST 技术等 ) 研究奠定了基础由此认为本文结果对研究蜡梅冬季开花及其抗逆机制以及克隆相关基因, 具有一定的参考价值本研究所用的方法便捷有效, 与众多研究者的结果一致 [7~10], 试验采用 CLONTECH 公司的 SMARTTM cdna Library Construction Kit 及 SMART(Switching Mechanism At 5' end of RNA Transcript) 技术, 构建的蜡梅花 cdna 文库具备较高的质量, 文库重组率达到 96%, 插入片段平均为 1.1 kb, 并从文库中检测到了不同表达丰度的基因 PI AP3 和 LTP 在提取高质量总 RNA 的前提下, 不经过 mrna 的纯化过程, 直接利用总 RNA 建库, 减少了 mrna 降解和损失的机会, 使 mrna 最大限度地得到了利用, 从而使库容量得到了保证利用 SMART 技术建库, 不需要甲基化接头平端连接等繁琐操作, 建库程序简单, 可以有效地保证 cdna 的完整性运用 LD-PCR 对第二链 cdna 进行合成, 使得低丰度的基因在文库中得到富集, 便于稀有 mrna 的扩增和克隆, 从而保证文库有较高的代表性最初的生化研究认为植物脂转移蛋白转移膜结构上的脂类, 参与生物膜的合成 [11] 随后也有大量的研究表明 LTP 参与角质形成体细胞发生植物与病原发生防御反应以及使植物适应于不同的环境条件等过程 [12~15] LTP 的表达除了与发育过程密切相关外, 还受到低温高温干旱和盐渍等环境因素的影响 [16~18] 本文利用 RT-PCR 技术, 证实了 LTP 基因在蜡梅的萌动期蕾期露瓣期初开期盛开期落花期均有较高的转录水平关于蜡梅开花过程中 LTP 基因在转

5 648 中国农业科学 40 卷录水平上的长时间表达是蜡梅花发育的生理需要, 还是冬季低温胁迫的作用, 尚有待进一步研究 4 结论综合分析所构建的蜡梅花 cdna 文库基本指标, 结合 LTP 基因转录水平的初步 RT-PCR 分析, 表明已获得高质量的蜡梅花 cdna 文库, 可以用于进一步的基因克隆或 EST 测序分析这是首次正式报道蜡梅 cdna 文库的构建 LTP 基因在蜡梅冬季开花过程中可能有重要的生物学功能, 值得关注采用文库基本指标测定与典型基因表达分析相结合的方法评判文库质量, 相对于单纯的文库基本指标测定的方法更为准确, 在进行大规模测序前有必要进行, 本文的结果对同类研究有一定参考价值 References [1] 林善枝, 张志毅, 林元震. 植物抗冻蛋白及抗冻性分子改良. 植物生理与分子生物学学报,2004, 30(3): Lin S Z, Zhang Z Y, Lin Y Z. Antifreeze proteins and molecular genetic improvement in freezing resistance of plants. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 2004, 30: (in Chinese) [2] 明军, 明刘斌. 蜡梅科植物种质资源研究进展. 北京林业大学学报,2004, 26( 增刊 ): Ming J, Ming L B. Research advances in Calycanthaceae. Journal of Beijing Forestry University, 2004, 26(Suppl.): (in Chinese) [3] 吴昌陆, 胡南珍. 蜡梅花部形态和开花习性研究. 园艺学报, 1995, 22: Wu C L, Hu N Z. Studies on the flower form and blooming characteristics of the wintersweet. Acta Horticulturae Sinica, 1995, 22: (in Chinese) [4] 熊济华. 观赏树木学. 北京 : 中国农业出版社, 1998: 233. Xiong J H. Ornamental Trees and Shrubs. Beijing: Chinese Agricultural Press, 1998: 233. ( in Chinese) [5] F M 奥斯伯,R E 金斯顿,J G 塞德曼,K 斯特拉尔,R 布伦特,D D 穆尔, J A 史密斯. 马学军, 舒跃龙等译. 精编分子生物学实验指南, 第 4 版. 北京 : 科学出版社, 2005:54-55 Ausubel F M, Kingston R E, Seidman J.G, Struhl K, Moore D D, Smith J A, Translated by MaX J,Shu Y L.Short Protocols in Molecular Biology. Beijing: Science Press, 2005: (in Chinese) [6] 金治平, 赵德修, 乔传令, 付春祥. 水母雪莲愈伤组织 cdna 文库的构建. 植物学通报, 2004,21(1): Jin Z P, Zhao D X, Qiao C L, Fu C X. Construction of cdna library from the callus of Saussrea medusa maxim. Chinese Bulletin of Botany, 2004, 21(1):61-65.(in Chinese) [7] Tian Z D, Liu J, Xie C H. Cloning of a pathogenesis-related protein gene cdna of potato using RACE methods combined with cdna library. Acta Genetica Sinica, 2003,30: [8] Li G, Liu M, Jiang Y, Qiao D R, Cao Y. Construction and functional gene screening of cdna library of Dunaliella salina. Journal of Tropical and Subtropical Botany, 2004, 12(1): [9] 陈亮, 赵丽萍, 高其康. 茶树新梢 cdna 克隆测序和表达序列标签 (ESTs) 特性分析. 农业生物技术学报, 2005,13(1): Chen L, Zhao L P, Gao Q K. Sequencing of cdna clones and analysis of the expressed sequence tags (ESTs) properties of young tea plant (Camellia sinensis) shoots. Journal of Agricultural Biotechnology, 2005,13(1): ( in Chinese) [10] Fu X H, Huang Y L, Deng S L, Zhou R C, Yang G L, Ni X W, Li W J, Shi S H. Construction of a SSH library of Aegiceras corniculatum under salt stress and expression analysis of four transcripts. Plant Science, 2005,169 : [11] Kader J C. Lipid-transfer proteins in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 1996,47: [12] 冯晓燕, 于静娟, 赵倩, 敖光明. 谷子脂转移蛋白 cdna 的克隆及特性研究, 农业生物技术学报, 2003, 11(1): Feng X Y, Yu J J, Zhao Q, Ao G M. Cloning and characterization of a Stetaria italica lipid transfer protein cdna. Journal of Agricultural Biotechnology, 2003,11(1):11-15.( in Chinese) [13] Wang S Y, Wu J H, Ng T B,Ye X Y, Rao P F. A non-specific lipid transfer protein with antifungal and antibacterial activities from the mung bean. Peptides, 2004,25: [14] Wang Z, Xie W Q, Chi F, Li C F. Identification of non-specific lipid transfer protein-1 as a calmodulin-binding protein in Arabidopsis. FEBS Letters, 2005, 579: [15] Jung H W, Lim C W, Hwang B K. Isolation and functional analysis of a pepper lipid transfer protein III (CALTPIII) gene promoter during signaling to pathogen, abiotic and environmental stresses. Plant Science, 2006, 170: [16] Elena M, Yubero S, Enriqueta M, Nieves M E, Juan M B, Caballero J L. Identification of a strawberry gene encoding a non-specific lipid transfer protein that responds to ABA, wounding and cold stress. Journal of Experimental Botany, 2003, 54: [17] Jang C S, Lee H J, Chang S J, Seo Y W. Expression and promoter analysis of the TaLTP1 gene induced by drought and salt stress in wheat (Triticum aestivum L.).Plant Science, 2004, 167: [18] Boutrot F, Guirao A, Alary R, Joudrier P, Gautier M F. Wheat non-specific lipid transfer protein genes display a complex pattern of expression in developing seeds. Biochimica et Biophysica Acta, 2005, 1730: ( 责任编辑曲来娥 )

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