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1 Transcription factor Foxm1 in lung development and cancer 清華大學生物科技所王翊青老師 在哺乳類細胞中, 有多達五十幾種 Forkhead box (Fox) 基因轉錄因子家族蛋白 這些蛋白透過相似的氨基酸序列與基因 promoter DNA 結合, 並參與調控細胞分裂 分化 細胞轉型癌化及老化等過程 其中,Forkhead Box 家族中的成員 M1 亞型 (FOXM1) 蛋白表現於生長分裂中的細胞, 並且調控細胞週期 G1/S 與 G2/M 進程, 以及相關基因的轉錄表現, 這些基因包括有 JNK1, ATF2, DNA Topoisomerase IIa, Cks1, Skp2, Cdc25B, Plk-1, Aurora B 及 CenpA/B/F 等等 ( 圖一 ) 我們過去的研究中利用 RNAi 抑制細胞中 Foxm1 基因的表現量, 會使細胞週期停滯在 G1 或 G2 期, 造成細胞分裂速度減緩, 並且因胞質分裂缺失而產生 DNA 多倍體 若將小鼠胚胎成纖維母細胞 (MEFs) 中的 Foxm1 基因利用 Cre-LoxP 方式剔除後, 除了會阻斷細胞分裂, 且會引發 p27 Kip1 p21 Cip1 與 Ink4 locus 的 p19 ARF 及 p16 Ink4a 等蛋白的表現量增加, 促使培養中的正常細胞早衰進入老化 因此, 我們認為細胞的複製與分裂需要 Foxm1 蛋白 11

2 圖一 12

3 Foxm1 與肺癌形成 先前的研究指出諸多癌症中, 如肝癌 肺癌 大腸直腸癌 胰臟癌 乳癌 卵巢癌等等,Foxm1 表現量均大量增高, 且與癌化程度呈現正相關 我們過去利用 SPC-rtTA/tetO-Cre/Foxm1 fl/fl 基因剔除小鼠結合癌症模式, 發現從肺臟上皮細胞中剔除 Foxm1 基因, 可顯著地抑制 urethane 或 MCA/BHT 誘發肺腺瘤 若改變腫瘤誘發的實驗程序, 使 SPC-rtTA/tetO-Cre/Foxm1 fl/fl 小鼠先受到化學致癌物誘導形成肺腫瘤後, 再誘發 Foxm1 基因專一性剔除, 同樣地可以減少肺腫瘤生長, 因此推論在活體中,Foxm1 為腫瘤起始及癌化進程所必需 在臨床上,10~30% 的人類非小細胞肺癌具有 Kras 基因點突變, 而前述 urethane 致癌物所引發的小鼠肺臟腺瘤經分析後, 約有半數也具有 Kras 基因獲得功能突變 (gain-of-function function mutation), 因此我們進一步運用 SPC-rtTA/tetO-Cre/tetO-Kras G21D /Foxm1 fl/fl 小鼠模式的初步研究顯示,Foxm1 為致癌 Kras 訊號傳遞路徑的重要的下游, 剔除 Foxm1 基因抑制 Kras G21D 誘發腫瘤形成 我們另外利用基因轉殖模式, 於 SPC-rtTA/tetO-Foxm1-ΔN 小鼠肺臟上皮細胞中表現活化態的 Foxm1 肺臟上皮細胞層因此增生 (hyperplasia), 但尚不足以引發腫瘤形成 ; 但與致癌 Kras G12D 轉殖基因共同表現時,Foxm1 則會使 Kras G12D 誘發的肺腫瘤快速生長 目前實驗室運用基因轉殖與基因剔除等小鼠動物模式, 致力於了解活體中 Foxm1 蛋白在致癌基因 Kras 調控訊號傳遞路徑中的角色 同時發展以抑制癌細胞中 Foxm1 基因表現及蛋白活性控制癌細胞生長, 希望成為將來治療癌症新策略的參考 13

