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1 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 第期 请提供第一作者的手机号码以方便编辑部和作者联系,此号码不会公布在期刊中;请认真核实参考文献的作者, 2011 年月 Ch Ju Ay Chmy ~ 期刊,年,卷,期,起止页码是否正确以及文献是否与文中一一对应 如 5节中的文献 24 与后面的不一致 核实 4节和6节中的波长 为什么不一致 DOI: /SP. J 替代模板法制备甲硝唑分子印迹聚合物及其 在血清样品固相萃取中的应用 甲硝唑在二氯甲烷中吸 收波长为317m 在流动 相甲醇:水=15:85(/)中 吐尔洪 买买提 * 吸收波长为315m 阿不都克热木 卡地尔 哈丽丹 买买提 尼鲁帕尔 阿不都克尤木 (石油天然气精细化工教育部和自治区重点实验室,新疆大学化学化工学院, 乌鲁木齐 ) 摘 要 以甲硝唑酯化物(MNZ-E)为模板分子,甲基丙 烯 酸 为 功 能 单 体,乙 二 醇 二 甲 基 丙 烯 酸 酯 为 交 联 剂, 氯仿为致孔剂,合成了对甲硝唑(MNZ)具有特异吸附性能的 分 子 印 迹 聚 合 物 (MIP) 由 静 态 吸 附 实 验 结 果 得 知,印迹指数为 02,说明 MIP 对 MNZ 具 有 良 好 的 识 别 性 能 MIP 吸 附 属 于 Lgmu 吸 附 模 型,其 对 MNZ 的吸附属于单层分子吸附,其最大表观吸附量 Qmx 为 116 mm/g,结 合 常 数 K 为 0.65 L/mm 在 固 相 萃 取 实 验中,MNZ 在分子印迹固相萃取(MISPE)和非印迹固 相 萃 取(NISPE)上 的 回 收 率 分 别 为 97.4% 和 44.3%,而 结 构类似物 MNZ-E 和 对 硝 基 苯 酚 在 印 迹 和 非 印 迹 柱 子 上 的 回 收 率 均 小 于 11.6%,表 明 替 代 模 板 MIP 对 MNZ 具有很高的选择性吸附 应用 MISPE 分离富集血清样品中的 MNZ 回收率为 94.5%,说 明 替 代 模 板 MIP 可 实 现血清样品中 MNZ 的选择性分离富集,且没有模板渗漏 关键词 1 引 甲硝唑; 替代模板; 分子印迹聚合物; 固相萃取 言 甲硝唑(MNZ)是临床常用的硝基咪 唑 类 抗 微 生 物 药 物,可 抑 制 阿 米 巴 原 虫 氧 化 还 原 反 应,使 原 虫 氮链发生断裂,具有抗菌和消炎的作用 [1] 在环境 和 生 物 样 品 中,检 测 MNZ 的 方 法 有 气 相 色 谱 法 [2] 高 效液相色谱法 [3~ 6] 质谱法 [7] 和分光光度法 [8] 等 溶剂萃取和固相萃取法(Sd ph x,spe)是生物样品中 MNZ 的有效前处理手段 [9] 但传 统的 SPE 吸附剂和被分析物之间的 作 用 力 是 非 特 异 性 的,吸 附 率 和 回 收 率 均 不 佳 与 之 相 比,分 子 印 迹聚合物(MIP)具有高选择性 亲和性及预定性,故 MIP 作为 SPE 材料得到了广泛应用 Mhmd 等 [10] 制备了硝基咪唑类化合物的 MIP,但并未给 出 功 能 单 体 等 重 要 因 素 J 等 [11] 将 MNZ 作 为 模 板 分 子 制备 MIP,其回收率仅 89%,也未考察聚合物的印迹效果 但 MISPE 应用中有模板分子渗漏的缺陷,会 干扰目标物测定 为解决模板渗漏,Mu 等 [10] 提 出 了 替 代 模 板 法 该 法 是 将 目 标 化 合 物 的 结 构 类 似 物作为模板分子,制备对目标分子有选择性 MIP 的一种新方法 已对多种化合物使用替代模板法制备 了 MIP,基本解决了模板渗漏问题 [12~ 16] 本研究采用替代模板法制备 