Microsoft PowerPoint - X ray crystallography 2015_revised [兼容模式]

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1 X 射 线 晶 体 衍 射 分 析 (X-ray Crystallography, X-ray Diffraction Methods) 殷 雷 梁 毅 ( 武 汉 大 学 生 命 科 学 学 院 )

2 生 物 大 分 子 晶 体 结 构 分 析 步 骤 第 一 步 克 隆 表 达 和 纯 化 : 解 析 蛋 白 质 晶 体 结 构 的 前 提 是 制 备 均 一 的 蛋 白 质 样 品 并 获 得 晶 体 因 此 获 得 表 达 量 高 纯 化 效 果 好 的 蛋 白 质 对 后 续 步 骤, 特 别 是 结 晶 起 到 及 其 重 要 的 作 用 第 二 步 结 晶 : 在 大 多 数 情 况 下, 蛋 白 质 结 晶 是 工 作 的 瓶 颈, 需 要 通 过 大 量 的 条 件 筛 选 和 优 化 以 使 蛋 白 质 分 子 间 的 弱 相 互 作 用 促 使 蛋 白 质 分 子 形 成 高 度 有 序 的 晶 体 而 不 是 随 机 聚 合 形 成 沉 淀

3 尽 管 已 有 相 当 数 量 的 论 文 和 专 著 在 研 究 这 个 问 题, 但 采 用 一 定 的 标 准 方 案 并 不 能 保 证 长 出 所 需 的 单 晶 蛋 白 质 晶 体 作 为 一 种 有 序 的 分 子 聚 集, 受 到 诸 如 ph 温 度 沉 淀 剂 缓 冲 液 类 型 添 加 剂 及 本 身 分 子 结 构 等 众 多 因 素 的 影 响 在 一 定 程 度 上, 蛋 白 质 结 晶 仍 是 一 门 艺 术

4 Growing crystals: more an than a science Crystal formation is critically dependent on a number of different parameters; Crystal growth can be slow; The concentration, purity and homogeneity of a protein sample is crucial; The proteins are large, spherical, or ellipsoidal objects with irregular surfaces; The proteins are in contact with each other at only a few small regions. The channels are filled with disordered solvent molecules. Glycolate Oxidase

5 第 三 步 数 据 收 集 及 处 理 : 通 常 利 用 ( 单 波 长 ) X 射 线 光 束 照 射 在 一 定 角 度 范 围 内 旋 转 的 蛋 白 质 晶 体, 同 时 记 录 晶 体 对 X 光 散 射 的 强 度 这 些 强 度 可 转 换 为 结 构 测 定 中 的 结 构 因 子 的 振 幅 ( F(hkl) ) ( 此 外, 在 Laue 法 中, 晶 体 通 常 保 持 静 止 而 使 用 连 续 X 光 波 长 ( 白 光 ) 收 集 数 据

6 第 四 步 相 角 的 测 定 : 结 构 因 子 的 振 幅 ( F(hkl) ) ( 及 相 角 ( (hkl)) 是 物 理 上 相 对 独 立 的 量 由 于 结 构 因 子 相 角 的 全 部 信 息 在 收 集 数 据 时 丢 失, 因 此 必 须 通 过 其 它 途 径 来 得 到 它 们 的 信 息 第 五 步 相 角 的 改 进 ( 优 化 ): 电 子 密 度 图 的 质 量 及 其 后 的 可 解 释 性 主 要 决 定 于 相 角 的 准 确 性 有 的 情 况 下 采 用 晶 胞 中 不 对 称 单 位 中 的 等 同 部 分 ( 例 如, 一 个 以 上 的 等 同 分 子 ) 的 电 子 密 度 平 均, 有 可 能 大 大 地 改 善 误 差 较 大 的 起 始 相 角

7 第 六 步 电 子 密 度 图 的 解 释 : 相 位 确 定 后, 可 开 始 计 算 电 子 密 度 图 若 从 电 子 密 度 图 能 跟 踪 出 肽 链 走 向 和 分 辨 出 二 级 结 构 ( 如 基 于 高 分 辨 率 的 数 据, 通 常 这 意 味 着 衍 射 数 据 的 分 辨 率 至 少 达 到 35Å), 3.5 则 可 能 推 出 多 肽 链 的 三 维 折 叠 方 式 进 而 根 据 氨 基 酸 序 列, 就 可 能 构 建 出 原 子 坐 标 形 式 的 蛋 白 质 结 构 模 型

8 第 七 步 修 正 : 考 虑 到 已 建 立 的 立 体 化 学 资 料 ( 如 键 长, 键 角 等 ) 的 限 制, 根 据 X 射 线 衍 射 数 据 对 初 始 的 蛋 白 质 分 子 模 型 进 行 修 正 第 八 步 : 结 构 的 描 述 和 与 功 能 关 系 的 研 究

