中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(10):95~99 殏 檪檪 殏 研究简报 殏 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 殏 应用实时荧光 PCR 技术检测构巢曲霉的初步研究 1,2 刘金华 贺 2 丹 3 史艳宇 张 2 宇 王 2 丽 (1 吉林出入境检验检疫

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,008,8(10):95~99 檪檪 研究简报 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 应用实时荧光 PCR 技术检测构巢曲霉的初步研究 1, 刘金华 贺 丹 3 史艳宇 张 宇 王 丽 (1 吉林出入境检验检疫局长春 吉林大学基础医学院病原生物学教研室长春 13001) (3 吉林省产品质量监督检验研究院长春 1300) 摘要目的 : 根据构巢曲霉 (Aspergilusnidulans)3 磷酸甘油醛脱氢酶 (glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,gapdh) 基因特异位点设计并合成 Taqman 探针及引物, 建立构巢曲霉实时荧光 PCR 检测方法 方法 : 应用 lasergene7.1 软件对构巢曲霉与 13 种常见曲霉主要包括黑曲霉 (A. niger) 烟曲霉 (A.fumigatus) 杂色曲霉 (A.versicolor) 土曲霉 (A.terus) 黄曲霉 (A.flavus) 温特曲霉 (A.wenti) 寄生曲霉 (A.parasiticus) 泡盛曲霉 (A.awamori) 米曲霉 (A.oryzae) 棒曲霉 (A.cavatus) 赤曲霉 (A.ruber) 亮白曲霉 (A.ochraceus) 及赭曲霉 (A.ochraceus) 进行 GAPDH 基因序列比对分析, 在特异位点设计引物和探针, 建立构巢曲霉实时荧光 PCR 检测方法, 并对该方法进行特异性及敏感性分析 结果 : 用曲霉属 种 41 株不同曲霉及其他属的 1 株病原真菌验证实验表明, 所建立的荧光 PCR 方法特异性强 ; 检测灵敏度可达 μg/ml 的模板 DNA 结论 : 应用实时荧光 PCR 技术能够有效检测构巢曲霉, 该方法具有特异 灵敏 快速等特点, 可在实际工作中应用 关键词构巢曲霉实时荧光 PCR 检测中图分类号 Q93 构巢曲霉 (Aspergilusnidulans) 是遗传学和生物化学研究得最广泛的生物之一 [1,], 常被用来做基因功能鉴定和蛋白质相互作用研究的模式生物 [3,4] 构巢曲霉经常污染粮食和食品, 而且有 80% 以上的菌株产毒 构巢曲霉在一定环境下产生的杂色曲霉毒素 IVa, 是毒性最强的真菌毒素之一 [5], 其致癌性仅次于黄曲霉毒素 因此, 构巢曲霉是工业 农业生产中经常检验的霉菌之一 构巢曲霉传统的检验鉴定常采用培养法, 根据结构形态学特征来进行判定, 该方法检测周期长, 受个人经验等主观因素影响多, 不能快速有效地对构巢曲霉进行鉴定 本实验以构巢曲霉的 3 磷酸甘油醛脱氢酶 (Glyceraldehyde 3 phosphatedehydrogenase,gapdh) 基 因为目的基因 [6], 根据其特异位点设计引物及探针, 建立了实时荧光 PCR 方法来检测构巢曲霉, 并对方法的特异性及灵敏性进行了验证 1 材料与方法 1.1 供试菌株及培养条件供试菌株分别购自中国普通微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC) 及中国工业微生物菌种保藏中心 (CICC), 其中黑曲霉 ATCC16888 ATCC16404 购自上海汉尼公司 其他菌株来自吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室菌种保藏中心 (JLCC) 及本实验室从送检样品中分离并保藏的菌株 (JLCIQ), 具体试验菌株目录见表 1 收稿日期 : 修回日期 : 国家质检总局科研计划资助项目 (007IK150) 电子信箱 :liujinhua01@yahoo.com.cn

2 96 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.8No 表 1 试验菌株及其编号 Table1 thetestingfungistrainsusedforreal timepcr 序号菌种名称菌种拉丁名菌种编号 1 构巢曲霉 A.nidulans CICC438,CICC198,CICC88,JLCIQ36,JLCIQ45, JLCIQ156,JLCIQ343,JLCC3076,JLCC30347 黑曲霉 A.niger ATCC16888,ATCC16404,JLCC 烟曲霉 A.fumigatus CGMCC3.5305,CGMCC3.5835,JLCC30361,JLCC 杂色曲霉 A.versicolor CICC89,CGMCC 土曲霉 A.tereus CGMCC3.4341,JLCC 黄曲霉 A.flavus