C6 His FAQ_F

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秘郁莫
4 years ago
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1 His 重組蛋白純化中常見問題解答集錦 His-tagged 是專門設計用於重組蛋白質的純化, 與其他 Tag 相比有很多明顯優勢, 是目前用於純化的 recombinant proteins 中使用最為廣泛的一種, 因此就列舉幾個 Histagged protein 純化的中常見的問題來討論對於 HIS-TAGGED PROTEIN 純化的產品, 如何選擇? GE 公司為純化 His-tagged 的蛋白質提供全面的解決方案, 產品種類豐富應用廣泛, 下面一一介紹其特點和應用 Ni Sepharose High Performance 用於高解析度純化的預帶電荷的介質通過耦聯 Ni 使介質預帶電荷, 使用非常方便和其他廠家的同類產品比較, 它具有高載量和低 Ni leakage 的特點, 低 Ni leakage 保證的 His-tagged protein 在多次重複的純化中保持可靠的載量同時 Ni Sepharose High Performance 凝膠的顆粒大小只有 34um, 具備最高的解析度和最低的樣品稀釋 Ni Sepharose High Performance 除了有散裝凝膠形式, 也具有 HISTrap 1 ml 和 5 ml 的實驗室預裝管柱, 可以連接 AKTA 儀器, 蠕動幫浦以及手動注射器操作, 使用非常方便

2 His MultiTrap HP 96 孔盤用於高通量篩選和多樣品的平行純化, 預裝了 Ni Sepharose High Performance 的凝膠, 未澄清的細胞 lysis solution 可以直接上樣, 具有高重複性, 操作簡單方便快捷的特點 His SpinTrap 管柱用於少量的蛋白質製備, 預裝了 100uL 的 HP 凝膠, 可以直接上澄清和未澄清的樣品, 可用於細菌細胞 Lysis solution 的篩選和優化純化條件, 結合離心機使用, 一次純化僅需 10 分鐘 Ni Sepharose 6 Fast Flow Highly cross-linked agarose 的高流速性質, 使其成為 batch 純化, 蛋白製備和放大生產的首選介質此凝膠具有非常高的載量, 意味著純化同樣的蛋白所用的介質就更少, 成本就更低和其他廠家的同類產品比較, 它具有高載量和低 Ni leakage 的特點, 低 Ni leakage 保證的 His-tagged protein 在多次重複的純化中保持可靠的載量同樣具有高載量和低 Ni leakage 的特點同樣有 HisTrap FF 預裝管柱和 His MultiTrap FF 96 孔盤的形式, 方便不同目的的純化 HisTrap FF crude 預裝管柱從未澄清的細胞 lysis solution 中直接純化目標蛋白質 HisTrap FF crude 1 ml 和 5 ml 內預裝了 Ni Sepharose 6 FF, 可以直接上樣未澄清的細胞 lysis solution, 這樣減少樣品製備時間, 加快純化速度, 使在有蛋白酶存在的細胞 lysis solution 中敏感的目標蛋白質的降解可能性降到最小 His GraviTrap 簡單的純化和快速得到結果 His GraviTrap 是預裝了 Ni Sepharose 6 FF 一次性使用的拋棄式管柱管柱可以用重力不需要系統快速簡單的純化, 澄清的和未澄清的大體積的樣品可以一次性上樣, 一次純化的時間大約在 30 分鐘 ( 根據樣品的體積和黏度 )His GraviTrap 包含在 His GraviTrap Kit 中, 其中包含了優化過的, 可供 20 次純化使用的緩衝液 His Buffer Kit 方便添加的預製緩衝液 Kit 含有結合, 清洗和 elute 的 stock 緩衝液, 適合於 Ni Sepharose 和 IMAC Sepharose 產品, 節省了耗時的緩衝液配置時間, 加快純化目標蛋白質純化出來出來沒有 His is-tagged protein? 有用戶反應沒有純化到 HIS-TAGGED PROTEIN, 別著急, 我們來排除可能的原因, 首先確定是蛋白沒有結合上管柱都流穿了, 還是蛋白沒有被 elute 下來, 然後一一檢查原因 : 若 HIS-TAGGED PROTEIN 沒有結合上去都流穿了, 請依次檢查 : 可能原因 : 超音波的功率不對 ( 太大, 蛋白炭化太小, 蛋白沒有釋放 ) 策略 : 改變超音波功率, 並在超音波前加入溶菌酶可能原因 : 樣品或者是 binding buffer 不正確策略 : 檢測 ph 及樣品和結合緩衝液的組成份確保在溶液中鼇合劑或強還原劑的濃度及 imidazole 的濃度不是太高