9 结 晶 方 法 和 技 术 汽 相 扩 散 法 (Vapour diffusion): 微 量 蒸 气 扩 散 法 主 要 是 通 过 在 一 个 封 闭 体 系 内, 在 能 使 某 种 蛋 白 质 结 晶 的 较 高 沉 淀 剂 浓 度 的 溶 液 与 含 有 较 低 沉 淀 剂 浓 度 的 蛋 白 质 溶 液 之 间 发 生 蒸 汽 扩 散, 最 后 两 者 达 到 平 衡, 蛋 白 质 溶 液 内 沉 淀 剂 浓 度 逐 渐 增 加 使 得 蛋 白 质 的 溶 解 性 降 低, 达 到 过 饱 和 析 出 而 结 晶 这 种 方 法 现 在 使 用 最 为 广 泛, 可 以 分 为 悬 滴 法, 坐 滴 法 和 三 明 治 法

10 三 明 治 法 坐 滴 法 悬 滴 法

11 晶 体 的 结 构 特 点 晶 体 是 原 子 或 分 子 在 三 维 空 间 中 周 期 性 重 复 排 列 形 成 的 结 构 点 阵 结 构 : 任 何 能 为 平 移 复 原 的 结 构 称 点 阵 结 构 能 使 一 点 阵 结 构 复 原 的 全 部 平 移 形 成 一 个 平 移 群 ua + vb + wc, 称 为 该 结 构 的 平 移 群 u,v,w, 为 整 数,a,b,c 为 三 个 非 共 面 的 向 量 点 阵 结 构 与 其 相 应 的 平 移 群 必 存 在 下 列 关 系 :(1) 从 点 阵 结 构 中 某 一 点 指 向 点 阵 结 构 中 的 每 一 点 的 向 量 都 在 平 移 群 中 (2) 以 点 阵 结 构 中 任 一 点 为 起 点 时, 平 移 群 中 每 一 个 向 量 都 指 向 结 构 中 一 个 点 点 阵 结 构 是 很 有 规 律 的 结 构, 除 了 上 述 的 平 移 群 能 使 它 复 原 外, 还 存 在 另 外 一 些 能 使 其 复 原 的 对 称 元 素, 如 对 称 中 心 ( 倒 反 ), 镜 面, 旋 转 轴, 旋 转 反 轴, 空 间 点 阵 结 构 中 只 能 容 纳 有 限 的 几 种 旋 转 轴, 即 二 重 轴 三 重 轴 四 重 轴 及 六 重 轴, 所 以 其 最 基 本 的 对 称 元 素 只 有 七 种

12 晶 胞 : 从 一 个 空 间 点 阵 结 构 中 一 定 可 以 划 出 一 个 平 行 六 面 体, 这 一 平 行 六 面 体 称 晶 胞, 每 一 晶 胞 可 用 a,b,,, c,α,β,γ 六 个 参 数 来 描 述, 这 六 个 参 数 称 晶 胞 参 数 根 据 晶 胞 形 状, 也 就 是 六 个 晶 胞 参 数, 以 及 晶 胞 中 所 容 纳 的 特 征 对 称 元 素, 可 以 把 不 同 的 晶 胞 分 成 七 个 类 型, 即 七 个 晶 系 : 立 方, 六 方, 四 方, 三 方, 正 交, 单 斜 和 三 斜

13 晶 系 特 征 对 称 元 素 晶 胞 参 数 对 称 元 素 方 向 立 方 4 个 按 立 方 体 的 对 角 线 a=b=c a a+b+c a+b 取 向 的 三 重 轴 六 方 六 重 轴 ( 平 行 于 C 轴 ) 或 六 重 反 轴 α=β=γ=90 a=b c α=β=90 90 γ=120 c a 2a+b 四 方 四 重 轴 ( 平 行 于 C 轴 ) a=b c c a a+b 或 四 重 反 轴 三 方 三 重 轴 ( 平 行 于 C 轴, 按 六 方 取 ) 或 三 重 反 轴 α=β=γ=90 a=b c α=β=90 γ=120 c a - 正 交 二 个 互 相 垂 直 的 对 称 a b c a b c 面 或 三 个 互 相 垂 直 的 α=β=γ=90 二 重 轴 单 斜 一 个 二 重 轴 或 对 称 面 a b c b - - α=γ=90 三 斜 无 或 仅 有 一 个 对 称 中 心 a b c α β γ 900

14 Bravais lattices 有 时 为 了 获 得 较 高 的 对 称 性, 把 原 有 晶 胞 扩 大, 使 成 为 带 心 14 unique crystal lattices 的 晶 胞, 由 此 在 七 个 晶 系 中 可 以 得 到 14 种 不 同 的 布 拉 菲 格 子 (Bravais lattices), 不 带 心 的 晶 胞 称 为 素 晶 胞 (P), 带 心 的 称 为 复 晶 胞 (I,F,C) The morphology of a crystal is defined by the size and shape of a single unit cell Each space group specifies the lattice type and the symmetry of the unit cell.

