第二章生物实验基本技术规程第二节母液的配制南昌大学生物学实验教学中心蔡奇英 ;QQ:

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赴弘
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1 第二章生物实验基本技术规程第二节母液的配制南昌大学生物学实验教学中心蔡奇英 ;QQ:

2 第二节母液的配制当要配制不同浓度系列的溶液或含有相同成分的溶液时, 配制母液 ( 原液或浓缩液 ) 可以节省时间母液比最终工作溶液的浓度大 ( ), 经过适当稀释配制成最终溶液现以植物组织培养 MS 营养液配制为例介绍母液配制的方法和过程实验 5-7 人一组, 每组配制 MS 大量元素的母液 100mL (10 )

3 MS 培养基成分 (1)MS 大量元素工作浓度 g/l NH 4 NO KNO3 1.9 KH 2 PO MgSO 4 7H 2 O 0.37 CaCl (2)MS 微量元素工作浓度 mg/l KI 0.83 H 3 BO MnSO 4 4H 2 O 22.3 ZnSO 4 7H 2 O 8.6 Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.25 CuSO 4 5H 2 O CoCl 2 6H 2 O 0.025

4 MS 培养基成分 (3) 铁盐工作浓度 mg/l FeSO 4 7H 2 O 27.8 Na 2 -EDTA 2H 2 O 37.3 ⑷ 复合维生素工作浓度 mg/l 烟酸 0.5 VB6 0.5 VB1 0.4 甘氨酸 2 肌醇 100 (5) 蔗糖 2-4% (6) 琼脂粉 0.7% (7) 生长调节剂

5 MS 大量元素母液的配制 1. 大量元素工作浓度 g/l 母液 g/l(10 ) 100mL (10 ) NH 4 NO KNO KH 2 PO MgSO 4 7H 2 O CaCl 2 2H 2 O 0.44(0.332) 4.4(3.32) 0.44(0.332)

6 MS 大量元素母液的配制 1. 计算并称取各成分的用量注意 : 如何是称取无水 CaCl 2 时, 只称取 0.332g, 称量时动作稍快一点, 防过度吸湿 2. 按表格顺序依次, 在小烧杯中分别用 15ml 的纯水完全溶解 ( 彻底 ), 依次转移入另一烧杯混合注意 : 将 CaCl 2 转移时, 缓慢加入, 同时以玻棒搅拌, 尽快使 Ca 2+ 分散, 防止沉淀产生 3. 将混合液导入 100mL 的容量瓶, 润洗烧杯两次, 一并导入容量瓶, 定容 4. 贴标签 ( 溶液名浓度时间姓名或组别 ) 5. 贮存

7 第三节 ph 与缓冲液 1. ph 值的意义和来由 ph 值是用来衡量溶液中氢离子 (H + ) 浓度的指标, 它将影响许多物质的溶解性和大多数生物系统的活性, 包括从单个小分子到整个有机体多数细胞仅能在很窄的 ph 范围内进行活动, 因此在很多生物实验中, 常常需要控制溶液的 ph 值不发生大的变化, 如酶活性代谢实验和细胞培养的培养基等

8 水的解离 H 2 O=H + +OH - 酸的解离 H-A=H + +A - 其中 H-A 代表酸,A - 是相应的共轭基团酸在水中解离会增加质子的数量, 所以酸是一种在水溶液中作为质子供体的化合物碱的解离 B-OH=B + +OH - 其中 B-OH 代表未解离的强碱, 由于水的解离是可逆的, 在水溶液中碱产生的氢氧根离子会有效地与质子结合, 从而减低质子的浓度碱是一种在水溶液中作为质子受体的化合物

9 在水溶液中, 绝大多数水分子不发生解离事实上, 在任何温度下, 纯水的离子化程度是恒定的, 水中离子解离常数表示 : K w =[H + ][OH - ] 在 25 时, 纯水的离子产额为 mol 2 L-2 意思是溶液中质子的浓度为 10-7 mol -1 L-1, 氢氧根离子浓度与之相同因为这些数值都很小且都是 10 的负数幂, 因此习惯上用 ph 来表示 : ph=-log 10 [H + ] 其中 [H + ] 是质子的活度