3 可能原因 : Histidine 的標籤沒有完全的暴露策略 : 在變性條件下 ( 用 4~8 M Urea, 或 4~6 M GdnHCl) 進行純化可能原因 : His-tag 丟失策略 1: WB 或者 anti-his 的抗體檢查 HIS 是否表達, 上游構建, 改變 his-tag 的位置 (C-terminal or N-terminal), 必要時增加 his 個數 ( 常用 6-10 個 ) 策略 2: incubation 的時間不夠, 降低流速和增加 incubation 的時間策略 3: 改變螯合的金屬離子, 尋找到最佳的結合金屬離子 Ni2+ 通常是從宿主細胞蛋白中純化大多數 ( Histidine ) 6 標記的重組蛋白質的首選金屬離子也是一般最常用的離子蛋白和金屬離子之間的結合強度受幾種因素影響, 包括, 長度位置親和標記在蛋白的暴露程度所用離子的類型以及緩衝液的 ph, 因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進行純化而不用 Ni 2+ 具體應用實例請參考 Recombinant Protein Purification Handbook, 或者登錄查詢若沒有 elute 下來, 請依次檢查 : 可能原因 : elute 條件太溫和 ( His-tagged 的蛋白質仍然結合在管柱上 ) 策略 : 用增加 imidazole 的梯度 elute 或降低 ph 來找出最佳的 elute 條件可能原因 : 降低 ph 作 elute, 因為若 ph 低於 3.5, 會導致 Ni 離子脫落策略 : 改變 elute 辦法,imidazole 競爭性 elute 可能原因 : 蛋白已沉澱在管柱上策略 : 減少上樣量, 或使用 imidazole 的線性梯度而不是分步 elute 以降低蛋白的濃度試用去污劑或改變 NaCl 的濃度, 或在變性條件 ( 去折疊 ) 下 elute ( 用 4~8 M Urea, 或 4~6 M GdnHCl) 可能原因 : 非特異性疏水或其他相互反應策略 : 加非離子 detergent 到 elute buffer( 如 2% Triton X-100) 或增加 NaCl 的濃度 HIS-TAGGED PROTEIN elute 後雜蛋白蛋白較多, 什麼原因? 如何優化? 高純度的蛋白是純化工作者的追求, 但由於很多天然蛋白也會帶有 His, 所以經常會出現 His-tagged protein elute 後有一些雜蛋白, 可能的原因和優化的方法如下 : 可能原因 : 蛋白酶部分降解了 Tag protein 策略 : 請添加蛋白酶抑制劑,( 慎用 EDTA) 可能原因 : 雜質對 Ni 離子有更高的親和性策略 1: imidazole 濃度必須優化, 以確保高純度 ( 宿主細胞蛋白質的低結合 ) 和高產率 (His-tagged 的目標蛋白質的強結合 ) 之間的最佳平衡

分步或者線性 elute 摸索出最優的 imidazole 結合和清洗濃度 ; 在樣品中加入與結合緩衝液同樣濃度的 imidazole ; imidazole 的梯度不大 (20 個或更多的管柱床體積 ), 可能分離出有相似結合強度的蛋白策略 2: 篩選最適合的緩衝亦條件, NaCl 的濃度, ph 範圍都需要考量策略 3 : 若以上優化的條件都不能去除雜質蛋白, 需要考慮多步純化的思路,

4 分步或者線性 elute 摸索出最優的 imidazole 結合和清洗濃度 ; 在樣品中加入與結合緩衝液同樣濃度的 imidazole ; imidazole 的梯度不大 (20 個或更多的管柱床體積 ), 可能分離出有相似結合強度的蛋白策略 2: 篩選最適合的緩衝亦條件, NaCl 的濃度, ph 範圍都需要考量策略 3 : 若以上優化的條件都不能去除雜質蛋白, 需要考慮多步純化的思路, 離子交換 (HiTrap Q HP or HiTrap SP HP) 和凝膠過濾 (Superdex Peptide, Superdex 75 or Superdex200) 是必須的以下是用 AKTAxPress 儀器進行四步純化的實例 AC ( 親和 ),DS ( 脫鹽 ),IEX ( 離子交換 ),GF ( 凝膠過濾 ) 所有的步驟都在 AKTAxPress 上自動執行, 包括管柱上的標籤酶切文章出處 Recombinant Protein Purification Handbook 可能原因 : 雜質和 tag protein 結合在一起策略 : 在超音波破碎細胞之前加入 detergent 或者還原劑 ; 增加 detergent 的濃度,( 2 % Triton X-100 or 2 % Tween 20); 或者在 wash buffer 中增加甘油的濃度 (50%) 減少非特異性的相互反應 ; 考慮增加 imidazole 的濃度或者改變金屬離子可能原因 : 洗滌不充分策略 : 增加洗滌的次數, 使洗滌充分

5 管柱堵塞, 如何處理? 管柱發生堵塞, 很有可能是樣品中細胞碎片, 所以樣品一定要離心, 或者用 0.22 or 0.45um 的膜過濾由於 E Coli lysis solution 非常難以 0.45um 濾過, 所以一般只經離心, 然後直接上管柱, 這樣對凝膠損害較大, 很容易堵管柱建議選用 Histrap Crude 預裝管管柱如果更大的規模, 可以考慮 hollow fiber u 澄清, 否則管柱很快會堵掉報廢如果管柱不幸堵了, 請及時反向清洗, 若不成功, 你必須更換凝膠或者管柱, 並在下次上樣時優化樣品的處理方法對於預裝管管柱或者是凝膠, 請做好日常的清洗和維護, 具體參考說明書, 若管柱 backpressure 增高了, 請徹底作 on column 清洗 (CIP) 反向沖洗可改善 CIP 方法的效率

Overcoming the most common obstacles in your purificaton of tagged proteins

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