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幼惟慕容
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1 论著血塞通注射液致动物急性过敏反应研究项峥, 张剑峰, 肖航, 窦德强 * ( 辽宁中医药大学, 辽宁大连 ) 摘要 : 目的探讨血塞通注射液引起的急性过敏反应的机制方法采用 ELISA 法测定给药后豚鼠小鼠血清中 IgE 及组胺的含量变化, 同时观察其过敏行为的变化, 判断急性过敏反应的类型, 采用显微观察血塞通注射液引起肥大细胞脱颗粒情况结果血塞通注射液给药后引起豚鼠小鼠的 IgE 及组胺升高, 血塞通注射液引起小鼠的过敏及过敏样反应行为较豚鼠明显血塞通注射液可引起致敏后及未致敏的肥大细胞脱颗粒结论血塞通注射液引起的急性过敏反应为过敏样反应及 I 型过敏反应, 目前中国药典采用的豚鼠评价模型对于评价注射液的过敏样反应有待商榷关键词 : 皂苷 ; 急性过敏反应 ; 免疫球蛋白 E; 组胺中图分类号 :R284.1;R 文献标志码 :A 文章编号 : (2012) Research in Acute Hypersensitive Reaction Caused by Xuesaitong Injection XIANG Zheng, ZHANG Jianfeng, XIAO Hang, DOU Deqiang * (College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To study the mechanism of acute hypersensitive reaction caused by Xuesaitong injection. METHODS Contents of IgE and histamine in blood serum of guinea-pig and mouse were determined by kits of ELISA. Anaphylactic behaviors of guinea-pig and mouse were observed after administration. Degranulation of mast cell caused by Xuesaitong injection was observed. RESULTS Contents of IgE and histamine were obviously increased after administration. Manifestations of anaphylactic behaviors of mouse were more obvious. And degranulation of mast cell was observed. CONCLUSION Anaphylaxis and anaphylactoid reaction were the main acute hypersensitive reaction caused by Xuesaitong injection. Guinea-pig was not the experimental animal suitable for assay the anaphylactoid reaction caused by injection. KEY WORDS: saponin; acute hypersensitive reaction; IgE; histamine 目前, 正式批准生产的中药注射剂多达百种, 但其成分复杂, 质量很难进行控制, 近年来随着越来越多的中药注射液在临床上的使用, 其引起的不良反应尤其是急性过敏反应的报道也逐渐增多抽样调查显示, 中药注射剂引起的不良反应占中药不良反应总数的 72.27% [1], 居各类制剂之首中药注射液的不良反应已经越来越引起各级药监部门的重视, 其中 2006 年 6 月 1 日 SFDA 发布了关于暂停使用和审批鱼腥草注射液等 7 个注射剂的通告血塞通注射液的主要有效成分为三七芦头总皂苷, 其中人参皂苷 -R1 -Rb 1 -Re -Rg 1 和 -Rd 含量较高, 为主要皂苷成分它具有降低机体耗氧抑制血小板聚集抗凝抗血栓和扩张心脑血管等药理作用, 主要用于缺血性脑血管疾病脑出血后遗症冠心病等的治疗因其作用快疗效确切等优点已成为临床常规用药近年来, 有关血塞通注射液的不良反应报道逐渐增多流行病学研究结果显示 [2-11], 血塞通注射液引起的不良反应累积多个系统其临床表现复杂多样, 以急性过敏反应为主, 占不良反应总数的 80% 以上急性过敏反应包括由免疫机制引起 Ⅰ 型过敏反应及药物直接作用于肥大细胞或嗜碱性粒细胞引起介质释放所致过敏样反应 [12] 目前, 尚未有明确的有关急性过敏反应的评价模型及评价指标中国药典中规定中药注射液过敏性检查以评价 Ⅰ 型过敏反应为主, 缺少相应的类过敏反应评价标准为此, 笔者分别采用豚基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ); 高等学校博士学科点专项科研基金课题 ( ) * 作者简介 : 项峥, 男, 博士生 Tel: (0411) rainbowaftersnow@hotmail.com 通信作者 : 窦德强, 男, 博士, 教授 Tel: (0411) doudeqiang2003@yahoo.com.cn 中国现代应用药学 2012 年 9 月第 29 卷第 9 期 Chin JMAP, 2012 September, Vol.29 No.9 767