MNZ-MIP,将其作为 SPE 吸附剂,考察聚合物的吸附量和选择性,并应 用于生物样品的分离与富集 2 实验部分 1 仪器与试剂 PS 高效液相色谱分 析 仪 (美 国 VARIAN 公 司);UV-2450 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 (日 本 岛 津 公 司);5S1020 固相萃取仪(北京振翔工贸有限公司);甲硝唑 (MNZ,杭 州 大 阳 化 工 有 限 公 司);甲 基 丙 烯 酸 (MAA,纯度> 99.5%,A-Og 公司);对 硝 基 苯 酚(4-NP,杭 州 大 阳 化 工 有 限 公 司);乙 二 醇 二 甲 基 丙烯酸酯(用前除阻聚剂,EDMA,分 析 纯,百 灵 威 化 学 技 术 有 限 公 司);偶 氮 二 乙 丁 腈 (用 甲 醇 重 结 晶, AIBN,化学纯,上海试剂厂);甲醇(MOH,色谱纯,TEDIA,Nw Jy),其它试剂均为分析纯 收稿; 接受 本文系国家自然科学基金(N , )和新疆大学石油天然气 精 细 化 工 重 点 实 验 室 开 放 课 题 基 金 (N. XJDX ) 资助 * E-m:ughum@ gm.m

2 分 析 化 学 乙酸酐 2 替代模板的合成 32 mm) A2 O 滴入 1.0 g (5.84 mm) MNZ 中,水浴加热至 70,搅拌反应 4 h,减压蒸 19 将 0 ml ( [17] 干 剩余物经柱色谱分离,得 g 金黄色晶体(MNZ-E),熔点为 75~ 76,产率为 75% 1 H NMR (400 MH, CDC3 ) δ= 7.96 (, 1H), 4.58 (m, 2H), 4.41 (m, 2H), 51 (, 3H), 03 (, 3H) 3 MIP 的制备 将 g (0.8 mm) MNZ-E g (4 mm) MAA 40 mg AIBN 1715g (16 mm) EDMA, 5.5 ml 氯仿,置于聚合瓶中,充分溶解混匀,超声脱气 5 m,通氮气 10 m,密封 将 聚 合 瓶 放 入 50 恒温油浴锅中加热 24 h,得到白色块状聚合物 将块状聚合物用湿法研磨,过筛收集得到粒径 38~ 75 m m 的微粒,以冰乙酸-甲醇(1 9, V/V)溶液洗至 无 MNZ-E 检 出;再 用 甲 醇 洗 去 乙 酸,最 后 真 空 干 燥 至 恒 重 NMIP 的制备:除不加入 MNZ-E 外,其余步骤与 MIP 的制备过程相同 4 静态吸附实验 称 取 20 mg MIP(或 NIP),置入 5 ml 容量瓶中,加入 4 ml MNZ-二氯甲烷溶液(10~ 350 mg/l),室温 振荡 12 h 溶液经微孔膜过滤,滤液用二氯甲烷适当稀释,测得 317 m 处 的 吸 光 度,计 算 MNZ 的 回 收 率 5 分子印迹固相萃取(MI SPE) 称取 100 mg 干燥的 MIP(或 NIP),置入 1 ml SPE 小柱中,在聚合物上放置塞板 小柱分别用 2 ml 甲醇和 2 ml 二氯甲烷活化,MNZ-二氯甲烷溶液上样 1 ml,依次用 1 ml 二氯甲烷和 1 ml 乙腈-二氯甲 烷(5 95, V/V )淋洗,1 ml 甲醇洗脱两次,以吸光度计算回收率 6 样品的制备及萃取 取空白牛血清样品 0.4 ml,置于具塞离心管 中,准 确 加 入 0.1 ml 450 mg/l MNZ 水 溶 液,涡 旋 混 匀 1 m;加 3 ml 氯仿-异丙醇 (95 5, V/V )混 匀,2000 /m 离 心 10 m,除 去 蛋 白 质;准 确 量 取 上 层 清 液 5 ml,在 40 水浴中用氮气吹干,用 1.0 ml 二氯甲烷溶解,按照 5 节的方法进行固相萃取 萃取液 用 HPLC 法测定,色谱柱为依利特 C18 分析柱(150 mm 4.6 