15 晶 胞 参 数 的 特 征 是 各 个 晶 系 的 宏 观 表 现, 是 区 分 七 个 不 同 晶 系 的 必 要 条 件 但 不 是 充 分 的 条 件, 只 有 特 征 对 称 元 素 是 区 分 晶 系 的 关 键 所 在 两 个 对 称 元 素 的 结 合 就 会 产 生 新 的 对 称 元 素, 在 七 个 晶 系 中 把 特 征 对 称 元 素 与 基 本 对 称 元 素 进 行 组 合, 就 会 产 生 32 种 不 同 的 对 称 元 素 组 合, 这 就 是 32 个 点 群

16 把 所 有 类 型 的 对 称 元 素 与 32 个 点 群 14 个 布 拉 菲 格 子, 按 照 一 定 规 则 的 组 合 就 可 得 到 230 种 空 间 群 (Space Groups) 由 于 蛋 白 质 晶 体 的 对 称 元 素 只 有 对 称 轴 ( 旋 转 轴 和 旋 转 反 轴 ), 没 有 镜 面 及 对 称 中 心 ( 倒 反 ), 因 此 蛋 白 质 晶 体 只 有 65 种 空 间 群 Space Groups 65 possible space groups in macromolecular crystals

17 X 射 线 晶 体 衍 射 分 析 的 基 本 原 理 The Nobel Prize in Physics 1915 "for their services in the analysis of crystal structure by means of X-rays" Sir William Henry Bragg William Lawrence Bragg 1/2 of the prize 1/2 of the prize United Kingdom London University London, United Kingdom b d United Kingdom Victoria University Manchester, United Kingdom b (in Adelaide, Australia) d. 1971

18 Diffraction of X-rays by a crystal Bragg s law: 2d sin = n 发 生 衍 射 的 X 射 线 束 可 视 为 被 晶 格 面 反 射 形 成 晶 格 面 间 距 离 d 及 入 射 角 的 关 系 式 为 :2d sin = n ( 布 拉 格 定 律 ) 晶 体 的 质 量 有 赖 于 晶 胞 中 分 子 的 有 序 性 由 于 原 子 的 热 运 动 及 统 计 无 序 性, 原 子 位 置 不 是 严 格 固 定 的 通 常 在 高 衍 射 角 处,X 射 线 的 反 射 强 度 会 下 降 当 衍 射 图 案 的 最 高 分 辨 率 相 当 于 5 Å 晶 格 间 距 时, 分 辨 率 较 低, 当 为 2.0~2.5 2 Å 时 分 辨 率 一 般, 当 为 Å 分 辨 率 很 高

19 X 射 线 衍 射 结 构 分 析 主 要 基 于 两 方 面 原 理 : 第 一 是 衍 射 线 的 方 向, 即 衍 射 图 上 斑 点 的 位 置, 用 它 可 以 确 定 晶 胞 的 大 小 和 形 状 衍 射 线 的 方 向 与 晶 胞 大 小 的 关 系 用 劳 厄 (Laue) 方 程 和 布 拉 格 (Bragg) 定 律 描 述, 亦 可 用 反 射 球 来 示 意 第 二 是 衍 射 线 的 强 度, 即 衍 射 图 上 斑 点 的 亮 度 或 黑 度, 用 它 可 以 确 定 晶 胞 中 原 子 的 空 间 排 布

20 X 射 线 衍 射 数 据 收 集 晶 体 结 构 测 定 所 依 赖 的 是 物 理 学 上 最 基 本 的 衍 射 现 象, 一 套 好 的 衍 射 数 据 是 晶 体 结 构 分 析 的 基 础 目 前, 用 于 X 射 线 衍 射 实 验 的 相 关 仪 器 发 生 了 巨 大 的 革 命, 使 得 收 集 高 质 量 的 X 射 线 衍 射 实 验 数 据 得 以 实 现, 进 一 步 解 析 高 分 辨 率 的 三 维 结 构 成 为 可 能 X 射 线 光 源 用 于 产 生 高 强 度 的 X 射 线 目 前 使 用 较 多 的 是 旋 转 阳 极 Cu 靶, 产 生 波 长 为 Å 的 X 射 线 但 是 快 速 发 展 的 第 三 代 同 步 辐 射 光 源, 如 法 国 的 ESRF (6GeV), 美 国 的 APS (7GeV), 日 本 的 Spring-8 (8GeV) 和 中 国 上 海 的 SSRF (3.5GeV) 等 改 变 了 蛋 白 质 晶 体 学 的 面 貌

21 首 先 同 步 辐 射 光 源 强 度 高, 往 往 要 比 普 通 的 X 射 线 光 源 高 两 个 数 量 级 以 上, 其 次, 同 步 辐 射 光 源 准 直 性 好, 使 得 晶 体 衍 射 点 相 对 收 敛, 使 得 收 集 高 质 量 的 衍 射 数 据 成 为 可 能 同 步 辐 射 光 源 的 应 用 大 大 降 低 了 对 晶 体 线 度 大 小 的 要 求, 如 一 些 很 难 得 到 大 晶 体 的 膜 蛋 白 ( 往 往 是 几 十 微 米 的 线 度 ) 可 以 进 行 X 射 线 衍 射 数 据 的 收 集 和 结 构 测 定 ; 此 外 一 些 晶 胞 线 度 达 到 1000Å 以 上 的 庞 大 复 合 物 体 系 的 晶 体, 如 免 疫 复 合 物, 病 毒 以 及 核 糖 体 晶 体 等, 获 得 很 大 的 机 遇