CGMCC3.4409,CICC393,JLCC 温特曲霉 A.wenti CICC15 8 寄生曲霉 A.parasiticus CICC310,CICC175 9 泡盛曲霉 A.awamori CICC 米曲霉 A.oryzae CICC11 11 棒曲霉 A.clavatus CICC 赤曲霉 A.ruber CICC 亮白曲霉 A.candidus CICC 赭曲霉 A.ochraceus CICC40330,CICC 灰绿曲霉 A.glaucus CICC 棘孢曲霉 A.aculeatus CICC 宇佐美曲霉 A.usami CICCC 褐单梗曲霉 A.brunneo uniseriatu CICC 臭曲霉 A.foetidus CICC045 0 栖土曲霉 A.tericola CICC 日本曲霉 A.japonicus CICC43 冠突曲霉 A.cristatus CICC4 3 白色念珠菌 Candidaalbicans JLCC30364,JLCIQ390,JLCIQ340 4 桔青霉 P.chrysogenum JLCIQ459,JLCIQ431 5 近平滑念珠菌 Candidaparapsilosis JLCC 克柔念珠菌 Candidakrusei JLC 甄氏外瓶霉 Exophialajeanselmeis JLCC 裴氏着色霉 Eonsecaeapedrosoi JLCC 茄病镰刀菌 Fusariumsolani JLCC 茄病镰刀菌 Fusariumsolani JLCC 禾谷镰刀菌 Fusariumgraminearum JLCIQ 试剂及培养基马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基 ( 北京路桥技术有限公司 );DNA 提取试剂盒 (AxyPrep TM Multisource GenomicDNA MiniprepKit,AXYGEN 公司 ); 引物及 Taqman 探针合成于宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ;Real timepcr 扩增试剂盒 (JumpStart TM TaqReadyMix TM For QuantitativePCR,Sigma 公司 ) 1.3 仪器设备高速冷冻离心机 (SIGMA3K30, 德国西格马公司 );ABIPrism7000SequenceDetectionSystem ( 美国 ABI 公司 ); 微量移液器 (0.1~1000μlBIOHIT, 芬兰 ); 霉菌培养箱 (MJ 180BS Ⅱ 型, 上海新苗医疗器械制造有限公司 ); 核酸蛋白分析仪 ( GeneSpecV,Hitachi NaKainstrumentsCo.Ltd. 日本日立公司 ) 1.4 DNA 提取所有试验菌株均在 PDA 培养基上 8 培养 7h, 用于 DNA 提取 在无菌条件下用接种环刮取少量菌丝体于预先加入提取液的 1.5ml 离心管中, 用试剂盒附带的研磨杵将菌丝体捣散, 然后按试剂盒说明进行 DNA 提取 1.5 设计引物及 Taqman 探针应用 lasergene7.1 软件对构巢曲霉 GAPDH 基因序列 (GenBankaccesionNO.M33539) 与其他 13 种常见曲霉主要包括黑曲霉 (A.niger) 烟曲霉 (A. fumigatus,) 杂色曲霉 (A.versicolor) 土曲霉 (A. terus) 黄曲霉 (A.flavus) 温特曲霉 (A.wenti) 寄生曲霉 (A.parasiticus) 泡盛曲霉 (A.awamori) 米曲霉 (A.oryzae) 棒曲霉 (A.cavatus) 赤曲霉 (A.ruber) 亮

3 008,8(10) 刘金华等 : 应用实时荧光 PCR 技术检测构巢曲霉的初步研究 97 白曲霉 (A.candidus) 及赭曲霉 (A.ochraceus)GAPDH 基因序列进行比对分析, 应用 primerexpres.0 软件针对构巢曲霉 GAPDH 基因特异位点设计实时荧光 PCR 引物及探针 1.6 Real timepcr 反应体系 Real timepcr 反应体系 : JumpStartTaqReady Mix(0mmol/LTris HCl,pH8.3,100mmol/LKCl,3 mmol/lmgcl,0.00% gelatin,0.4mmol/lofeachdn TP,stabilizers,0.06U/μlTaqDNAPolymerase,JumpStart Taqantibody)10μl, 引物 GAPDH F(10μmol/L)1μl, 引物 GAPDH R(10μmol/L)1μl, 探针 (10μmol/L) 1μl, 模板 DNA1μl,ddH O 补足体积到 0μl 实时荧光 PCR 反应条件 :95 min;95 10s,60 1min, 45 个循环 在 ABIPrism7000SeqenceDtectionSystem 仪器上进行扩增反应 反应结束后, 仪器自动给出荧光信号增长曲线, 根据荧光信号是否呈指数增长及其 Ct 值来判断扩增结果 1.7 Real timepcr 方法的敏感性分析 对构巢曲霉基因组 DNA 