260 WORLDCHINESEMEDICINE February208,Vol.3,No.2 与多种中药活性成分的生物合成过程 [9 0] 鲨烯环氧化酶也属于单加氧酶, 它是三萜和甾醇生物合成上的关键酶基因, 它的活性和功能影响着三萜和甾醇的生物合成鲨烯在鲨烯环氧化酶和其辅酶细胞色素 P450

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钿普孔
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1 世界中医药 208 年 2 月第 3 卷第 2 期 259 雷公藤单加氧酶基因全长克隆及表达分析周家伟刘雨佳胡添源张逸风高伟 2 黄璐琦 ( 首都医科大学中医药学院中医络病研究北京市重点实验室, 北京,00069;2 中国中医科学院中药资源中心道地药材国家重点实验室培育基地, 北京,00700) 摘要目的 : 单加氧酶 (Monooxygenase,MO) 是一类通过在底物上加一个氧原子的加氧酶, 在动植物体内参与多种代谢途径本实验致力于从雷公藤转录组数据中克隆得到单加氧酶基因 cdna 全长, 并对克隆得到的 MO 基因进行初步的功能分析方法 : 通过对雷公藤转录组数据中筛选得到 MO 基因片段设计特异性引物, 克隆 MO 基因 cdna 全长, 通过生物信息学方法对得到的 MO 基因进行分析, 主要包括多重序列比对, 蛋白结构预测和构建进化树分析等结果 : 根据分析结果 TwMO 基因全长为 293bp, 共编码 507 个氨基酸, 等电点为 8 84, 相对分子质量为 55 20kDa, 多重序列比对显示它与其他植物的 MO 基因具有较高的同源性雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯 (MeJA) 诱导后, 实时荧光定量结果显示,Tw MO 的表达量明显增加, 并在 48h 达到最高, 提示 TwMO 基因与雷公藤的次生代谢产物的生成有关结论 : 本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到 MO 基因, 为进一步研究该基因的功能奠定基础关键词雷公藤 ; 克隆 ; 基因 ; 单加氧酶 ; 表达分析 CloningandmRNAExpresionAnalysisofMonooxygenaseGenefrom Tripterygium wilfordi ZhouJiawei,LiuYujia,HuTianyuan,ZhangYifeng,GaoWei,HuangLuqi 2 (KeyLaboratoryofColateralDiseases,SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity, Beijing00069,China;2StateKeyLaboratoryofDao diherbs,nationalresourcecenterforchinese MateriaMedica,ChineseAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing00700,China) Abstract Objective:Monooxygenase(MO)isakindofenzymesthatcanincorporateoneatomofoxygenintothesubstratesin manymetabolicpathways.thisstudyaimedtoclonetheful lengthcdnaofamofromthetranscriptomedataoftripterygiumwil fordiandanalyzeitsfunction.methods:theful lengthcdnaofmonooxygenase(twmo)wasclonedfromthetranscriptomedata oftripterygiumwilfordibydesigningspecificprimers.thetwmogenewasthenanalyzedbyaseriesofbioinformaticsanalysis. Results:ItshowedthatthefullengthofTwMOcDNAwas293bpencoding507aminoacids.Thetheoreticalisoelectricpointwas 8 84andthemolecularweightwasabout55 20kDa.SequencealignmentandphylogeneticanalysisdemonstratedthatTwMOhad