mm,5 mm),流 动 相 为 甲 醇-水(15 85, V/V ); 流速 1 ml/m;进样量 20 ml;柱温为 25 ;检测波长 315 m 3 结果与讨论 1 替代模板分子与功能单体的相互作用 MNZ 是一种水溶性药物,在常用的制备 MIP 的溶剂(氯仿 乙腈 甲苯)中 溶 解 性 差 因 此,用 自 制 的 MNZ 酯化物作为替代模板法制备对 MNZ 具有特异吸附性能的 MIP,在 S Gph O u19 g IRIX 6.5 操作系统上,采用 SYBYL 6.9TM 软件的 LEAPFROGTM 算法进行 了 计 算 机 模 拟 [18],实 验 考 果 察替代模板分 子 和 功 能 单 体 之 间 的 相 互 作 用 模 拟 结 构 显 示,MAA 分 子 中 的-OH 替 代 模 板 分 子, MNZ-E,中的 C O 有强氢键 作 用(图 1),并 形 成 稳 定 的 复 合 物 以 EDMA 为 交 联 剂,氯 仿 为 致 孔 剂,AIBN 为引发剂时,能在复合物周围形成固定的网状结构的 MIP,对 MNZ 有很强的特异吸附性能 更改为[21] 2 MIP 的结合能力和印迹指数 除去模板分子后,在 MIP 中形成与模板分子在空间和结合位点上相匹配的具有多重作用位点的空 穴,这样的空穴对模板分子具 有 很 高 的 选 择 性 [22] 通 过 吸 附 前 后 溶 液 中 MNZ 含 量 变 化,计 算 MIP(或 NIP)对 MNZ 的结合量( Q): Q= ( C0 -C) V/m ( C0 和 C 分别是吸附前后溶液中 MNZ 的浓度(mg/L),V 是 溶液的体积,m 是 MIP(或 NIP)的质量 由图 2 可见,随着浓度的提高,MIP 和 NIP 的吸 附 量 随 之 增 大;浓 度 为 1.46 mm/l 时,吸 附 达 到 饱 和 此时 MIIP 和 NIP 对 MNZ 的 吸 附 容 量 分 别 为 34.0 和 16.8 mm/g,印 迹 指 数 为 02,表 明 MIP 对 MNZ 具有良好的选择性吸附能力 更改为[22] 以 Lgmu 等温吸附模型 [23], 1/Q = 1/Qm xkc + 1/Qmx ( Qmx 为结合位点的最大表观吸附量,K 为结 合位点的结合常 数), 拟 合 图 2 中 的 MIP 吸 附 曲 线 经 1/Q 对 1/C 线 性 回 归,得 方 程 y= x , R = 0.998,与 Lgmu 等温吸附模型吻合很好 说明在所研究的浓度范围内,MNZ 在 MIP 上的

3 第期 吐尔洪 买买提等:替代模板法制备 MNZ 分子印迹聚合物及其在血清样品固相萃取中的应用 图1 Fg.1 替代模板分子 MNZ-E 与功能单体 MAA 的结构式及其计算机模拟 Chm uu dummy mp md (MNZ-E), mm mhy d (MAA) d u mpu mdg 吸附是单层分子吸 附 通 过 曲 线 截 距 计 算 最 大 表 观 吸附量 Qmx 为 116 mm/g,由截距和斜率之比计算结 合常数 K 为 0.65 L/mm 3 固相萃取( SPE)条件的优化 分别用水 甲 醇 乙 腈 氯 仿 和 二 氯 甲 烷 作 为 溶 剂,考察 MISPE 和 NISPE 对 MNZ 的 保 留 能 力 由 图 3 可见,在水中回收率最低(NIP 和 MIP 的 分 别 为 11% 和 16.4% ),而 二 氯 甲 烷 中 回 收 率 最 高 (NIP 和 MIP 的分别 为 86.2% 和 98.3% ),即 回 收 率 随 溶 剂 极 性降低而升高,故选二氯甲烷为上样溶剂 目标分子在 MIP 表面上的结合形式并非是完全 的特异性吸附,选用 合 适 的 淋 洗 剂,可 减 少 非 特 异 性 吸附 由图 4 可 见,用 1 ml 甲 醇 或 乙 腈 时,不 但 能 图2 