22 A rotating anode x-ray generator is the conventional equipment used in most crystallography laboratories, where a metal plate is bombarded with accelerating electrons and emit x-rays of a specific wave-length. In synchrotron storage rings, electrons travel close to the speed of light and emit very strong radiation at all wavelengths. The ESRF (European Synchrotron Radiation Facility), Grenoble

23 这 些 晶 体 在 普 通 的 X 射 线 光 源 下 衍 射 往 往 不 好, 但 是 在 同 步 辐 射 光 源 上 可 能 收 集 到 高 质 量 的 衍 射 数 据, 进 而 使 结 构 测 定 成 为 可 能 同 步 辐 射 光 源 的 第 三 个 优 点 就 是 波 长 连 续 可 调, 这 是 同 步 辐 射 X 射 线 源 有 别 于 普 通 X 射 线 源 的 重 要 特 点, 这 使 得 利 用 硒 原 子 反 常 散 射 效 应 的 多 波 长 反 常 散 射 法 测 定 相 角 成 为 可 能, 加 快 了 蛋 白 质 三 维 结 构 解 析 的 速 度

24 低 温 液 氮 气 流 冷 却 技 术 取 得 很 大 的 发 展, 自 20 世 纪 90 年 代 以 后, 它 逐 渐 用 于 X 射 线 蛋 白 质 晶 体 学 的 研 究 中, 用 于 解 决 高 强 度 X 射 线 对 蛋 白 质 晶 体 的 辐 射 损 伤 问 题, 延 长 晶 体 的 寿 命 这 个 技 术 的 广 泛 使 用 大 大 有 利 于 蛋 白 质 晶 体 的 储 存 和 运 输, 促 进 了 完 整 的 X 射 线 衍 射 数 据 的 收 集 采 用 低 温 冷 冻 技 术 需 要 添 加 防 冻 剂 以 保 护 晶 体 免 受 冻 伤, 并 避 免 产 生 冰 环, 首 先 要 尽 可 能 去 干 净 长 晶 体 的 母 液, 同 时 摸 索 最 适 宜 的 防 冻 剂 条 件 以 及 最 优 的 操 作 方 法 在 适 宜 的 防 冻 剂 下, 一 颗 好 晶 体 在 液 氮 低 温 气 流 下 就 已 经 足 够 收 集 一 套 或 多 套 完 整 的 X 射 线 衍 射 数 据

25 Cryocooling efficiently protects the crystals Crystals are rapidly cooled (NOT FROZEN) to near liquid nitrogen temperature; Reduced thermal vibrations; Reduced disorder; Increased resolution; Reduced radiation damage;

26 X 射 线 衍 射 数 据 处 理 整 个 晶 体 衍 射 数 据 收 集 和 处 理 流 程 图

27 在 实 际 中, 每 曝 光 一 次 只 能 收 集 晶 体 一 个 方 向 的 衍 射 信 息, 而 通 过 连 续 变 换 晶 体 的 取 向, 可 以 收 集 到 完 整 的 晶 体 空 间 衍 射 信 息, 这 些 衍 射 点 信 息 需 要 进 一 步 指 标 化 和 积 分 处 理 目 前 已 经 开 发 出 成 熟 的 数 据 处 理 程 序, 如 Denzo 和 Scalepack 程 序 Denzo 程 序 用 于 对 衍 射 点 进 行 自 动 指 标 化, 以 求 出 每 个 衍 射 点 的 (h,k,l) 指 标 作 为 生 物 大 分 子 的 晶 体, 共 有 14 种 可 能 布 拉 菲 格 子 类 型 以 及 11 种 可 能 的 衍 射 点 群

28 通 过 Denzo 程 序 对 衍 射 点 分 布 信 息 的 处 理 可 以 分 析 出 晶 体 内 蛋 白 质 分 子 堆 积 的 信 息, 即 初 步 的 晶 体 学 参 数, 包 括 晶 胞 大 小 和 布 拉 菲 格 子 类 型 等 在 对 每 个 衍 射 点 的 (h, k,l) 进 行 指 标 化 和 积 分 后, 以 进 一 步 用 Scalepack 程 序 并 选 择 合 适 的 空 间 群 对 这 些 衍 射 点 的 强 度 进 行 归 并 Scalepack 程 序 处 理 结 果 中 的 完 整 度 (Completeness), 冗 余 度 (Redundancy) 以 及 衍 射 强 度 R 因 子 (R merge ) 等 参 数 可 以 初 步 判 断 该 套 数 据 的 质 量 对 于 一 套 完 整 的 数 据, 往 往 要 求 完 整 度 大 于 80%, 而 且 缺 失 数 据 在 倒 易 空 间 中 应 随 机 分 布 ; 冗 余 度 达 到 2~3 以 上, 衍 射 强 度 R 因 子 最 好 处 于 3%( 良 好 的 衍 射 数 据 )~ 11%( 较 弱 的 衍 射 数 据 ) 之 间