relativecloserelationshiptomofromotherspeciesofplants.therelativeexpresionleveloftwmoaftermejainducingwasup regulatedandhighestat48h,whichsuggesteditsregulatoryroleinspecialmetabolitesbiosynthesis.conclusion:thisworklaidthe foundationforfurtherstudyingthefunctionofthismonooxygenaseintripterygiumwilfordi. KeyWords Tripterygiumwilfordi;Clone;Gene;Monooxygenase;Expresionanalysis 中图分类号 :R284 文献标识码 :A doi:0.3969/j.isn 雷公藤 (Tripterygium wilfordihook f ) 为卫矛科 (Celastraceae) 雷公藤属植物, 其干燥根或根的木质部作为中药雷公藤使用中药雷公藤在我国具有悠久的用药历史 [], 其具有祛风除湿通络止痛解毒杀虫消肿散结等功效 [2] 雷公藤中的活性成分主要分为萜类和生物碱类, 现代药理研究表明雷公藤中的有效成分如雷公藤甲素和雷公藤红素等具有抗肿瘤 [3] [4] [5], 抗炎抗风湿和神经营养活性等作用, 另有研究报道雷公藤红素可以使正常肥胖小鼠体质量下降 45%, 从而达到减肥的作用 [6] 雷公藤红素和雷公藤甲素与青蒿素辣椒素和姜黄素被列为最有可能被开发成为现代药物的 5 种传统天然药用化合物 [7] 加氧酶属于氧化还原酶类, 可以分为双加氧酶和单加氧酶单加氧酶也称作羟化酶或羟氧酶, 可以使底物和一个氧原子结合, 而另一氧原子在氢供体 (NADPH 等 ) 的作用下生成水 [8] 细胞色素 P450 属于单加氧酶中的一类, 它参与多种体内代谢过程, 与药物和毒物的代谢密切关系此外,P450 家族基因对中药中的活性成分的合成起着关键的作用, 参基金项目 : 十三五时期北京市属高校高水平教师队伍建设支持计划项目 (CIT&TCD ); 市教委科技 + 社科计划重点项目 (KZ ); 国家自然科学基金面上项目 ( ) 作者简介 : 周家伟 ( ), 男, 博士研究生在读, 研究方向 : 天然药物学,E mail:jiaweizhou@ccmu edu cn 通信作者 : 高伟 ( ), 男, 博士, 教授, 研究方向 : 中药资源与分子生药学,E mail:weigao@ccmu edu cn

2 260 WORLDCHINESEMEDICINE February208,Vol.3,No.2 与多种中药活性成分的生物合成过程 [9 0] 鲨烯环氧化酶也属于单加氧酶, 它是三萜和甾醇生物合成上的关键酶基因, 它的活性和功能影响着三萜和甾醇的生物合成鲨烯在鲨烯环氧化酶和其辅酶细胞色素 P450 还原酶 (CytochromeP450 Reductase, CPR) 的作用下生成环氧鲨烯 [], 环氧鲨烯再进一步转化为三萜或甾醇类物质在植物中, 鲨烯环氧化酶通过影响植物的甾醇和三萜类活性成分的合成进一步影响植物的生长和发育以及应对生物和非生物的压力研究表明在拟南芥中发现的环氧鲨烯酶 SE 基因影响着拟南芥的根和种子的发育而 SE3 基因影响胚芽的发育和大小 [2 3] 鉴于单加氧酶对药用植物的生长发育和中药活性成分生物合成的重要性, 本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到一条 MO 基因, 该基因全长 293 bp, 具有完整的开放阅读框, 共编码 507 个氨基酸通过生物信息学分析, 初步分析了该基因编码蛋白的生物学功能此外, 本文研究了 TwMO 基因在茉莉酸甲酯诱导下的表达方式, 为进一步研究 TwMO 基因在雷公藤中的作用奠定基础仪器与试药仪器 2 6K 型低温冷冻离心机 (Sigma 公司 ),MM400 型混合型球磨仪 (Retsch 公司 ),Veriti TM 96 孔梯度 PCR 仪 (ABI 公司 ),GBOXHR 型紫外凝胶成像分析仪 (Syngene 公司 ),QuantStudio5Real TimePCRSystem(ABI 公司 ) 等 2 试剂琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 (Thermo 公司生产 ),FastQuantcDNA 第一链合成试剂盒快速小提质粒试剂盒和 RNA 纯化试剂盒 ( 天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司生产 ),Easytaq 酶 ( 北京全式金生物技术公司生产 ),Eastep Super 总 RNA 提取试剂盒 ( 上海普洛麦格生物产品有限公司生产 ), PrimeScriptstStrandcDNASynthesisKit( 宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司生产 ),2xPhusionHFPCRMaster Mix(NEB 公司生产 ),KAPA SYBR FASTqPCR KitMasterMix(2X)Universal 试剂盒 (Kapabiosystems 公司生产 ) 菌株和质粒 :Trans T 感受态细胞 peasy BluntZerovector( 北京全式金生物技术有限公司生产 ) 3 分析样品雷公藤悬浮细胞由本实验室继代保存 [4] 2 方法与结果 2 雷公藤总 RNA 的提取和精制将雷公藤悬浮细胞加入茉莉酸甲酯 (MeJA) 诱导 ( 终浓度为 50 μm), 分别于诱导后 h 取材, 液氮速冻后存于 -80 冰箱取各诱导时间点雷公藤悬浮细胞 0 4~0 6g, 液氮环境下研磨粉碎采用 Eastep Super 总 RNA 提取试剂盒提取 3 个时间点悬浮细胞的总 RNA, 用 RNA 纯化试剂盒对提取的总 RNA 进行精制通过凝胶电泳检测 RNA 的质量 2 2 TwMOcDNA 全长克隆 cdna 第一链以精制后的总 RNA 为模板, 通过 SMARTer TM RacecDNA, AmplificationKit 试剂盒反转录后得到根据雷公藤转录组数据注释, 筛选出 MO 基因片段, 对 MO 基因片段设计特异性扩增引物见表以获得的 cd NA 第一链为模板, 在 Veriti TM 96 孔梯度 PCR 仪上进行全长扩增 50μL 的反应体系 :μl 模板 DNA 25 μl 的 2xPhusionHFPCRMasterMix 2 5μL 的正向引物 2 5μL 的反向引物 ddh 2 O 补足至 50μL PCR 反应条件为 :98 30s;98 0s,55 5s, 72 90s,35 个循环 ;72 5min PCR 产物通过凝胶电泳分离后, 目标条带用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒进行回收, 取 μlpeasy BluntZero 载体与 4μL 回收产物在 PCR 仪中 25 反应 5min 后, 将连接产物与 50μL 的 Trans T 感受态细胞混合, 冰浴 30min 后,42 水浴 45s, 冰浴 2min 后加入 500μL 的 LB 培养基,37,80 转培养 h, 涂布于 LB+ 氨苄培养基上 37 培养过夜单克隆菌经菌液 PCR 鉴定后, 阳性克隆送公司测序 ( 北京睿博兴科生物技术有限公司生产 ), 由测序结果获得 TwMO cdna 全长序列 2 3 雷公藤 TwMO 基因生物信息学分析将测序得到的 TwMO 序列结果在 NCBI(htp:// www ncbi nlm nih gov/) 上 Blast 搜索蛋白质和核苷酸数据库, 并在 ORF Finder (htp:// www ncbi nlm nih gov/gorf/gorf html) 上查找开放阅读框 (ORF) 和翻译成氨基酸序列主要采用一些网上软件包进行生物信息学分析 [5], 如采用 Inter pro(htp://www ebi ac uk/tools/interproscan/) 进行结构域比对,ExPASy 在线服务器的 ComputePI/ Mw(htp://web expasy org/compute_pi/) 预测理论等电点与相对分子量,TRMHMMserverv2 0(htp:// www cbs dtu dk/services/tmhmm 2 0/) 进行跨膜域分析, SWISSMODEL ( htp:// swismodel expasy org/) 进行三维同源建模用 DNAMAN 软件 ClustalW 软件和 MEGA6 软件分别对 TwMO 基因所编码的氨基酸序列进行多重比对, 与其他来源的 MO 氨基酸序列进行比较和构建

世界中医药０８年月第３卷第期６Ｎｈｂｊ系统进化树ｈ７５相似与没药叶天竺葵Ｐｍ４雷公藤ＴｗＭＯ基因的表达分析雷公藤悬浮ｍｙｈｆｍ７５相似等Ｉ结构域分析结果细胞经茉莉酸甲酯诱导后取不同诱导时间点０４显示ＴｗＭＯ有与ＡＤ结合有关的ＡＤＮＡＤＰ４４８７ｈ的雷公藤悬浮细胞采用ＲＮＡ提取６３７４４５功能域见图