MIP 和 NIP 的吸附等温曲线 Adp hm MIP d -muy Fg.2 mpd pym (NIP) 淋洗 MISPE 上 非 特 异 性 吸 附 的 MNZ,同 时 特 异 性 吸 附 的 MNZ 也 被 林 洗 掉,回 收 率 分 别 是 6.3% 和 14.5% 二氯甲烷作为淋洗剂时,MIP 的形态转变为有利于形成氢键的状态,MNZ 就容易选择性的保留 在 MIP 上,而其它杂质物都被淋洗剂除去 为了获得高选择性,将少量的乙腈加入到二氯甲烷中,作为 Whg 图3 不 同 溶 剂 中 MNZ(50 mg/l)在 MIP 和 NIP 上 回 收率 Fg.3 图4 用 不 同 淋 洗 溶 剂 时 MNZ 在 MISPE 和 NISPE 上 回收率 MIP d NIP (% ) 1 ml 50 mg/l md d dg Fg.4 E whg MNZ MISPE d NISPE

4 分 析 化 学 淋洗剂,除去样品中非特异性吸附的残留物 当乙腈含量为 5% 时,MNZ 在 NISPE 上的回收率较低(77. 5% ),而在 MISPE 上很高(97.9% ) 因此,选定 1 ml 二氯甲烷和 1 ml 5% ( V/V )乙腈-二氯甲烷 作 为 后 续实验的淋洗溶剂 极性强的溶剂 能 有 效 破 坏 MIP 和 目 标 分 子 之 间 的 特 异 性 作 用 本 研 究 中 使 用 甲 醇为洗脱液时回收率最高 因此,选择 2 1 ml 甲醇为洗脱液 4 MIP 的选择性实验 为评 价 替 代 模 板 MIP 的 选 择 性,以 MNZ-E 和 4-NP 作 为 结 构 类 似 物,研 究 它 们 在 MISPE (或 NISPE)上的保留能力 由图 5 可见,MNZ 在 MISPE 和 NISPE 上 的 回 收 率 分 别 为 97.4% 和 44.3%,说 明 MIP 对 MNZ 有很高的吸附选择性 然而,MNZ-E 和 4-NP 在 MISPE 上的保留能力很差,回收率分别为 11.6% 和 4.3%,它们在 NISPE 上的回收率分别为 5.6% 和 5.2% 这些化合物在 MIP 上的吸附主要是非 特异性吸附,所以都能被大量淋洗除去 作为结构类似物的 MNZ-E,具有与 MNZ 相同的分 子 结 构 和 官 能 团,它 的 回 收 率 略 高 于 4-NP 虽 然 4-NP 分子中也有能形成氢键的官能团(硝基,羟基),但它的形状和大小与 MIP 中的空穴相差很大,很 难与识别位点发生作用 MIP 对目标化合物的选择性吸附 过 程 中,目 标 分 子 的 独 特 形 状 和 特 有 功 能 基 团同时起关键作用 图5 Fg.5 MNZ, MNZ-, 4- NP 二氯甲烷溶液 50mg/L 在 MISPE 和 NISPE 上的萃取分离 Ex p bd wh MISPE d NISPE p dhmh pkd wh MNZ, MNZ-, 4- NP 50mg/L( = 4, RSD= 1.5% ~ 7% ) 要删除 5 血清样品的测定 在上述条件下,用替代模板分子印 迹 固 相 萃 取 对 血 清 样 品 的 MNZ 进 行 分 离 富 集 血 清 样 品 是 一 个非常复杂的体系,其中的一些蛋白质会影响测试 结 果 [24],本 研 究 采 用 氯 仿 /异 丙 醇 分 离 血 清 中 的 蛋 白 质 按照 MNZ 在人体中有效血药浓度(1.0~ 5.0 mg/l),选取 3 个浓度配制血清样品,去除蛋白质 后用 MISPE 处理,用 HPLC 平行测定 4 次,结 果 见表 1 MNZ 分析柱的保留时间为 4.98 m,方 法的检出限为 0.2 mg/l 可见,替代模板 MISPE 对血清药品中的 MNZ 较 高 的 萃 取 回 收 率(平 均 值为 94.5% ),具有一定应用价值 表 1 MISPE 净化牛血清中 