29 相 位 问 题 所 谓 一 个 分 子 结 构, 就 是 根 据 蛋 白 质 电 子 云 密 度 图 构 建 的 一 个 分 子 模 型 X 射 线 被 晶 胞 内 的 原 子 散 射 到 特 定 的 方 向 (hkl), 其 散 射 波 可 用 结 构 因 子 来 表 示 ( 包 括 振 幅 和 相 位 / 相 角 ) 而 电 子 密 度 可 以 表 达 为 结 构 因 子 的 傅 立 叶 变 换 其 中,(x,y,z) 为 晶 胞 中 某 一 点 的 坐 标,V 为 晶 胞 体 积,(h,k,l) 为 衍 射 指 标, F(hkl) 和 (hkl) 分 别 是 指 标 为 (h,k,l) 的 衍 射 的 结 构 振 幅 和 相 角 显 然, 结 构 因 子 的 两 个 部 分 - 振 幅 和 相 角 对 计 算 电 子 密 度 来 说 都 是 必 需 的

30 在 衍 射 实 验 中, 每 一 衍 射 点 的 实 验 强 度 信 息 可 以 记 录, 结 构 振 幅 可 以 从 衍 射 强 度 I hkl中 得 到, 二 者 存 在 以 下 关 系 : I hkl I 0 /ω K L P 但 关 于 相 角 的 信 息 都 在 数 据 收 集 中 丢 失 了 因 此 确 定 相 位 就 成 了 X- 射 线 晶 体 结 构 分 析 的 中 心 问 题 A e F hkl T 2 V

31 确 定 相 位 的 主 要 方 法 目 前, 在 蛋 白 质 晶 体 学 中 确 定 相 位 主 要 有 3 种 实 验 方 法, 即 多 对 同 晶 置 换 法 (Multiple Isomorphous Replacement, MIR ) 多 波 长 反 常 散 射 法 (Multiwavelength Anomalous Dispersion, MAD) 和 分 子 置 换 法 (Molecular Replacement, MR) 此 外 还 有 单 对 同 晶 置 换 法 (Single Isomorphous Replacement, SIR ) 单 波 长 反 常 散 射 法 (Single-wavelength Anomalous Dispersion, SAD) ) 等 方 法

32 多 对 同 晶 置 换 法 (MIR) 多 对 同 晶 置 换 法 ( 包 括 单 对 同 晶 置 换 加 反 常 散 射 法 ) 是 蛋 白 质 晶 体 学 领 域 用 于 相 位 确 定 的 经 典 方 法 同 晶 置 换 法 的 基 本 思 想 是 把 散 射 能 力 强 的 重 金 属 原 子, 如 Hg, Pb 等, 引 进 到 蛋 白 质 晶 体 中 作 为 标 志 原 子, 然 后 设 法 解 出 这 些 数 量 较 少 的 重 原 子 在 晶 胞 中 的 坐 标, 由 这 些 坐 标 计 算 出 重 原 子 散 射 波 在 各 衍 射 点 的 相 角, 再 推 引 出 蛋 白 质 分 子 在 各 衍 射 中 的 相 位

33 运 用 MIR 方 法 确 定 相 位, 首 先 要 得 到 与 母 体 同 晶 型 ( 空 间 群 相 同, 晶 胞 参 数 基 本 相 同 ) 的 衍 生 物 晶 体, 得 到 衍 生 物 晶 体 最 常 用 的 方 法 是 将 母 体 晶 体 浸 泡 在 含 有 重 原 子 化 合 物 的 合 适 溶 液 体 系 中, 使 得 重 原 子 能 够 在 整 个 晶 体 范 围 内 有 序 地 结 合 到 蛋 白 质 分 子 上 要 求 母 体 和 衍 生 物 的 晶 体 同 晶 型, 这 表 明 重 原 子 结 合 到 蛋 白 质 分 子 上 后 没 有 引 起 蛋 白 质 结 构 的 较 大 变 化 这 样, 母 体 晶 体 和 衍 生 物 晶 体 之 间 的 衍 射 强 度 差 别 就 可 以 确 定 是 由 于 所 结 合 的 重 原 子 引 起 的 然 后 以 母 体 晶 体 和 重 原 子 衍 生 物 晶 体 的 衍 射 强 度 差 计 算 同 晶 差 值 Patterson 函 数

34 Patterson 图 上 主 要 的 峰 就 对 应 于 晶 体 衍 生 物 中 重 原 子 之 间 的 向 量 通 过 检 查 Patterson 峰, 就 可 以 确 定 重 原 子 的 位 置, 进 而 就 可 以 推 引 出 母 体 的 相 位 F PH = F P + F H F PH - F P = F H FH 在 得 到 重 原 子 位 置 后, 就 得 到 了 H, 也 就 可 以 计 算 出 来 而 振 幅 的 绝 对 值 F PH 和 F P 可 由 实 验 测 得 的 衍 生 物 晶 体 和 母 体 晶 体 的 衍 射 强 度 得 到, 母 体 晶 体 的 相 位 / 相 角 P 就 可 由 方 程 推 导 出 cos F F F / 2 F F P H PH P H P H

