2019 年第 36 卷第 9 期年我国小反刍兽疫病毒 H 基因分子演化特征刘春菊 1, 盛琰翔 2, 王清华 1, 迟田英 1, 朱琳 1, 王英丽 1, 马洪超 1, 王志亮 1, 包静月 (1. 中国动物卫生与流行病学中心, 山东青岛 ; 2. 浙江农林大学

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1 2019 年第 36 卷第 9 期年我国小反刍兽疫病毒 H 基因分子演化特征刘春菊 1, 盛琰翔 2, 王清华 1, 迟田英 1, 朱琳 1, 王英丽 1, 马洪超 1, 王志亮 1, 包静月 (1. 中国动物卫生与流行病学中心, 山东青岛 ; 2. 浙江农林大学, 浙江临安 ) 摘要 : 为研究我国小反刍兽疫病毒 (PPRV) 的分子流行特点, 对年我国 37 株 PPRV 流行毒株进行血凝蛋白 (H) 基因序列测定和生物信息学分析结果显示 :37 个毒株 H 基因核苷酸序列之间的遗传距离为 0~ , 变异分布在 41 个位点,H 蛋白氨基酸序列之间的遗传距离为 0~ , 变异分布在 24 个位点与 15 株代表毒株进行序列比对发现, 年我国 37 株 PPRV 流行毒株 H 基因的 13 个位点发生了核苷酸序列突变, 其中 9 个导致了氨基酸序列的改变以最大似然法构建分子进化树, 发现年我国流行的 37 个毒株构成基因 4 系中一个独立的进化小分支本研究阐明了年我国 PPRV H 基因的分子演化特征, 从而为该病控制和消灭策略的制定提供了数据支持关键词 : 小反刍兽疫病毒 ; 血凝蛋白基因 ; 序列变异 ; 分子演化中图分类号 :S 文献标识码 :A 文章编号 : X(2019) DOI: /j.issn X Molecular Evolution Characteristics of H Gene of Peste Des Petits Ruminants Virus in China During 2013 to 2017 Liu Chunju 1,Sheng Yanxiang 2,Wang Qinghua 1,Chi Tianying 1,Zhu Lin 1, Wang Yingli 1,Ma Hongchao 1,Wang Zhiliang 1,Bao Jingyue 1 (1. China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao,Shandng ,China; 2. Zhejiang A&F University,Lin'an,Zhejiang ,China) Abstract:In order to study molecular characteristics of peste des petits ruminants virus(pprv)in China, 37 prevalent strains of PPRV collected from 2013 to 2017 were used for hemagglutinin(h)gene sequencing and bioinformatics analysis. The results showed that the genetic distance among nucleotide sequences of H gene of these strains was 0 to ,involving 41 variable sites,and the genetic distance among amino acid sequences of H protein ranged from 0 to ,with 24 variable sites. Based on the sequence alignment against 15 reference strains, it was found that the mutation of nucleotide sequences took place in 13 variable sites of H gene of all these strains,of which,9 nucleotide mutations resulted in the change of amino acid sequence. In addition,a molecular evolutionary tree was constructed by maximum likelihood,it was found that the 37 studied strains could be grouped into a distinct 1 收稿日期 : 修回日期 : 同等贡献作者 : 刘春菊, 盛琰翔基金项目 : 农业农村部疫情监测与防治经费项目通信作者 : 包静月 19