ｘＭＭｘ０μＬＤＮＡμＬ正反引物０ｍｍｈｍＡＫ４３６８马德拉老鹳草ＧｍｍＬ各０４μＬＰＣＲｄｗ７８μＬ５０ＲｘｈｈｄＡＫ４３５０暗花老鹳草Ｇｍｈｍ０４μＬ反应程序为９５３ｍ９５３６０ＡＫ４３５和野大豆ＧｙｊＫＨＮ０９３６的氨３０４０个循环６５９５做溶解曲线分析反应结

3 世界中医药０８年月第３卷第期６Ｎｈｂｊ系统进化树ｈ７５相似与没药叶天竺葵Ｐｍ４雷公藤ＴｗＭＯ基因的表达分析雷公藤悬浮ｍｙｈｆｍ７５相似等Ｉ结构域分析结果细胞经茉莉酸甲酯诱导后取不同诱导时间点０４显示ＴｗＭＯ有与ＡＤ结合有关的ＡＤＮＡＤＰ４４８７ｈ的雷公藤悬浮细胞采用ＲＮＡ提取６３７４４５功能域见图ｂｄｄｍ５３３试剂盒提取不同处理时间点的悬浮细胞的总ＲＮＡＤＡＮＭＡＮ对没药叶天竺葵ＡＫ４３６４长果种用ＱＲＴＫ试剂盒反转录成ＤＮＡ以雷公麻黄ＣｈＯＭＯ８８３６土瓶草Ｃｈ藤基因作为内参进行ＴｗＭＯ基因相对表达检ｆＧＡＶ６７５５８桃蝶木天竺葵Ｐ测引物设计见表反应体系ｑＰＣＲｍｍＡＫ４３６６天竺葵ＰｍｘＭＭｘ０μＬＤＮＡμＬ正反引物０ｍｍｈｍＡＫ４３６８马德拉老鹳草ＧｍｍＬ各０４μＬＰＣＲｄｗ７８μＬ５０ＲｘｈｈｄＡＫ４３５０暗花老鹳草Ｇｍｈｍ０４μＬ反应程序为９５３ｍ９５３６０ＡＫ４３５和野大豆ＧｙｊＫＨＮ０９３６的氨３０４０个循环６５９５做溶解曲线分析反应结基酸序列进行多重序列比对结果表明ＴｗＭＯ与其束后对荧光值扩增曲线和融解曲线进行分析生物他植物的ＭＯ氨基酸序列具有较大的相似性平均ＣＴ重复和技术重复各３次采用法分析结果为８４６见图３表引物序列反应名称引物ＬＣＰＣＲＴｗＭＯ引物序列５３产物长度ｂＡＡＴＧＣＴＣＴＡＡＧＣＣＴＣＧＣＡＴ９３ＴｗＭＯＲＧＧＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＣＣＡＣＣＡＧＴＡＲＴＰＣＲＴｗＭＯＧＴＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧＣＣＧＴｗＭＯＲＣＧＡＴＧＴＴＧＣＴＡＡＡＣＴＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＲＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＣＴＧＴＴ９７８９５结果５雷公藤ＴｗＭＯ全长ＤＮＡ的获得由雷公藤转录组数据通过全长ＰＣＲ克隆得到ＴｗＭＯ基因图ＴｗＭＯ氨基酸序列保守功能域的ＤＮＡ全长序列为一条９３ｂ的ＤＮＡ特异性片段结果见图图雷公藤ＴｗＭＯ基因全长ＤＮＡ电泳检测注ＭＴＫＭｋＭＯ目的基因条带单位为ｂ５雷公藤ＭＯ基因序列分析通过ＯＲｄ在线软件对ＴｗＭＯ基因全长ＤＮＡ序列进行分析预测其共编码５０７个氨基酸且含有完整开放阅读ｄｆｍＯＲ位于４３７６６ｂ框Ｏ区域序列的４３ｂ为５ＵＲＴ７６６９３ｂ图３雷公藤ＴｗＭＯ氨基酸序列与其他植物为３ＵＲＴＢ的结果显示ＴｗＭＯ与毛果杨ＰＭＯ氨基酸序列多重序列比对７９ｈ８相似与甜橙Ｃ５３ＴｗＭＯ氨基酸序列的系统进化分析将雷相似与胡桃Ｊ７７相似与麻风树Ｊ公藤ＭＯ氨基酸序列与ＧＢｋ中其他３０种生物

4 262 WORLDCHINESEMEDICINE February208,Vol.3,No.2 的 MO 氨基酸序列进行比对分析, 在软件 MEGA6 中采用相邻连接法构建系统进化树, 进行聚类分析见图 4 TwMO 在本文所选蛋白中与土瓶草的 MO 基因亲缘关系较近雷公藤 TwMO 基因表达量迅速上调, 在 48h 达到最大, 提示该基因与雷公藤中的活性成分的生物合成相关图 6 TwMO 蛋白三级结构预测模型图 4 MO 系统进化树 TwMO 理化性质和 3D 结构预测 EsPASy 在线软件对 TwMO 氨基酸序列的理化性质分析, 结果为 TwMO 的蛋白质分子质量为 55 2kDa, 等电点为 8 84 跨膜域分析结果显示其为膜蛋白见图 5 TwMO 三维同源模型以 4n9x A 蛋白为模板构建 TwMO 蛋白的三级结构, 该蛋白三级结构预测模型见图 6 图 5 雷公藤 TwMO 蛋白跨膜分析 TwMO 诱导表达分析 MeJA 是一种广泛存在于植物中的防御激素, 已有研究报道外源添加 MeJA 可以激发植物防御基因的表达, 可以诱导植物次生代谢产物合成相关酶基因的表达, 进而提高次生代谢产物在植物体中的产量 [6 7], 使植物应对外界坏境的胁迫根据实时荧光定量 PCR 检测诱导后 TwMO 基因表达实验的数据, 采用 2 - CT 相对定量表达分析见图 7 实验发现, 经 MeJA 诱导后, 图 7 MeJA 诱导 TwMO 不同时间相对表达量 3 讨论由于单加氧酶基因不仅对植物的生长发育起着重要的作用, 同时也参与了中药活性成分的生物合成过程研究单加氧酶的生化功能有助于通过分子水平揭示药用植物中活性成分的生物合成机制本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到一条 