35 等 式 中 余 弦 项 表 明 如 果 只 用 一 个 衍 生 物 晶 体, P 有 两 个 可 能 解 为 解 决 相 位 的 不 确 定 性, 就 必 须 采 用 至 少 两 个 在 晶 胞 中 结 合 位 置 不 同 的 重 原 子 衍 生 物 与 母 体 配 合 这 样 至 少 可 得 出 两 套 可 能 的 相 位, 其 共 同 解 就 是 正 确 的 相 角 同 晶 置 换 法 结 构 因 子 图

36 还 有 一 种 方 法 可 以 消 除 双 解, 就 是 利 用 重 原 子 的 反 常 散 射 效 应 对 大 多 数 轻 原 子 (C, H, O, N) 来 说, 反 常 散 射 效 应 不 显 著, 当 加 入 重 原 子 后,Friedel 定 律 就 不 适 用 了 此 时,F PH (+) 和 F PH (-) 不 相 等, 可 以 将 F PH (+) 和 F PH (-) 看 作 两 个 衍 生 物 的 结 构 振 幅, 相 当 于 有 两 个 重 原 子 衍 生 物, 可 以 按 照 多 对 同 晶 的 方 法 得 到 正 确 的 相 角, 这 就 是 单 对 同 晶 置 换 加 反 常 散 射 法

37 多 波 长 反 常 散 射 法 (MAD) 分 子 置 换 法 (MR)

38 结 构 修 正 结 构 修 正 实 质 上 就 是 使 模 型 向 实 际 结 构 不 断 接 近 的 过 程, 既 可 以 在 实 空 间 中 对 电 子 密 度 图 进 行 直 接 的 修 正, 如 O 程 序 ; 也 可 以 在 倒 易 空 间 中 对 能 量 函 数 进 行 最 小 二 乘 法 极 小 化 的 间 接 修 正, 如 CNS 程 序 倒 易 空 间 修 正 方 法 主 要 是 先 将 衍 射 数 据 拟 合 为 目 标 函 数, 然 后 对 目 标 函 数 进 行 极 小 化 修 正 实 际 中 主 要 是 调 整 模 型 的 参 数, 即 每 个 非 氢 原 子 的 原 子 坐 标 (X,Y,Z) 以 及 一 个 各 向 同 性 温 度 因 子 (B), 使 得 蛋 白 质 晶 体 的 结 构 振 幅 的 计 算 值 Fc 越 来 越 接 近 与 观 测 值 Fo

39 结 构 修 正 中 最 常 见 的 方 法 是 最 小 二 乘 法 在 蛋 白 质 晶 体 学 研 究 中, 由 于 蛋 白 质 的 原 子 个 数 多, 衍 射 分 辨 率 低, 因 此 衍 射 点 数 目 与 修 正 参 数 之 比 较 小, 因 而 不 能 象 小 分 子 晶 体 修 正 那 样 采 用 一 般 的 最 小 二 乘 法 进 行 修 正 1985 年,Hendrickson 等 人 提 出 了 约 束 参 数 的 最 小 二 乘 法 该 方 法 在 修 正 过 程 中 加 入 一 些 来 自 小 分 子 结 构 研 究 得 来 的 立 体 化 学 制 约 因 素, 如 键 长, 键 角, 平 面 性 以 及 手 性 等 制 约 因 素

40 立 体 化 学 制 约 有 两 种 不 同 的 方 式 : Constrained 修 正 : 肽 平 面 的 原 子 是 刚 性 的, 只 有 肽 平 面 间 的 二 面 角 可 以 变 动 这 种 处 理 有 效 地 减 少 需 要 修 正 参 数 的 数 量, 但 对 于 肽 平 面 中 原 子 进 行 局 部 调 整 显 得 很 困 难 Restrained 修 正 : 允 许 立 体 化 学 参 数 在 一 个 固 定 范 围 内 变 动, 通 过 对 其 能 量 函 数 的 计 算 来 控 制 修 正 过 程 这 种 处 理 方 法 可 使 得 结 构 中 原 子 坐 标 可 在 限 定 的 键 长, 键 角, 扭 角 以 及 范 德 华 接 触 距 离 等 范 围 内 变 动, 也 就 是 说 这 是 一 个 局 部 的 微 调 过 程

41 在 修 正 过 程 中, 主 要 采 取 的 方 法 是 刚 体 修 正 法, 立 体 化 学 制 约 和 能 量 最 小 化 的 最 小 二 乘 法, 分 子 动 力 学 模 拟 或 者 称 模 拟 退 火 法 模 拟 退 火 是 一 种 最 近 的 优 化 技 术, 它 迅 速 地 获 得 了 普 及 在 需 极 小 化 的 函 数 中, 它 把 能 量 项 与 计 算 结 构 因 子 振 幅 和 观 察 结 构 因 子 振 幅 的 差 结 合 它 的 优 点 是 大 的 收 敛 半 径