进行系列 10 倍倍比稀释, 分别用不同浓度的 DNA 做模板进行 Real timepcr 扩增, 判断该检测方法的敏感性 1.8 Real timepcr 的特异性分析选择 41 株亲源关系较近的常见曲霉及其他属 1 株常见病原真菌进行 DNA 提取, 作为实时荧光 PCR 反应模板进行扩增 ( 表 1), 进行特异性验证分析 结果与分析.1 引物及 Taqman 探针的设计构巢曲霉与 13 种常见的亲源关系较近的曲霉 GAPDH 部分基因片段的比对结果如图 1 所示, 图中所示区域核苷酸序列变化较大, 可用作引物及 Taqman 探针设计的特异位点 应用 primerexpres.0 软件设计引物序列,GAPDH F:ggctacaccgaggacgacat, 下游引物序列 GAPDH R:cccgcctagcatcgaaga,Taqman 探针序列 : FAM tcaacggtgacacccgctct TAMRA 图 1 构巢曲霉与 13 种曲霉 GAPDH 基因部分序列比对结果 Fig.1 Multiple nucleotide sequencealignmentofgapdh genesof13aspergilusspecies (ThelocationsofPCRprimersandhybridizationprobesareunderlined). Real timepcr 的敏感性分析用核酸蛋白分析仪测量构巢曲霉标准菌株 DNA 含量后, 进行 10 倍倍比稀释, 分别作为 Real timepcr 扩增模板, 结果显示 μg/ml 的 DNA 能够被扩增, 而更低的稀释度没有信号增长 ( 图 ).3 Real timepcr 的特异性分析对曲霉属 个种的 41 株菌及其他属的 1 株病原真菌做了特异性验证, 结果显示, 该引物和探针只对构巢曲霉产生扩增, 而其他曲霉均未有扩增, 与其他菌属包括念珠菌属 镰刀菌属等菌株也未发生交叉反应 将该引物探针序列通过 NCBI 网站 blast 程序比对, 除构巢曲霉外未发现与该序列相似性较高的菌株, 表明 该引物与探针的特异性较强, 适合于构巢曲霉的检测 3 讨论 传统的曲霉鉴定方法是根据曲霉的菌落形态和微观形态特征来进行鉴定, 这也是目前最常用的方法之一 [7] 但同一曲霉在不同的培养基或培养条件下显示的形态特征有所不同, 一般需要根据霉菌的特性选择两种或两种以上的培养基, 在不同的温度 不同的时间进行培养, 同标准菌株图谱进行比较, 并与微观结构的观察结果相结合, 才能得到准确的鉴定结果, 整个检测与鉴定过程操作繁琐, 所需时间长, 且需要一定的经验积累, 已不能满足实际工作需要

4 98 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.8No 也可应用于临床侵袭性曲霉感染菌种的快速鉴定 实时荧光 PCR 技术能够灵敏 快速 特异地检测构巢曲霉, 与其他检测技术相比具有较大优势, 但对于样品中曲霉基因组如何有效提取 怎样简化检测步骤 如何避免假阳性结果等方面还有待于进一步的研究 参考文献 图 构巢曲霉 real timepcr 检测扩增曲线 Fig Amplificationcurveofreal timepcr fordetectiona.nidulans 1: ;: ;3: ;4: ; 5: ;6: (μg/ml) 本实验根据 GAPDH 基因建立了应用实时荧光 PCR 技术特异检测构巢曲霉的方法 GAPDH 广泛存在于众多生物体中, 具有高度种属保守序列, 常被用作基因分析的模型及细胞组成和遗传信息表达研究的工具 本实验首次将其作为菌种检测与鉴定的靶序列, 通过对构巢曲霉与其亲缘关系较近的 13 种不同曲霉的 GAPDH 基因进行比对分析, 发现该基因某些区域存在一定的种间变异, 并据此设计了构巢曲霉的特异引物及探针, 建立了实时荧光 PCR 技术检测构巢曲霉的方法 并对该方法进行了特异性及灵敏性分析 结果表明该方法能够对构巢曲霉进行特异检出, 与其他亲源关系较近的菌株无交叉反应 同时, 该检测方法灵敏度较高, 能够检出 μg/ml 的 DNA, 能够满足实际工作对构巢曲霉痕量检测的需要 该检测方法速度快, 操作简便, 特异性强, 克服了传统检测方法要求检测人员具有很高的技术水平和丰富经验等缺点 除此以外, 该方法在构巢曲霉特异检测方面的应用, 对于食品工业中安全使用菌株的筛选, 食品中常见产毒真菌的鉴定, 对减少食品发酵工业中真菌频频发生的错误鉴定事件等都具有积极意义 同时, 该技术 [1]MalavaziI,LimaJF,deCastroPA,etal.Geneticinteractions oftheaspergilusnidulansatmaatm homologwithdiferent componentsofthedna damageresponsepathway.genetics, 008,178:675~691 []YamazakiH,TanakaA,KanekoJ,etal.Aspergilusnidulans ChiA is a glycosylphosph atidylinositol (GPI) anchored chitinasespecificalylocalizedatpolarizedgrowthsites.fungal