2 clade in lineage IV. In short,the molecular evolution characteristics of H gene of PPRV in China from 2013 to 2017 were stated in this paper,which would provide data supports to formulate relevant strategies for control and eradication of the disease. Key words:peste des petits ruminants virus;h gene;mutation of sequence;molecular evolution 小反刍兽疫 (peste des petits ruminants, PPR) 是由小反刍兽疫病毒 (peste des petits ruminants virus,pprv) 引起的一种急性病毒性传染病, 主要感染山羊绵羊以及野生小反刍兽, 以发热, 眼鼻分泌物增多以及胃炎腹泻和肺炎为特征该病主要流行于亚洲和非洲 2007 年我国在西藏阿里地区首次发现该病,2010 年 8 月在阿里地区日土县再次发现 PPR 疫情 [1] 2013 年末, 该病传入我国新疆地区, 并迅速传播至全国 22 个省份, 对我国养羊业造成严重危害 [2-3] 通过疫苗免疫和移动控制等措施, 该病目前在我国已得到有效控制 PPRV 属于副黏病毒科 (Paramyxovirdae) 麻疹病毒属 (Morbolivirus); 基因组为单股负链 RNA, 长度为 nt 或者 nt; 基因组 3' 末端为前导序列 (leader),5' 末端为尾随序列 (trailer);6 个基因排列顺序为 3'-N-P-M-F- H-L-5', 依次编码 6 个结构蛋白 : 核衣壳蛋白 (N) 磷蛋白 (P) 基质蛋白(M) 融合蛋白(F) 血凝蛋白 (H) 和大蛋白 (L), 其中 P 基因还编码 2 个非结构蛋白 C 和 V 根据 F 基因或 N 基因部分核苷酸序列差异, 将全球 PPRV 毒株分为 4 个基因系 [4-5], 其中在亚洲地区流行的毒株属于基因 4 系 [1] PPRV H 基因核苷酸长度为 nt, 编码 609 个氨基酸, 编码的 H 蛋白分子质量约为 68.8 ku H 蛋白和 F 蛋白共同组成病毒囊膜糖蛋白 H 蛋白属于 II 型膜糖蛋白, 以二硫键相连的二聚体或四聚体形式存在于病毒囊膜表面 H 蛋白负责与细胞表面受体结合, 然后协助 F 蛋白介导病毒和宿主细胞膜的融合 [6] 成熟的 H 蛋白由一个短的 N 端胞质侧尾巴一段疏水的跨膜区和一个大的 C 端胞外结构域组成 H 蛋白的胞外结构域构象为一个柄和一个球状头部, 球状头部含有抗原表位, 能够刺激机体产生中和抗体 [7] H 蛋白同时还具有神经氨酸酶活性和血凝素活性本研究对年我国 PPRV 流行毒株 H 基因进行序列测定和分析, 探讨该病毒流行过程中的 H 基因序列变异情况, 掌握其分子演化特征, 以期为该病控制和消灭策略的制定提供数据支持 1 材料与方法 1.1 病毒来源年在 9 个省 12 个疫点采集的 PPRV 阳性组织样品, 由中国动物卫生与流行病学中心保存并提供, 具体样品信息见表 1 表年我国 12 株 PPRV 毒株信息毒株编号采样日期 /( 年 - 月 - 日 ) 来源地 JL 吉林 JX 江西 ZJ 浙江 JX 江西 AH 安徽 GZ 贵州 JS 江苏 GX 广西 HN 湖南 XJ 新疆 HN 湖南 GZ 贵州 1.2 病毒 RNA 提取取肠系淋巴结组织 100 mg, 用组织匀浆仪匀浆后, 根据 Roche 公司生产的 High Pure Viral RNA Kit 的操作说明, 提取病毒 RNA, 80 保存 1.3 RT-PCR 采用 TaKaRa 公司生产的 Prime Script TM One 20