42 Quality of Electron-density Maps the RESOLUTION 6.0 Å 4.5 Å 3.0 Å

43 X 射 线 自 由 电 子 激 光 (X-ray Free Electron Laser,XFEL, 第 四 代 同 步 辐 射 光 源 ) XFEL 是 直 线 加 速 器 中 的 电 子 束 加 速 至 接 近 光 速, 成 为 相 对 论 电 子, 在 波 荡 器 作 用 下 产 生 正 弦 运 动 路 径, 在 运 动 轨 迹 切 线 方 向 产 生 同 步 辐 射 光, 同 步 辐 射 光 与 电 子 束 运 动 周 期 相 同, 于 是 得 到 相 干 叠 加 的 射 线

44 与 目 前 最 先 进 的 第 三 代 同 步 辐 射 光 源 相 比, 自 由 电 子 激 光 产 生 的 X 射 线 不 仅 具 有 激 光 的 特 点 ( 相 干 性 ), 而 且 波 长 更 短 脉 冲 宽 度 更 窄, 特 别 是 其 峰 值 亮 度 比 第 三 代 同 步 光 源 高 了 近 10 个 量 级, 平 均 亮 度 ( 例 如 EuropeanXFEL) 也 高 万 倍 以 上 提 供 从 未 接 近 过 的 研 究 领 域, 如 绘 制 病 毒 原 子 的 详 细 结 构 解 密 细 胞 分 子 的 构 成 拍 摄 纳 米 世 界 的 三 维 图 像 冻 结 化 学 反 应 的 过 程 等 等 其 应 用 范 围 将 涉 及 物 理 化 学 材 料 科 学 生 物 学 和 纳 米 技 术 等 广 泛 领 域, 将 为 人 类 认 识 微 观 世 界 打 开 全 新 视 野

45 飞 秒 X 射 线 晶 体 学 (femtosecond X-ray crystallography) 瑞 典 Uppsala 的 Janos Hajdu 利 用 分 子 动 力 学 模 拟 的 结 果 表 明, 溶 菌 酶 分 子 在 XFEL 的 高 强 度 脉 冲 下, 其 结 构 2fs 时 间 内 不 变, 超 过 10fs, 分 子 结 构 变 化 很 大, 提 出 了 diffraction-before-destruction 的 概 念

46 LCLS XFEL 美 国 2009 德 国 2006 年 前 后 就 开 放 了 DESY FLASH 软 线 ;2009 年 位 于 斯 坦 福 SLAC 国 家 加 速 器 实 验 室 的 LCLS 硬 线 开 放 了 ;2011 日 本 兵 库 县 境 内 的 RIKENS Pring-8 SACLA A XFEL 日 本 2011 Center 的 SACLA 硬 x 射 线 自 由 电 子 激 光 也 向 世 界 开 放 了, 随 后, 瑞 士 XFEL, 欧 洲 XFEL, 韩 国 浦 项 XFEL 纷 纷 开 工 建 设 并 在 未 来 几 年 陆 续 开 放 Flash XFEL 德 国 2006

47 一 些 经 典 的 蛋 白 质 晶 体 结 构

48 我 国 测 定 的 第 一 个 晶 体 结 构 测 定 : 胰 岛 素 晶 体 结 构

49 酶 与 抑 制 剂, 底 物 等 SARS 冠 状 病 毒 主 蛋 白 酶 Yang H, Yang M, Ding Y, Liu Y, Lou Z, Sun L, Zhou Z, Ye S, Pang H, Gao G, Anand K, Bartlam M, Hilgenfeld R & Rao Z* The Crystal Structures of SARS Virus Main Protease Mpro and Its Complex with an Inhibitor. Proc Natl Acad Sci USA., 100(23):

50 动 态 结 构 的 捕 捉 4 香 豆 酸 辅 酶 A 连 接 酶 Hu Y* Gai Y* Yin L * Wang X Feng C Feng L Li Hu, Y., Gai, Y., Yin, L., Wang, X., Feng, C., Feng, L., Li, D, Jiang, XN, Wang, DC. Crystal structures of a Populus tomentosa 4-coumarate:CoA ligase shed light on its enzymatic mechanisms. Plant Cell Sep;22(9):

51 膜 蛋 白 晶 体 结 构 捕 光 复 合 体 结 构 Liu Z., Yan H., Wang K., Kuang T., Zhang J., Gui L., An X., Chang, W. (2004) Crystal structure of spinach major light- harvesting complex at 2.72 A resolution. Nature 428,

52 呼 吸 链 II 复 合 物 Sun F Huo X Zhai YJ Wang AJ Xu JX Su D Bartlam M Sun F, Huo X, Zhai YJ, Wang AJ, Xu JX, Su D, Bartlam M & Rao Z* Crystal Structure of Mitochondrial Respiratory Membrane Protein Comples Ⅱ. Cell, 121:

53 多 蛋 白 复 合 物 CED-4/CED-9 复 合 物 结 构 Yan N, Chai J, Lee ES, Gu L, Liu Q, He J, Wu J-W, Kokel D, Li H, Hao Q, Xue.D, and Shi Y. Structure of the CED- 4/CED-9 complex reveals insights into programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Nature, 2005 Oct 6; 437(7060):831-7.