2 鼠小鼠为动物模型, 观察其行为变化, 并结合组胺及 IgE 为生化指标对血塞通注射剂引起的过敏反应类型及合适动物模型进行判断 1 仪器与材料 1.1 实验仪器 CellMate Ⅱ 移液器 (Matrix,USA);Finnpipette 可调式移液器 (Thermo);HZS-H 水浴振荡器 ( 哈尔滨市东联电子技术开发公司 ); 酶标仪 (Sunrise- Basic Tecan,Austria);Olympus BX50 显微镜 1.2 药品与试剂血塞通注射液 ( 哈尔滨珍宝制药有限公司批号 : , 规格 :2 mg ml ); 卵白蛋白及 Compound 48/80(Sigma-Aldrich Co., USA); 组胺检测试剂盒 (IBL International, Germany);IgE 检测试剂盒 (R&D Co., USA); 生理盐水 ( 赤峰荣济堂药业有限公司 ), 中性红 ( 国药集团化学试剂有限公司 ); NaCl NaHCO 3 KCl NaH 2 PO 4 2H 2 O 无水葡萄糖均购自天津科密欧化学试剂公司 1.3 实验动物健康豚鼠,, 体质量 350~450 g, 小鼠,, 体质量 20 g 左右, 均购于大连医科大学实验动物中心, 实验动物许可证号 :SCXK( 辽 ) 方法 2.1 以豚鼠为动物模型对血塞通注射液引起的急主动全身过敏试验 (ASA) 健康豚鼠 24 只,, 体质量 350~450 g 随机分组, 每组 6 只, 共 4 组, 腹腔注射相当于人体给药 1,4 倍量血塞通注射液, 生理盐水及卵白蛋白, 隔日 1 次致敏, 共 3 次, 并于末次给药后第 12 天耳缘静脉注射 2 倍致敏剂量进行攻击各组观察 30 min 内豚鼠行为变化心脏采血, 静置 30 min 后以 r min 离心 10 min, 取血清, 采用 ELISA 法测量豚鼠血清中 IgE 及组胺含量过敏样反应试验健康豚鼠 18 只,, 体质量 350~450 g 随机分组, 每组 6 只, 共 3 组, 分别一次性耳缘静脉注射生理盐水阳性对照药 Compound 48/80 及激发剂量的血塞通注射液 (8 倍量 ) 上述各组观察 30 min 内豚鼠行为变化心脏采血, 静置 30 min 后以 r min 离心 10 min, 取血清, 采用 ELISA 法测量豚鼠血清中 IgE 及组胺含量 2.2 以小鼠为动物模型对血塞通注射液引起的急血塞通注射剂致敏后血清中 IgE 及组胺含量变化的研究健康小鼠 40 只,, 体质量 20 g 左右, 随机分成 4 组, 每组 10 只, 分别腹腔注射相当于人体给药 1,2 倍量血塞通注射液, 生理盐水及卵白蛋白, 隔日 1 次致敏, 共 3 次, 于末次给药后第 12 天眼球取血, 静置后以 r min 离心 10 min, 采用 ELISA 法测量小鼠血清中 IgE 及组胺含量血塞通注射剂全身主动攻击试验血清中 IgE 及组胺含量变化健康小鼠 40 只,, 体质量 20 g 左右, 随机分成 4 组, 每组 10 只, 分别腹腔注射血塞通注射液, 生理盐水及卵白蛋白, 隔日 1 次致敏, 共 3 次, 于末次给药后第 12 天以 2 倍致敏剂量静脉注射给药进行攻击, 观察动物 30 min 内行为变化, 眼球取血, 静置后以 r min 离心 10 min, 采用 ELISA 法测量小鼠血清中 IgE 及组胺含量血塞通注射液引起小鼠类过敏反应的研究健康小鼠 60 只,, 体质量 20 g 随机分成 6 组, 每组 10 只, 分别一次性尾静脉注射生理盐水 Compound 48/80 及血塞通注射剂上述各组观察 30 min 内小鼠行为变化 30 min 后眼球取血, 静置, 以 r min 离心 10 min 后取血清, 采用 ELISA 法测定其中的组胺含量 2.3 肥大细胞脱颗粒实验急性过敏反应与肥大细胞脱颗粒释放组胺有关, 因此笔者采用脱颗粒率即每片数 100 个肥大细胞中脱颗粒肥大细胞个数, 作为指标对血塞通注射剂致肥大细胞脱颗粒进行研究肥大细胞提取 : 分别取上述各实验组健康雄性小鼠若干, 眼球放血致死剪开皮肤, 向小鼠腹腔内注入 4 ml 台氏缓冲液, 注射后小鼠腹部按摩 4 min, 以吸管吸取腹腔液将腹腔液与药物共孵育 5 min 后以中性红染色观察药物引起的肥大细胞脱颗粒情况台氏液配制 :NaCl g;nahco g; KCl g;nah 2 PO 4 2H 2 O g; 无水葡萄糖 g, 以三蒸水稀释至 ml 方法 : 取脱脂载玻片, 加一滴 1% 中性红无水乙醇, 干后, 加一滴肥大细胞悬液, 再加生理盐水或抗原一滴, 置 37 温箱孵育 5 min, 取出后加盖玻片, 立即镜检每片数 100 个肥大细胞, 768 Chin JMAP, 2012 September, Vol.29 No.9 中国现代应用药学 2012 年 9 月第 29 卷第 9 期