10 当 H + 和 OH - 的离子数量相等时溶液为中性 : 在 25 时, 纯水在 ph 为 7.0 是中性,pH 值在 7.0 以下为酸性, 在 7.0 以上则为碱性 ( 如图 ) 但是溶液的 ph 值会随温度而改变, 因为水的解离随温度升高而增强, 所以在测定溶液的 ph 值及其结果解释时, 一定要考虑这一点

11 2.pH 值的测定 (1) ph 指示剂某些化合物会因 ph 值变化改变颜色, 他们可以少量加入溶液中或制成 ph 试纸条, 作为溶液的 ph 指示剂, 每种指示剂通常在限定的 ph 范围内改变颜色 ( 如下表 ) 指示剂酸碱指示剂变色范围甲基橙 < 3.1 红色橙色 > 4.4 黄色石蕊 <5.0 红色紫色 > 8 蓝色酚酞 < 8.0 无色浅红色 > 10 红色

12 2.pH 值的测定 ph 指示剂适用范围 : 广泛指示剂 / 试纸由多种染料混合而成, 可以测定较宽范围的 ph 但不能精确测定 ph 值可用于 : A. 估计溶液的近似 ph B. 建立细胞内不同细胞器的近似 ph 值, 如中性红用于活体染色 C. 测定 ph 的变化, 如指示滴定终点

13 2.pH 值的测定 (2)pH 电极测定 ph 计可以直接精确测出溶液中 ph 值工作原理 : ph 电极通常是一个组合电极, 它由两个独立系统组成 : 一个对 H+ 敏感的玻璃电极和一个不受 H + 浓度影响的参比电极, 将电极浸入溶液中, 电位计能测出两个电极之间的电压, 从而换算成对应的 ph 显示出来许多 ph 计上有温度补偿装置, 以便校正温度差异

14 ph 计

15 ph 计的使用方法 1 使用前准备工作 : 按照仪器使用说明书准备记下所测定的每一溶液的温度, 包括所有标样和样品, 因为温度会影响 Kw, 中性点及 ph 值 a. 设置温度补偿值在电位计上设置适当的温度补偿值, 这一控制可补偿温度对电位计测得电位差的影响, 简单的 ph 计没有温度补偿功能, 只能在特定温度下 ( 如 25 度 ) 使用, 否则测量结果不准确, 复杂的 ph 具有自动温度补偿器 b. 用蒸馏水冲洗电极, 并用干净吸水纸轻轻吸干电极表面的水, 检测玻璃电极是否破损或污染, 检测溶液是否完全浸没电极

16 c. 校准 ph 计通常有一点校正和两点校正法, 一般采用两点校正法调整电位计到 ph 模式第一检测点 : 复合电极放入已知 ph( 通常为 7.0 或 6.86) 的标准溶液中, 等读数稳定后, 调节校正控制钮 ( 有的仪器可以自动校正 ) 得到为标准溶液的 ph 值读数 ; 然后从校正标准溶液中取出 ph 电极, 再次用蒸馏水冲洗, 吸水纸吸干 ; 第二检测点 : 复合电极浸入到相同温度下的第二种标准溶液中使用哪种标准液取决于样品的预期 ph 值, 如果样品的预期 ph 值偏酸, 第二点校正用 ph4.0 标准缓冲溶液, 如果预期偏碱则采用 ph9.0 缓冲液, 调节斜率控制钮, 直到达到第二标准溶液的精确 ph 值注意 : 校正标准液只能在特定的温度下给出特定的 ph 值, 可以从文献或者标准液供应商查得不同温度下标准液的 ph 值