54 H5N1 禽 流 感 PA C PB1 N 复 合 物 结 构 Crystal structure of the polymerase PA C PB1 N complex from an avian influenza H5N1 virus Nature 454, , 2008

55 拟 南 芥 FLS2/BAK1/flg22 复 合 物 结 构 Sun Y Li L Macho AP Han Z Hu Z Zipfel C Zhou JM Chai J Sun Y, Li L, Macho AP, Han Z, Hu Z, Zipfel C, Zhou JM, Chai J Structural basis for flg22-induced activation of the Arabidopsis FLS2-BAK1 immune complex. Science.2013 Nov 1;342(6158):624-8

56 TCR/MHC/ 抗 原 多 肽 复 合 物 结 构 Yin L * Huseby E * Scott-Browne J Rubtsova K Pinilla C Crawford F Yin,L., Huseby, E., Scott-Browne,J., Rubtsova,K., Pinilla,C., Crawford,F., Marrack, P., Dai, S., Kappler,J. A Single T Cell Receptor Bound to Major Histocompatibility Complex Class I and Class II Glycoproteins Reveals Switchable TCR Conformers. Immunity Jul 22;35(1):23-33

57 现 代 生 物 学 仪 器 分 析 的 应 用 最 新 标 志 性 成 果 运 用 X 射 线 晶 体 衍 射 分 析 测 定 G 蛋 白 偶 联 受 体 的 结 构 G 蛋 白 偶 联 受 体 (GPCR) 广 泛 存 在 于 多 细 胞 生 物 的 细 胞 表 面, 并 在 细 胞 间 的 信 号 传 递 中 起 着 重 要 的 作 用 人 类 基 因 组 中 已 发 现 存 在 800 多 种 不 同 的 GPCR, 它 们 可 以 介 导 多 种 物 质 的 信 号 传 导, 如 激 素, 神 经 递 质, 气 味 分 子 等 许 多 药 物 筛 选 和 药 理 学 研 究 都 把 GPCR 作 为 药 物 作 用 的 靶 蛋 白 由 于 GPCR 的 结 构 由 七 个 跨 膜 的 螺 旋 组 成, 因 此 GPCR 又 被 称 为 七 次 跨 膜 受 体

58 美 国 科 学 家 Robert J. Lefkowitz 教 授 和 Brian K. Kobilka 教 授 由 于 揭 示 G 蛋 白 偶 联 受 体 的 结 构 与 功 能 方 面 的 贡 献, 而 共 同 获 得 2012 年 度 Nobel 化 学 奖

59 G 蛋 白 偶 联 受 体 (GPCR) 的 三 维 结 构 已 经 在 2007 年 解 出, 美 国 科 学 家 Bi Brian K. Kobilka 教 授 由 于 此 项 工 作 而 获 得 2012 年 度 Nobel 化 学 奖 Brian K. Kobilka et al. Crystal structure of the human 2 adrenergic G-protein-coupled receptor. Nature 450, (2007) Brian K. Kobilka et al. High-resolution crystal structure of an engineered human 2 -adrenergic G protein coupled ldreceptor. Science 318, (2007)

60 Figure 1. Stereoview of the overall fold of GPCR (gray)-t4 lysozyme (green). Carazolol is shown in blue; the lipid molecules bound to the receptor are in yellow

61 Fig. 2 Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor Nature 482, , 2012

62 Figure 3 Structural views (a) from within the membrane plane (left), extracellular side (top) and intracellular side (bottom) show the typical seven-pass transmembrane GPCR architecture. -FNA (green spheres, c) is a semisynthetic opioid antagonist derived from morphine (b). Nature 485, , 2012

63 核 酸 晶 体 的 X 射 线 衍 射 结 构 分 析 用 X 射 线 结 构 分 析 法 研 究 核 酸 的 三 维 结 构, 在 原 理 和 方 法 上 类 同 于 蛋 白 质 的 晶 体 分 析 早 在 1953 年,Watson 和 Crick 提 出 的 DNA 右 手 双 螺 旋 结 构 模 型, 就 是 根 据 对 DNA 纤 维 的 X 射 线 衍 射 图 谱 的 分 析 而 建 立 的 这 是 在 十 分 粘 稠 的 DNA 溶 液 中 加 入 乙 醇, 使 它 成 纤 维 沉 淀, 然 后 挑 出 纤 维 作 为 X 射 线 衍 射 分 析 的 样 品

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65 DNA 聚 合 酶 和 DNA 复 合 物 结 构 Eom, S.H., Wang, J., Steitz, T.A. (1996) Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site. Nature 382:

66 人 工 设 计 蛋 白 质 的 结 构 Science 1 June 2012: Vol. 336 no p DOI: /science