3 计算肥大细胞脱颗粒率 3 结果与讨论 3.1 以豚鼠为动物模型对血塞通注射液引起的急血塞通注射液按照中药注射剂过敏反应指导原则评价, 以人体给药剂量 1,4 倍量分别对豚鼠进行致敏并激发以及过敏样反应后未见过敏行为发生, 但主动全身过敏试验及大剂量过敏样试验组 (8 倍量 ) 结果显示血清中组胺及 IgE 水平均升高, 结果见表 1 和表 2 与生理盐水对照组相比有显著性差异 (P<0.01), 因此, 血塞通注射剂虽未致豚鼠产生过敏行为, 但其血清中 IgE 及组胺显著升高, 具有诱发豚鼠过敏反应的倾向不同给药组与卵白蛋白组 IgE 与组胺含量水平相当, 但不能引起豚鼠过敏行为的发生, 可见过敏反应并非仅与 IgE 和组胺升高相关, 因此在评价注射剂急性过敏反应时可增加其他的生化指标 3.2 以小鼠为动物模型对血塞通注射液引起的急血塞通注射液致敏后血清中 IgE 及组胺含量变化的研究当对小鼠隔日致敏 3 次后第 12 天, 血塞通注射液 (1 倍量及 2 倍量 ) 及卵白蛋白给药组未见小鼠过敏行为发生统计结果显示, 血塞通给药组及卵白蛋白给药组小鼠血清中的 IgE 含量与生理盐水组对比升高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 但小鼠血清中组胺未见升高, 与阴性对照组差异无统计学意义, 结果见表 3 由结果可知, 血塞通注射液致敏后能引起小鼠 IgE 的升高, 可诱导由 IgE 介导的 Ⅰ 型过敏反应血塞通注射液主动全身过敏试验血清中 IgE 及组胺变化研究小鼠主动全身过敏试验, 未见过敏行为发生, 但给药组较生理盐水对照组血清中的 IgE 含量明显升高, 经统计显示给药组与生理盐水组有显著性差异, 而血清中组胺与阴性对照组未见升高, 结果见表 4 但在测定上述指标时, 有 3 只小鼠血清中组胺的含量较高, 其组胺含量最高者与阳性对照组相当因此, 可以初步判定, 血塞通正常给药时 (1 倍量及 2 倍量 ), 并未见过敏反应发生个别小鼠组胺含量增高较明显, 说明血塞通注射液有引起 Ⅰ 型过敏反应的能力这与其临床应用过程中的过敏不良反应发生几率较小的报道基本吻合血塞通注射液引起小鼠过敏样反应的研究小鼠一次性尾静脉注射不同剂量的血塞通注射液时各实验组均出现不同程度的过敏行为变化, 采用 SPSS 统计软件对其血清中组胺及 IgE 水平进行比较, 结果显示, 血塞通注射液给药组小鼠血清中组胺水平与生理盐水对照组差异具有统计学意义 (P<0.01), 但其血清中 IgE 含量变化无规律, 结果见表 5 由本次实验结果以及临床上不良反应发生情况可知, 血塞通注射液引起的小鼠急性过敏反应包括与给药量相关的过敏样反应 3.3 肥大细胞脱颗粒实验正常肥大细胞呈现圆球型, 细胞膜完整, 轮廓较清晰 ; 血塞通致敏组未见形状异常, 血塞通致敏并激发组与卵白蛋白致敏激发组显示细胞轮廓不规则, 细胞变形, 同时可见有染色的颗粒向细胞外扩散, 上述两组发生部分肥大细胞脱颗粒现象 ; 小鼠体内注射 Compound 48/80 及肥大细胞与 Compound 48/80 共孵育结果显示, 肥大细胞轮廓不清, 细胞内发生严重的脱颗粒现象, 胞浆出现空泡血塞通注射液与肥大细胞共孵育组显示肥大细胞的形态发生改变一次性注射大剂量血塞通注射剂 (0.3 ml) 后小鼠死亡的肥大细胞显示, 该组肥大细胞有脱颗粒现象, 并可见胞浆空泡结果见表 6 和图 1 表 1 血塞通注射液主动全身过敏试验及其生化指标含量 Tab 1 Behavior disorders and content variations of IgE and histamine in active systemic anaphylaxis (ASA) induced by Xuesaitong injection 实验组给药量 ( 折算人体给药量 ) 行为变化 IgE 含量 /µg ml 组胺含量 /µg L 生理盐水 0.5 ml 无行为异常 ± ±0.16 血塞通 0.2 ml (1 倍量 ) 无行为异常 ± ) 51.37±1.51 1) 血塞通 0.8 ml (4 倍量 ) 无行为异常 ± ) 46.54±1.67 1) 卵白蛋白 2 min 内死亡 ± ) 43.65±0.89 1) 中国现代应用药学 2012 年 9 月第 29 卷第 9 期 Chin JMAP, 2012 September, Vol.29 No.9 769