MNZ 后 HPLC 分析结果 ( = 4) Tb 1 Ru m HPLC y MISPE-pud x MNZ-pkd um 加标量 Addd (mg/l) 回收量 Amu ud (mg/l) 回收率 Ry (% ) RSD (% ) 本研究以自制的甲硝唑酯化物(MNZ-E)为 模板分子,甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,氯仿为致孔剂,合成了高度选择性 的替代模板 MISPE,实现了血清样品中的 MNZ 分离富集和检测,解决了模板渗漏 致 谢 感谢 本 在 计 算 机 模 拟 方 面 获 得 了 Cdd Uy 的 E V. Pk 的 帮 助,在 此 表 示

5 第期 吐尔洪 买买提等:替代模板法制备 MNZ 分子印迹聚合物及其在血清样品固相萃取中的应用 R 1 JIN G-D, LU Y-M (金根娣,吕雅梅). J. Yghu Pyh. Cg (扬州职业大学学报), 2010, 14(1): 43~45 1 J IN G.J.YghuP h.c g,2010,14( 1):43~45 y -D,LÜ Y -M 金根娣,吕雅梅.扬州职业大学学报,2010,14( 1):43~45 2 HC,S D W M,WgK M,Tg H P O.A.Ch m.a,2005,530( 1):23~31 3 DN m TG, O EdJ,M êdroj.phm.b md.a.,2005,37( 4):777~783 4 T h uhb M,J b EL,J b M K.DugD.Id.Phm.,2008,34( 8):840~844 5 YugP K F,L R,J g Y Q,Buk ysj,p kp T,Kp H.J.Phm.B md.a.,1998, 17( 8):1393~ S ubb gg,b.ch m.a,2009,637( 1 2):68~78 gwdt.a 7 SgC,S d A,Dub u D,Pu PP,Du u D,B ump I.J.Phm.B md.a.,2005,38( 2): 298~306 HU X-Gg, LI Gg-K (胡小刚, 李攻科). Ch J. A. Chm. (分析化学), 2006, 34(7):1035~ HU X J.A.Chm.,2006,34( 7):1035~1041 -Gg,LIGg -K.Ch 胡小刚,李攻科.分析化学,2006,34( 7):1035~1041 J M, R B, Zk B. A.Chm., 2009, 81(9): 3585~ M u J,Okd M,Tu uk M,Tkuh T.A.Cmmu.,1997,34( 3):85~87 10 MhmdR,M P,T gu L,R h J,Y m E,Tb JC,GuyPA.J.Ag.F dchm.,2008, -Py 56( 10):3500~ F X, Sj JA, Váqu-T MP, Rg P, Cpd A, F C. A. Chm. A, 2009, 631(2): 237~ J M,R B,Zk B.A.Chm.,2009,81( 9):3585~3591Thdd G, K A, M P, Rk N, TukPpdpuu H. J. Chm. A, 2003, 987(1-2): 103~ FáX,YL,Rg P,F C A,H SV,CpdA.J.Sp.S.,2009,32( 10):1740~ L ux,l uj,hugy,zhr,l ug,chy.j.ch m ga,2009,1216( 44):7533~ Nm h M,KubT,H yk,kyk.a.b.chm.,2006,384( 6):1291~ Y J,MgZ,Du M,L uc,sg M,Wg H.J.Ch m g.a,2010,1217( 33):5420~ Su H W,WgFC,ALF.J.Ch m g.b,2007,857( 2):296~ ZHAO X,LIChg S um N u um U P k,2002,38( 2):175~180 -Ru -X.A ZHAO X-Ru, LI Chg-X (赵宪瑞,李崇熙). A Sum Nuum ) : 赵宪瑞,李崇熙.