MO 基因为了能进一步研究其具体的生化功能, 本研究通过生物信息学分析方法对其核苷酸和氨基酸序列了进行分析, 结果显示 TwMO 与已报道的 MO 基因具有很高的相似性, 并且 TwMO 具有 MOs 所共有的与 FAD 结合有关的 FAD/NAD(P) bindingdomain 功能域此外, 外源的 MeJA 激素诱导雷公藤悬浮细胞后, 实时荧光定量对 TwMO 基因的表达分析结果表明,TwMO 在诱导后呈上升的趋势, 表明其受到外源 MeJA 的调控, 可能与植物的次生代谢产物合成有关本研究克隆了 TwMO 的 cdna 全长序列并对其理化性质和具体的生化功能进行的初步预测, 为进一步研究该基因的功能奠定了基础参考文献 [] 高伟, 刘梦婷, 程琪庆, 等. 雷公藤的本草考证 [J]. 世界中医药, 202,7(6): [2] 刘为萍, 刘素香, 唐慧珠, 等. 雷公藤研究新进展 [J]. 中草药, 200,4(7): [3]YangH,ChenD,CuiQC,etal.Celastrol,atriterpeneextractedfrom

5 世界中医药 208 年 2 月第 3 卷第 2 期 263 thechinese ThunderofGodVine isapotentproteasomeinhibitor andsuppreseshumanprostatecancergrowthinnudemice[j].canc erresearch,2006,66(9): [4]AstryB,VenkateshaSH,LaurenceA,etal.Celastrol,aChineseherb alcompound,controlsautoimmuneinflammationbyalteringthebal anceofpathogenicandregulatorytcelsinthetargetorgan[j].clini calimmunology,205,57(2): [5]LuL,LiF,WangX.Novelanti inflammatoryandneuroprotectivea gentsforparkinson sdisease[j].cns& NeurologicalDisordersDrug Targets,200,9(9): [6]JunliL,JaeminL,MarioAndresSH,etal.Treatmentofobesitywith celastrol[j].cel,205,6(5): [7]CorsonTW,CrewsCM.Molecularunderstandingandmodernappli cationoftraditionalmedicines:triumphsandtrials[j].cel,2007,30 (5): [8]HarayamaS,KokM,NeidleEL.Functionalandevolutionaryrelation shipsamongdiverseoxygenases[j].annualreviewofmicrobiology, 992,46(46): [9]GuoJ,MaX,CaiY,etal.CytochromeP450promiscuityleadstoabi furcatingbiosyntheticpathwayfortanshinones[j].newphytologist, 206,20(2): [0]ZhaoQ,CuiMY,LevshO,etal.TwoCYP82DEnzymesFunctionas FlavoneHydroxylasesintheBiosynthesisofRoot Specific4 Deoxy flavonesinscutelariabaicalensis[j].molecularplant,207, (): []PorterTD.ElectronTransferPathwaysinCholesterolSynthesis[J]. Lipids,205,50(0): [2]RasberyJM,ShanH,LeclairRJ,etal.Arabidopsisthalianasqualene epoxidaseisesentialforrootandseeddevelopment[j].journalof BiologicalChemistry,2007,282(23): [3]LaranjeiraS,Amorim SilvaV,EstebanA,etal.ArabidopsisSqua leneepoxidase3(sqe3)complementssqeandisimportantfor EmbryoDevelopmentandBulkSqualeneEpoxidaseActivity[J]. 