4 表 2 血塞通注射液致过敏样反应及其生化指标含量 Tab 2 Anaphylactoid reaction and biological index conten of Xuesaitong injection 实验组给药量行为变化 IgE 含量 /μg ml 组胺含量 /μg L 生理盐水组 1.0 ml 无行为异常 ± ±0.16 血塞通 1.6 ml(8 倍量 ) 无行为异常 ± ) 43.66±4.21 1) Compound 48/80 2 mg 只 2 min 内死亡 ± ) 49.32±7.12 1) 表 3 血塞通注射液致敏后小鼠血清 IgE 变化情况 Tab 3 The IgE change in plasma of mice sensitizated by Xuesaitong injections 实验组给药量血清 IgE 含量 /μg ml 血清组胺 /μg L 生理盐水组 0.1 ml ± ±0.03 卵白蛋白组 ± ) 2.63±0.11 2) 血塞通 0.02 ml(1 倍量 ) ± ) 2.17±0.05 血塞通 0.04 ml(2 倍量 ) ±6.34 1) 2.25±0.09 注 : 与空白组比较, 1) P<0.05, 2) P<0.01 Note: Compared with blank group, 1) P<0.05, 2) P<0.01 表 4 血塞通射液全身主动攻击试验小鼠血清 IgE 及组胺含量变化情况 Tab 4 The IgE and histamine change in mice s plasma in ASA 实验组给药量血清 IgE 含量 /μg ml 血清组胺 /μg L 生理盐水组 0.1 ml ± ±0.03 卵白蛋白组 ± ) 2.75±0.11 1) 血塞通 0.02 ml(1 倍量 ) ±9.15 1) 2.22±0.15 血塞通 0.04 ml(2 倍量 ) ± ) 2.19±0.10 表 5 Tab 5 血塞通注射液引起过敏样反应 Anaphylactoid reaction and content of IgE and histamine induced by Xuesaitong injection 实验组给药量行为变化组胺含量 /μg L IgE 含量 /μg ml 生理盐水组 0.5 ml 无行为异常 2.27± ±25.9 血塞通 0.1 ml(5 倍量 ) 3 只出现挠鼻现象并伴有发抖, 2.52±0.12 1) 356.1± 只出现步态不稳现象血塞通 0.2 ml(10 倍量 ) 3 只出现挠鼻现象 2.49±0.07 1) 336.5±24.2 血塞通 0.3 ml(15 倍量 ) 5 min 内全部死亡 2.52±0.09 1) 367.0±28.8 1) 血塞通 0.5 ml(25 倍量 ) 5 min 内全部死亡 2.68±0.11 1) 386.5±23.4 1) Compound 48/80 1 mg 只 1 min 内全部死亡 2.82±0.08 1) 360.8±16.9 1) 表 6 不同给药组致肥大细胞脱颗粒率 Tab 6 Degranulation rates of mast cells in different administration groups 实验组脱颗粒率 /% 实验组脱颗粒率 /% 正常肥大细胞 3 Compound 48/80 体内给药组 92 卵白蛋白激发组 96 Compound 48/80 体外给药组 100 血塞通体内致敏组 6 血塞通体外给药组 53 血塞通体内激发组 63 血塞通体内大剂量单次给药组 Chin JMAP, 2012 September, Vol.29 No.9 中国现代应用药学 2012 年 9 月第 29 卷第 9 期

5 图 1 各给药组肥大细胞脱颗粒后形态 A 血塞通致敏 12 天后激发组 (10 倍 );B 肥大细胞与 Compound 48/80 共孵育 (40 倍 );C 大剂量给药后肥大细胞形态 (40 倍 );D 肥大细胞与血塞通注射剂共孵育 (10 倍 ); 箭头所指为肥大细胞脱颗粒 Fig 1 Mast cell of different medication administration teams A stimulated group sensitirated by Xuesaitong infections after 12 d (10 multiples); B the mast cells incubated with compound 48/80 (40 multiples); C the morphology of mast cells after overdose administration (40 multiples); D the mast cells incubated with Xuesaitong infections(10 multiples) 根据血塞通注射液不良反应的临床表现及上述体内体外药物药理作用关系, 其引起的急性过敏反应包括 Ⅰ 型过敏反应及过敏样反应豚鼠及小鼠对由血塞通注射液引起的 IgE, 组胺等指标变化均较敏感, 