北京大学学报,2002,38( 2 175~180 U Pk (北京大学学报), 2002, 38( 2): 175~ ZENG H,WANGJ J.Phm.A.,2010,30( 4):686~690 -Hu,MuhmmdT,LIU Cu -D.Ch 曾何华,吐尔洪 买买提,刘 翠,王吉德.药物分析,2010,30( 4):686~ LIU Cu,MuhmmdT,Hudb d N,E V P,ZENG H J.A.Chm.,2010,38( 11): -Hu.Ch LIU Cu, Muhmmd T, Hudbd N, E V P, ZENG H-Hu (刘翠, 吐尔洪 买买提, 努尔买买提 库达巴尔地, 1652 ~1656 曾何华). Ch J. A. Chm. (分析化学) 2010, 38(11): 1652 ~ 刘 翠,吐尔洪 买买提,努尔买买提 库达巴尔地,曾何华.分析化学,2010,38( 11):1652 ~ Muhmmd T,ABULIKEMU Abu, WANG J.Ch J.A.Chm.,2007,35( 7): -D,CHEN J 1059~1062 Muhmmd T, ABULIKEMU Abu, WANG J-D, CHEN J(吐尔洪 买买提, 阿布力克木 阿布力孜, 王吉德, 陈 坚). Ch J. A. Chm.(分析化学), 2007, 35(7): 1059~1062 吐尔洪 买买提,阿布力克木 阿布力孜,王吉德,陈 坚.分析化学,2007,35( 7):1059~ G í ója,dí í M E.S da u B,2007,23( 2): C -G Dummy mp M u dp S S d yimp ym ph Ex M d B S um TURGHUN Muhmmd*,ABDUKIREM Kd,HALIDAN Mm,NILUPAER Abudukyumu ( KyLb y O dg F Chm,M y Edu d X j g UyghuAu mu Rg, C g Chm ydchm Eg g,x j gu ) y,uumq Ab M d (MNZ) w h dummy mp,m h d m y m, hy g d m h k dh m p g h dummy y y y - mp m u dp (MIP) MNZ.Th u b h b d g hwd ymp ym dg h mp g hp w 02,wh h d h g b h MIP ym gh y g MNZ.MIPd h m w Lgmu d md, h w m p p, / m y d p w h mx mum b d g p 116 m g db d g K y Qmx

6 分析化学 0.65L/mm.ThMNZ MIPdmpddgw97.4% d44.3% pydphx (SPE)xpm.Hw,hgu MNZ,MNZ d4-ph,hdh11.6% bh MIPdNIPSPE,hwgh hghyhdummymp MIPg MNZ.Th MIP wuuyudh pd MNZpkdum mp wh my94.5%,whh dmdhhmipbppdpṯmmnzummpwhump bdg. Kywd Md;Dummyṯmp;Muympdpym;Sdphx (Rd14Ap2011;pd6Augu2011)

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