GenetBiol,008,45(6):963~97 [3]HelgaDavid,Ilknur?z elik,geraldhofmann,etal.analysisof Aspergilusnidulansmetabolism atthe genome scale.bmc Genomics,008,9(163):1~15 [4]MichaelJHynes,SandraLMuray,GilianSKhew,etal. Geneticanalysisoftheroleofperoxisomesintheutilizationof acetateandfatyacidsinaspergilusnidulans.genetics,008, 178:1355~1369 [5]TakeshitaN,OhtaA,HoriuchiHcsm A.A geneencodinga clasv chitinsynthasewithamyosinmotor likedomainof Aspergilusnidulansistranslatedasasinglepolypeptideand regulatedinresponsetoosmoticconditions.biochem Biophys ResCommun,00,98:103~109 [6]BrownVM,KrynetskiEY,KrynetskaiaNF,etal.A novel CRM1 mediated nuclear export signal governs nuclear accumulation of glyceraldehydes 3 phosphate dehydrogenase folowinggenotoxicstres.jbiolchem,004,79(7):5984 ~599 [7]NaimehTaheri Talesh,TetsuyaHorio,LidiaAraujo Bazan,et al.thetipgrowthapparatusofaspergilusnidulans.molecular BiologyoftheCel,008,19:1439~1449

5 008,8(10) 刘金华等 : 应用实时荧光 PCR 技术检测构巢曲霉的初步研究 99 DevelopmentofaReal timepcrmethodtodetectaspergilusnidulans LIUJin hua 1, HEDan SHIYan yu 3 ZHANGYu WANGLi (1JilinEntry exitinspectionandquarantinebureau,changchun 13006,China) (PathogenicMicroorganismDepartment,BasicMedicalColegeofJilinUniversity,Changchun 13001,China) (3JilinProductQualitySupervisionInspectionInstitution,Changchun 1300,China) Abstract Objective:A real timepcr methodforthedetectionofaspergilusnidulanswasdeveloped. Methods:Multiplenucleotidesequencealignmentof13 Aspergilusspeciesshowshigh variation in partial sequenceofglyceraldehyde 3 phosphatedehydrogenasegene(gapdhgene).baseonthevariationregionthe primersandtaqmanprobesweredesignedforspecificdetectingaspergilusnidulansspecie.thespecificand sensitivityofthereal timepcrwastested.results:41aspergilusisolatesand1othersgenusfungiwereused, nocros amplificationwasobserved.thelowestdetectionlimitsofthereal timepcrareprovedbythesensitivity testing, μg/mlofthea.nidulansdnatemplatecanbeamplifiedsuccesfuly.conclusion:real timepcrisatime eficient,specificalymethod,itisanoveltoolforidentifyinganddeterminingthestrainofa. nidulans,andmaybeusefulfordetectingandidentifyingaspergilusnidulansspecie. Keywords Aspergilusnidulans Real timepcr Detection

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