可以通过其含量的变化对药物引起急性过敏反应的能力进行评价但实验结果显示当组胺与 IgE 含量较高时也并不一定会引起急性过敏行为的发生, 因此个体差异也是要考虑的主要因素之一而当注射液剂量增加, 其过敏性增强, 这提示在临床应用过程中应控制注射速度, 避免造成局部浓度过高血塞通注射液引起的急性过敏反应为 Ⅰ 型过敏反应与过敏样反应的混合反应虽然两者发生机制不同, 但均能引起肥大细胞脱颗粒释放组胺目前, 有关注射剂引起过敏反应原因及评价方法尚未明确因此, 在后续的相关研究过程中可以采用肥大细胞中组胺释放情况作为指标对药物引起急性过敏反应进行判断, 从而可以直接对药物引起过敏的能力进行评价 REFERENCES [1] HAN F, ZHOU Q A, ZHAN M. Safety analysis of traditional Chinese medicine injection [J]. Prog Vet Med( 动物医学进展 ), 2007, 28(10): 104. [2] LU M, LI T. ADR induced by Xuesaitong injection in our hospital: retrospective analysis of 16 cases [J]. J China Pharm( 中国药房 ), 2007, 18(14): [3] MA G X, SHI X H. One case of shock induced by i.v. Xuesaitong injection [J]. J Baotou Med( 包头医学 ), 2005, 29(3): [4] CHEN H, MA J F, WANG X D. One case of anaphylaxis induced by Xuesaitong injection [J]. Prac Geriatr( 实用老年医学 ), 2002, 16(4): 208. [5] PENG L Y, TAN Z S, LIAO Y P. Evaluation of 83 adverse drug reaction cases induced by Xuesaitong injection [J]. Guangxi Med J( 广西医学 ), 2007, 29(3): [6] WANG Z, YU S S. Evaluation of 129 adverse drug reaction cases induced by Xuesaitong injection [J]. Clin J Med Off( 临床军医杂志 ), 2009, 37(2): 292. [7] SUN G F, SUN Z. Evaluation of 16 adverse drug reaction cases induced by Xuesaitong injection [J]. Cap Med ( 首都医药 ), 2009, 16(20): 42. [8] WANG J Y. Evaluation of 13 adverse drug reaction cases induced by Xuesaitong injection [J]. Lishizhen Med Mater Med Res( 时珍国医国药 ), 2006, 17(7): [9] ZHENG L Y, GU X C. One case of bronchial asthma static caused by i.d. Xuesaitiong lyophilized powder injection [J]. Chin Pharm Aff( 中国药事 ), 2008, 22(5): 439. [10] WANG Y, WANG M. Adversed drug reaction induced by Xuesaitong injection [J]. Chin J Pharm( 中国药物警戒 ), 2007, 4(4): [11] XU D Y, HUANG H B. ADR analysis of Sanqi and its preparation [J]. China J Chin Mater Med( 中国中药杂志 ), 2005, 30(18): [12] SUN D R, QI P. Adverse Drug Reaction( 药物不良反应 ) [M]. Beijing: People s Medical Publishing House, 2003: 86. 收稿日期 : 中国现代应用药学 2012 年 9 月第 29 卷第 9 期 Chin JMAP, 2012 September, Vol.29 No.9 771

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课程类别美声演唱方向培养方案一培养目标本方向要求学生德智体美全面发展, 培养能在文艺团体从事声乐演唱及能在艺术院校从事本方向教学的高级门人才二培养规格本方向学生应系统掌握声乐演唱方面的理论和技能, 具备较高的声乐演唱