17 ph 计的使用方法 2 校正好的仪器可以测量待测溶液的 ph 值, 将电极重新用蒸馏水冲洗后, 浸入到待测样品溶液中, 待 ph 计读数稳定后, 再读数 3 使用完毕后, 再用蒸馏水冲洗电极, 然后把电极保存在饱和 KCl 溶液中, 千万不能用蒸馏水作为保存液如果长时间不用, 可以把 ph 计电源关闭

18 3. 如何控制 ph 值缓冲溶液控制溶液 ph 值最有效的方法之一就是应用 ph 缓冲溶液缓冲液通常是一种弱酸及其共轭碱的混合物额外的质子可由阴离子基团中和, 质子的减少 ( 如 OH - 加入 ), 会由酸的解离来弥补, 因此这一共轭对就是 ph 值改变的缓冲器 H-A A - +H + 共轭酸共轭碱

19 如何选择缓冲溶液实验室常用的缓冲系主要有磷酸柠檬酸碳酸醋酸巴比妥酸 Tris( 三羟甲基氨基甲烷 ) 等系统, 实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的 ph 值, 而是缓冲液中的某种离子如硼酸盐柠檬酸盐磷酸盐和 Tris 等缓冲剂都可能产生不需要的化学反应

20 如何配制缓冲溶液选择了合适的缓冲液后, 需要将溶液调节到希望的 ph 值必须考虑两个因素 : (1) 达到准确 ph 值所需共轭酸和共轭碱的比例 (2) 缓冲液的需要量, 多数情况下, 缓冲液含有的共轭对在 0.05mol/L-0.2mol/L 之间缓冲能力依赖于以上这两种因素多数常规缓冲液配方在很多文献中都给出了, 因此可以直接按照配制

21 例子 : 磷酸盐缓冲溶液配制 Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4 缓冲液 (0.2 mol/l) ph 0.2M Na 2 HPO 4 (ml) 0.2M NaH 2 PO 4 (ml)

22 如何配制缓冲溶液按照表格中配方, 用量筒分别量取 0.2M 两种磷酸盐母液所需体积, 配制成 100 ml, 混合均匀用 ph 计测量缓冲溶液的 ph 值, 看是否达到了所需的 ph, 如果没有达到, 滴加两种磷酸盐进行调节, 如果偏酸, 加入 Na 2 HPO 4, 如果偏碱, 则加入 NaH 2 PO 4, 直到调节到所需的 ph

23 第四节培养基的配制与灭菌 1. 找全培养基所需母液或药品 (1) 大量元素 ;(2) 微量元素 ;(3) 铁盐 ;(4) 有机成份 ;(5) 蔗糖 ;(6) 琼脂粉 ( 条 );(7) 生长调节剂 (6-BA 0.5 NAA 0.5) 2. 检查母液的倍数或浓度, 计算一定体积培养基所需药剂用量 3. 称量药剂, 依次加入烧杯注意烧杯使用前要用容量瓶或量筒量水重新定容, 在烧杯壁上标记一定的体积对应位置

24 每组配制 300ml 培养基 i MS+6-BA0.4 +NAA0 ( 第一组 ) ii MS+6-BA0.4+NAA0.2 ( 第二组 ) iii MS+6-BA0.4+NAA0.4( 第三组 ) iv MS+6-BA0.4+NAA0.6( 第四组 ) v MS+6-BA0.4+NAA0.8 ( 第五组 ) vi MS+6-BA0.4+NAA1.0( 第六组 )

25 300ml MS 基本培养基各成分用量序号成分及母液浓度 1L 培养基的用量 0.3L 培养基的用量 1 大量元素 (10 ) 100ml 30ml 2 微量元素 (100 ) 10ml 3ml 3 铁盐 (200 ) 5ml 1.5ml 4 有机成份 (200 ) 5ml 1.5ml 5 蔗糖 30g 9g 6 琼脂粉 7g 2.1g 7 生长调节剂