分子植物 : 英文版,205,8(7): [4] 周家伟, 刘雨佳, 胡添源, 等. 雷公藤 PTEN 基因全长克隆及表达分析 [J]. 中草药,207,48(7): [5] 胡添源, 苏平, 张逸风, 等. 雷公藤单萜合酶基因 TwMS 的克隆及蛋白表达分析 [J]. 中国中药杂志,207,42(7): [6]GeyterND,GholamiA,GoormachtigS,etal.Transcriptionalmachin eriesinjasmonate elicitedplantsecondarymetabolism[j].trendsin PlantScience,202,7(6): [7]MisraRC,GhoshS.Methyljasmonate elicitedtranscriptionalrespon sesandpentacyclictriterpenebiosynthesisinsweetbasil[j].plant Physiology,204,64(2): ( 收稿责任编辑 : 张文婷 ) ( 上接第 258 页 ) 等植物次生代谢产物生物合成途径功能基因的挖掘和功能研究中参考文献 []HusnaB,OnT,ZhuYZ.EfectsofpurifiedSalviamiltiorhizaextract oncardiacvascularsmoothmusclehypoxiccels[j].jpharmacolsci, 2007,04(3): [2]GaoHW,SunW,ZhaoJP,etal.Tanshinonesanddiethylblechnics withanti inflammatoryandanti canceractivitiesfromsalviamiltiorhi zabunge(danshen)[j].scirep,206(6): [3]ParajuliDR,ZhaoYZ,JinH,etal.Anti fibroticefectofpf240 SF,astandardizedfractionofSalviamiltiorhiza,inthioacetamide in ducedexperimentalratsliverfibrosis[j].archpharm Res,205,38 (4): [4]ChengQ,SuP,HuY,etal.RNAinterference mediatedrepresionof SmCPS(copalyldiphosphatesynthase)expresioninhairyrootsofSal viamiltiorhizacausesadecreaseoftanshinonesandshedslighton thefunctionalroleofsmcps[j].biotechnollet,204,36(2): [5]Ma Y,Ma XH,Meng FY,etal.RNA interference targeting CYP76AHinhairyrootsofSalviamiltiorhizarevealsitskeyrolein thebiosyntheticpathwayoftanshinones[j].biochem BiophysRes Commun,206,477(2): [6] 郭生虎, 王敬东, 马洪爱. 乌拉尔甘草毛状根的诱导及培养体系的建立 [J]. 西北农业学报,202,2(2):38 4. [7] 孔卫青, 杨金宏, 卢从德. 发根农杆菌诱导桑树毛状根体系的建立 [J]. 西北植物学报,200,30(): [8]GuoJ,ZhouYJ,HilwigML,etal.CYP76AHcatalyzesturnoverof miltiradieneintanshinonesbiosynthesisandenablesheterologouspro ductionofferuginolinyeasts[j].procnatlacadsciusa,203,0 (29): [9]HatlestadGJ,SunnadeniyaRM,AkhavanNA,etal.ThebeetRlocus encodesanewcytochromep450requiredforredbetalainproduction [J].NatGenet,202,44(7): [0] 胡亚忱, 曲德业. 发根农杆菌诱导植物毛状根的发生及次生代谢物生产的研究进展 [J]. 吉林师范大学学报 : 自然科学版, 2005,26():3 32,35. ( 收稿责任编辑 : 张文婷 )

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