4 Foxm1 與肺臟發育 在小鼠胚胎發育初期, 將 Foxm1 基因進行全身性剔除, 會造成小鼠成肝細胞及心肌細胞的分裂缺失, 導致胚胎出現肝臟 心臟等器官發育缺失, 造成死胎 我們發現 Foxm1 mrna 的表現量在小鼠肺臟發育早期的 embryonic pseudoglandular 及 canalicular 等階段均高, 但隨著肺臟進入到成囊化 (sacculation) 時期, 細胞的生長速度驟降, 且 Foxm1 表現量只剩約 5~10%, 因此我們推測 Foxm1 與肺臟細胞生長與分化調控可能相關 我們於是將發育中的小鼠肺臟上皮細胞中誘發活化態的 Foxm1 表現 (SPC-rtTA/tetO-Foxm1- ΔN), 發現胚胎肺臟上皮細胞增生並伴隨著肺臟成囊化缺失 此一肺臟成囊化缺失的現象與活化態的 Kras G12D 轉殖基因 (SPCrtTA/tetO-Kras G12D ) 所造成的表現型類似 相反地, 在 SPCrtTA/tetO-Kras G12D /TetO-Cre/Foxm1 fl/fl 小鼠中剔除 Foxm1 基因, 則可減緩由 Kras G12D 造成的肺臟上皮層結構性缺失, 再次證明 Foxm1 為 Kras 的重要下游調控因子 令我們感到意外的是條件式剔除 Foxm1 基因, 小鼠胚胎肺臟上皮細胞仍然會複製分裂, 這與肺癌細胞的反應明顯不同 ; 有趣的是我們發現剔除 Foxm1 基因時, 肺臟上皮細胞中另一與調控細胞分裂相關的 Wnt 訊號路徑則被活化, 可能因此代償 Foxm1 缺失 另一方面, 是否 Foxm1 具有抑制 canonical Wnt signaling 的功能? 我們進而以 SPC-rtTA/tetO-Foxm1/TOPGAL 小鼠模式實驗發現, 當胚胎肺臟上皮轉殖表現 Foxm1, 則會抑制 canonical Wnt reporter 的表現 透過 mrna qrt-pcr 及 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) 分析, 證明 Foxm1 蛋白可直接與 Axin2 及 JNK1 基因啟動子 DNA 結合, 並活化基因轉錄 已知 Axin2 蛋白會抑制 β-catenine 蛋白的穩定性, 進而降低由 β-catenine 進入細胞核中進行基因轉錄調控 而 JNK non-canonical 訊號路徑, 則會抑制 canonical Wnt 訊號路徑 同樣地, 於 SPC-rtTA/tetO- Kras G12D /TOPGAL 小鼠肺臟上皮細胞層表現活化的 Kras G12D, canonical Wnt 也受到抑制 我們因此認為, 胚胎發育時期肺臟上皮細胞中的 Foxm1 蛋白參與協調 Kras 與 canonical Wnt 訊號傳遞路線 ( 圖二 ), 基因表現量需應受到精確的調控 14

5 圖二 15

6 分子遺傳實驗室簡介 王翊青老師自 2001 年進入美國伊利諾大學芝加哥分校就讀博士學位, 研究基因轉錄因子 ForkheadBoxM1(FOXM1) 如何調控細胞週期與細胞生長癌化 2006 年起分別在伊利諾大學芝加哥分校 芝加哥大學 辛辛那提兒童醫院醫學中心等單位繼續博士後研究,2012 年 8 月進入清華大學生物科技所任職助理教授, 教授小鼠模式生物醫學研究等課程, 並運用基因轉殖與剔除小鼠動物模式, 進行肺臟發育 損傷修補與肺癌等相關基礎研究 目前實驗室 ( 圖三 ) 專注於研究與細胞生長密切相關的 Foxm1 基因轉錄因子, 希望了解 Foxm1 蛋白調控的下游基因網路在小鼠胚胎發育及細胞癌化過程中的角色 ( 圖三 ) 王翊青老師實驗室部分成員 : ( 左起 ) 王翊青 趙盛揚 黃櫛蓉 簡歆志 邱怡宣 李芸菁 16

7 參考文獻 1. I. C. Wang et al., Forkhead Box M1 Regulates the Transcriptional Network of Genes Essential for Mitotic Progression and Genes Encoding the SCF (Skp2-Cks1) Ubiquitin Ligase. Mol Cell Biol 25, (Dec, 2005). 2. I. C. Wang et al., Deletion of Forkhead Box M1 transcription factor from respiratory epithelial cells inhibits pulmonary tumorigenesis. PLoS One 4, e6609 (2009). 3. I. C. Wang et al., Foxm1 Mediates Cross Talk between Kras/Mitogen-Activated Protein Kinase and Canonical Wnt Pathways during Development of Respiratory Epithelium. Mol Cell Biol 32, 3838 (Oct, 2012). 4. I. C. Wang et al., Increased expression of FoxM1 transcription factor in respiratory epithelium inhibits lung sacculation and causes Clara cell hyperplasia. Dev Biol 347, 301 (Nov 15, 2010) 王翊青老師於台大醫學院演講 17

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