26 300ml MS 培养基生长调节剂用量以 NO.2 为例 :MS+6-BA0.4mg/L+NAA0.2mg/L 6-BA: 0.4mg/L 0.3L=0.5mg/ml X X= 0.24ml 调节剂及浓度 6-BA(0.5mg/ml) NAA(0.5mg/ml) 培养基体积终浓度 0.3L 培养基终浓度 0.3L 培养基 NO.1 0.4mg/L 0.24ml 0mg/L 0 NO.2 0.4mg/L 0.24ml 0.2mg/L NO.3 0.4mg/L 0.24ml 0.4mg/L NO.4 0.4mg/L 0.24ml 0.6mg/L NO.5 0.4mg/L 0.24ml 0.8mg/L NO.6 0.4mg/L 0.24ml 1.0mg/L

27 第四节培养基的配制与灭菌 4. 所有成分, 除蔗糖外, 可先混合在烧杯中, 将琼脂粉煮至透明 ( 注意防止沸腾, 备好冷水和滴管 ), 再将蔗糖倒入混合定容到 0.3L 5. 用 ph 试纸检测酸碱度, 如偏酸, 侧向混合液中逐滴加入 1M 的 NaOH 或 KOH 加入 2 滴碱液, 用玻棒搅匀, 用试纸检测一次至溶液 ph 值分装 : 小试管 (1/3 体积处 ) 或大试管 (1/4 体积处 ) 注意试管必须保持竖起状态用牛皮纸兜底包扎, 标明组号 7. 用锡铂纸封试管口 ; 将试管插入铁笼内, 将铁笼放入灭菌锅 8. 灭菌,121,20min 下次课备用

28 灭菌锅的使用灭菌锅型号不一样, 使用方法也不尽相同, 使用前一定要根据说明书掌握其操作方法灭菌锅一般结构 : 压力表温控面板锅底排水放气阀

29 安全阀放气阀锅盖螺栓

30 放气阀灭菌锅工作原理图安全阀放气阀水蒸气水电阻丝

32 程序设置 : 灭菌锅的使用 1. 检测水位 : 开电源, 加热程序启动前检查水位, 电子显示高水位或目测水位, 如缺水, 则添加蒸馏水如无法电显, 目测锅底有少量存水即可 2. 按循环键, 绿色数字显示为温度右边箭头为移位键上下箭头为数字调节键设置温度为再按循环键, 绿色数字显示为时间设置时间为 00: 再按循环键, 上限 ( 红数字 ) 与下限 ( 绿数字 ) 间的工作指示灯即可亮起变绿, 开始加热

33 灭菌锅的使用 1. 将待灭菌的物品放入灭菌锅盖下锅盖, 左右手同时旋紧对角的螺栓 ; 2. 加热, 开启放汽阀, 边加热边排汽, 排汽的目的是将锅内的空气全部排出, 使锅内充满水蒸气, 否则显示的温度达不到所需温度 ; 3. 当汽流连续较快喷出时, 关闭上下放汽阀 ; 4. 温度上升到时, 显示开启倒记时 ; 5. 倒记时 20 分钟后, 提示灭菌结束 ; 6. 待温度下降到时, 开锅取出灭菌物品

34 实验二母液与培养基的配制思考题 : 1. 配制 MS 大量元素的母液的过程, 容易出现的问题有哪些, 如何避免? 2. 配制 MS 培养基的过程, 容易出现的问题有哪些, 如何避免? 3. 灭菌锅的工作原理, 使用方法和注意事项

实验室常用培养基的配制方法

实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin( 氨卡青霉素 )(100 mg/ml) 100 mg/ml Ampicillin 50 ml 配制方法 1. 称量 Ampicillin 置于 50 ml 离心管中 ; 2. 加入 40 ml 灭菌水, 充分混合溶解后, 定容至 50 ml; 3. 用 0.22 µm 过滤膜过滤除菌 ; 4. 小份分装 (1 ml/ 份 ) 后,-20 保存 IPTG(

第二章生物实验基本技术规程 第二节母液的配制 南昌大学生物学实验教学中心蔡奇英 ;QQ:

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