3 2019 年第 36 卷第 9 期 Step RT-PCR Kit, 对 PPRV H 基因进行扩增 : 在 50 μl 反应体系中加入 2 One Step Buffer 25 μl, Primerscript 1 step Enzyme Mix 2 μl, 上下游引物各 2 μl, 病毒 RNA 5 μl RT-PCR 反应条件为 : 50 逆转录 30 min,94 2 min, 进行 Taq 酶激活 ; 40 个循环的 PCR(94 1 min,68 1 min, 72 4 min);72 7 min 再延伸对 PCR 产物进行切胶回收 1.4 序列测定和进化树绘制将纯化后的 PCR 产物送青岛华大公司进行测序, 获得我国 12 个毒株的 H 基因序列年我国 25 个 PPRV 流行毒株的基因组序列由中国动物卫生与流行病学中心测得并已提交 GenBank, 毒株相关信息见表 2 从 GenBank 下载我国西藏及其他国家的 15 个 PPRV 代表毒株基因组序列, 毒株相关信息见表 3 从上述病毒基因组序列中截取 H 基因序列用 MEGA 4.0 软件进行序列比对, 用最大似然法法构建分子进化树,bootstrap 测试次重复用 Simplot 软件进行序列同源性分析 2 结果 2.1 H 基因核苷酸序列比较年来自我国 21 个省份 37 个疫点的 37 株 PPRV 毒株 H 基因核苷酸序列之间的遗传距离为 0~ 其中,2013 年 12 月 2014 年 6 月,15 个毒株的 H 基因序列完全一致这些毒株分别来自新疆 (XJ22013 XJ32013 XJ42013) 重庆 ( CQ2014) 黑龙江 ( HLJ2014) 吉林 (JL2014) 陕西 (SaX2014) 云南 (YN2014) 江苏 (JS2014) 湖北 (HB2014) 河南 (HNS2014) 贵州 (GZ2014) 湖南 (HN2014) 浙江 (ZJ2014) 四川 (SC2014) 等 13 个省 ( 自治区直辖市 ) 2013 年 12 月 2014 年 4 月, 来自新疆 (XJ52013) 甘肃 (GS2014) 辽宁(LN2014) 安徽(AH2014) 山西 ( SX2014) 的 5 个毒株 H 基因序列完全一致表年我国 PPRV 流行毒株信息病毒名称采样日期 /( 日 - 月 - 年 ) 来源地宿主 China/XJYL/ /30/2013 新疆山羊 China/XJ2/ /20/2013 新疆山羊 China/XJ3/ /21/2013 新疆绵羊 China/XJ4/ /22/2013 新疆山羊 China/XJ5/ /29/2013 新疆山羊 ChinaGS /22/2014 甘肃绵羊 ChinaNX /17/2014 宁夏绵羊 ChinaLN /17/2014 辽宁山羊 ChinaCQ /30/2014 重庆山羊 ChinaHLJ /31/2014 黑龙江山羊 ChinaYN /01/2014 云南山羊 ChinaSaX /01/2014 陕西山羊 ChinaJX /01/2014 江西山羊 ChinaJL /01/2014 吉林绵羊 ChinaJS /02/2014 江苏山羊 ChinaHeN /03/2014 河南山羊 ChinaHB /03/2014 湖北山羊 ChinaAH /03/2014 安徽山羊 ChinaSX /05/2014 山西山羊 ChinaGX /16/2014 广西山羊 ChinaGZ /21/2014 贵州山羊 ChinaZJ /25/2014 浙江山羊 ChinaHN /25/2014 湖南山羊 ChinaGD /15/2014 广东山羊 ChinaSC /10/2014 四川山羊毒株 XJ 与 HN02017 之间的 H 基因核苷酸序列差异最大, 遗传距离为 , 共 14 个位点存在序列差异 37 个毒株之间的核苷酸变异分布于 H 基因的 41 个位点 Simplot 分析结果 ( 图 2) 显示,H 基因序列中,120~420 bp 间的序列同源性为 100%, 没有突变发生 H 基因核苷酸序列在 3 个区域变异较大, 分别为 680~820 bp 1 240~1 380 bp 和 1 680~1 720 bp 区域 H 基因 41 个核苷酸变异位点中,24 个导致了氨基酸序列的改变 ( 表 4):18 个变异发生于第 1 21

4 表 3 PPRV 参考毒株信息毒株分离年份来源国家宿主 GenBank 号 China/Tibet/30/ 中国山羊 FJ China/Tibet /33/ 中国山羊 KX China/Tibet/Bharal/ 中国山羊 JX Côte d' Ivoire 科特迪瓦山羊 EU Nigeria 76/ 尼日利亚山羊 EU Turkey 土耳其山羊 NC CIV 01 P 科特迪瓦山羊 KR Ethiopia 埃塞俄比亚山羊 KJ Ethiopia 埃塞俄比亚山羊 KJ Ghana NK 加纳山羊 KJ Oman 阿曼山羊 KJ UAE 阿联酋山羊 KJ India TN Gingee 印度山羊 KR Uganda 乌干达山羊 KJ Morocco 摩洛哥山羊 KC 图年我国 PPRV 毒株 H 基因核苷酸序列同源性 Simplot 分析结果位密码子, 导致其中的 15 个位点发生氨基酸改变 ; 9 个变异位于第 2 位密码子, 导致全部氨基酸发生改变 ;14 个变异发生于第 3 位密码子, 未导致氨基酸改变将 XJYL2013 株与其余 36 个毒株进行 H 基因核苷酸序列比对, 发现 36 个毒株分别在 1~9 个位点发生了突变 H 基因核苷酸序列突变位点数与毒株流行时间呈正相关,2016 年 10 月以前的 32 个毒株, 突变位点为 1~6 个,2016 年 10 月以后的 4 个毒株, 突变位点为 8~9 个 2.2 H 基因编码氨基酸序列比较年我国 37 株 PPRV 毒株 H 基因编码氨基酸序列之间的遗传距离为 0~ H 基因编码的 609 个氨基酸位点中,24 个位点发生 22

5 2019 年第 36 卷第 9 期表年我国 PPRV 毒株 H 基因核苷酸和编码氨基酸序列变异情况项目我国流行毒株间的变异位点数量我国流行毒株与其他代表毒株间的变异位点数量合计第 1 位密码子第 2 位密码子第 3 位密码子合计第 1 位密码子第 2 位密码子第 3 位密码子核苷酸氨基酸突变率 /% 了突变 : 胞内区 (1~34 位 aa) 有 3 个位点发生了突变, 跨膜区 (35~58 位 aa) 有 1 个位点发生突变, 胞外长柄区 (59~181 位 aa) 有 3 个位点发生突变, 胞外球状头部区 (182~609 位 aa) 有 17 个位点发生突变 2.3 H 基因序列差异分析年我国 37 株 PPRV 流行毒株与 15 株 PPRV 代表毒株的 H 基因核苷酸序列遗传距离为 ~ , 其中与年我国西藏地区流行毒株 H 基因核苷酸序列遗传距离为 ~ , 而西藏地区流行毒株之间的 H 基因核苷酸序列遗传距离为 ~ 与 15 株 PPRV 代表毒株进行序列比对, 发现年我国 37 株 PPRV 流行毒株 H 基因的 13 个位点发生了核苷酸序列突变, 其中 9 个导致了氨基酸序列的改变 ( 表 4):3 个变异位于第 1 位密码子,3 个变异位于第 2 位密码子, 全部导致氨基酸改变 ;6 个变异位于第 3 位密码子,3 个导致氨基酸改变年我国 37 株 PPRV 流行毒株与 15 株代表毒株 H 基因编码氨基酸序列的 9 个变异位点位于 179~591 aa 之间, 全部位于 H 蛋白的胞外区, 其中 8 个变异位点位于胞外球状头部区 2.4 系统发育树构建基于 H 基因核苷酸序列构建系统发育树, 发现年我国 37 株 PPRV 流行毒株构成基因 4 系中一个独立的进化小分支, 而我国西藏地区流行毒株与印度 2014 年毒株形成一个小分支 ( 图 2) 图 2 PPRV 毒株 H 基因分子进化树 3 讨论本研究对年我国 21 个省份 37 个疫点的 PPRV 流行毒株 H 基因进行序列分析, 探 23

6 明了 PPRV 流行过程中 H 基因序列变异情况, 为 PPR 控制和消灭策略的制定提供了数据支持年我国 37 个 PPRV 流行毒株的 H 基因变异较大 PPRV 在我国流行的 4 年间,H 基因的 41 个核苷酸位点发生了突变, 其中 24 个位点导致了氨基酸序列的改变, 非同义突变率为 58.5% 之前的研究 [8] 发现,2013 年 11 月 2014 年 6 月,25 个毒株 H 基因的 7 个位点发生突变, 其中 4 个位点导致氨基酸序列的改变, 非同义突变率为 57.1% 本研究和之前的研究都发现,H 基因的非同义突变主要由第 1 位和第 2 位密码子的突变引起 PPRV 在我国流行过程中, 其突变在 H 基因中随机分布, 突变位点数量与流行时间呈正相关因此, 持续实时监测 PPRV H 基因分子变异, 对于该病的防控具有重要意义年我国流行的 PPRV 毒株在分子进化树中聚类为一个独立小分支, 相比于其他 PPRV 代表毒株, 这些毒株的 H 基因在 13 个位点发生了特征性的核苷酸突变, 其中 9 个位点导致了氨基酸序列的改变, 而且这些突变的氨基酸位点主要位于胞外区作为重要的抗原蛋白,H 蛋白的胞外球状头部含有抗原表位, 能够刺激机体产生中和抗体对于我国 PPRV 流行毒株 H 蛋白氨基酸改变能否导致其抗原性改变, 还需进一步研究参考文献 : [1] WANG Z,BAO J,WU X,et al. Peste des petits ruminants virus in Tibet,China[J]. Emerging infectious diseases,2009,15(2): [2] WU X,LI L,LI J,et al. Peste des petits ruminants viruses re-emerging in China, [J]. Transboundary and emerging diseases,2016,63(5): e [3] 王清华, 刘春菊, 吴晓东, 等. 新疆小反刍兽疫疫情诊断 [J]. 中国动物检疫,2014,31(1): [4] KWIATEK O,MINET C,GRILLET C,et al. Peste des petits ruminants(ppr)outbreak in Tajikistan[J]. Journal of comparative pathology,2007,136(2/3): [5] SHAILA M S,SHAMAKI D,FORSYTH M A,et al. Geographic distribution and epidemiology of peste des petits ruminants viruses[j]. Virus research,1996,43(2): [6] ROJAS J M,RODRIGUEZ-MARTIN D,AVIA M, et al. Peste des petits ruminants virus fusion and hemagglutinin proteins trigger antibody-dependent cellmediated cytotoxicity in infected cells[j]. Frontiers in immunology,2018,9:3172. [7] 赵玲娜, 金红岩, 薛晓娟, 等. 小反刍兽疫病毒 H 基因过表达对病毒增殖的影响 [J]. 中国兽医科学, 2016,46(11): [8] BAO J,WANG Q,LI L,et al. Evolutionary dynamics of recent peste des petits ruminants virus epidemic in China during [J]. Virology,2017,510: ( 责任编辑 : 朱迪国 ) 24

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