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漫斤宫
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1 第 40 卷第 2 期海洋学报 Vo.40,No 年 2 月 HygXubo Fbuy2018 赵家熙, 崔宝月, 董迎辉, 等. 缢蛏生长因子受体结合蛋白 2 基因克隆时空表达及 SNP 筛查 [J]. 海洋学报,2018,40(2):87 94, do: /j.ss ZoJx,CuBoyu,DogYgu,.Cog,spompoxpssodSNPsdfoofGRB2gSoovuos[J].HygXubo,2018,40(2):87 94,do: /j.ss 缢蛏生长因子受体结合蛋白 2 基因克隆时空表达及 SNP 筛查赵家熙 1, 崔宝月 2, 董迎辉 1*, 姚韩韩 1, 林志华 1 (1. 浙江万里学院浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室, 浙江宁波 ;2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 ) 摘要 : 为了探索生长因子受体结合蛋白 2(GRB2) 在缢蛏生长发育中的作用, 本实验基于缢蛏转录组文库, 利用 SMARTRACE 技术克隆缢蛏 GRB2(S-GRB2) 基因的 DNA 全长序列, 分析其在不同组织和发育时期的表达差异, 并在外显子中进行了 SNP 位点筛选结果表明,S-GRB2 基因 DNA 全长 1223bp, 开放阅读框 711bp, 编码 236 个氨基酸 ; 氨基酸序列比对发现, 缢蛏与文蛤泥蚶等双壳贝类同源性较高 (64% 59%), 而与其他物种的同源性为 45%~58%, 表明 GRB2 基因比较保守 ; 不同组织的荧光定量 PCR (qrt-pcr) 结果显示,S-GRB2 基因在缢蛏 7 个组织中均有表达, 其中足中的表达量极显著地高于其他 6 个组织 (P<0.01); 在 8 个发育时期的表达差异分析发现, 该基因在稚贝期表达量极显著地高于其他 7 个时期 (P<0.01) SNP 位点筛选结果表明, 在 S-GRB2 基因的外显子区域共发现 11 个 SNP 位点关键词 : 缢蛏 ; 生长因子受体结合蛋白 2; 克隆 ;SNP 中图分类号 :P917.4 文献标志码 :A 文章编号 : (2018) 引言生长因子受体结合蛋白 2(gowfopoboudpo2,GRB2), 是一种重要的接头蛋白, 它通过对上游受体激酶的调控参与各类细胞的信号转导, [1-3] 从而影响细胞的增殖生长分化 GRB2 蛋白由 3 个结构域 SH3-SH2-SH3 构成,SH2 与 SH3 结构域通过柔性链臂连接可增强 GRB2 蛋白的空间结构变化 [4] 以及信号传导过程的接头作用 SH2 能识别并结合富含磷酸化酪氨酸残基的蛋白 ;SH3 可与鸟嘌呤核苷酸交换因子 (SOS) 结合, 激活鸟苷三磷酸 (GTP) 传递 [5-6] 外界信号至细胞核内在高等动物中, 已有研究证明 GRB2 基因在调控生长胚胎发育等相关信号通路 [7-8] 中发挥重要作用在海洋贝类中, 已克隆出泥蚶 (Tggos) 文蛤 (Mx mx)grb2 基因 DNA 全长, 并发现该基因在各个组织与发育时期均有表达, 且在文蛤的外显子中筛选到 16 个 SNP 位 [9-10] 点缢蛏 (Soovuos) 是我国四大养殖贝类之一, 在浙闽地区养殖已有数百年历史, 具有较高收稿日期 : ; 修订日期 : 基金项目 : 国家现代贝类产业技术体系项目 (CARS-49); 浙江省农业新品种选育重大科技专项 (2016C ); 国家水产种质资源平台运行服务项目 (2018DKA30470); 宁波市自然科学基金项目 (2016C70002) 项目资助作者简介 : 赵家熙 (1993 ), 男, 浙江省台州市人, 主要从事海洋贝类分子遗传学育种研究 E-m: @qq.om * 通信作者 : 董迎辉 (1980 ), 副研究员, 硕士生导师, 主要从事贝类遗传育种研究 E-m:dogygu118@126.om

2 8 海洋学报 40 卷 [11] 的经济价值和生态价值近年来, 虽然缢蛏人工育苗和养殖产业发展迅速, 但目前人工养殖中尚无遗传改良的新品种, 存在生长抗逆等生产性状退化的潜在风险, 因此研究缢蛏生长相关基因对开展分子辅助育种推动缢蛏养殖业持续健康发展具有重要意义目前, 有关缢蛏生长相关基因的研究, 已有铁蛋白 (f) [12] 类胰岛素生长因子结合蛋白 (IGFBP) [13] 等见诸报道本实验克隆得到缢蛏 GRB2(S-GRB2) 基因 DNA 全长序列, 分析其在不同组织和不同发育时期的表达规律, 筛选外显子中 SNP 位点, 初步解析该基因在缢蛏生长发育过程中的作用, 为筛选生长相关候选基因和研究生长调控的分子机制奠定基础 2 材料和方法 2.1 实验材料实验用缢蛏取自宁波市鄞州丹艳水产养殖基地, 活体解剖获得闭壳肌肝胰腺外套膜足鳃水管和血液 7 个组织, 液氮速冻, 置于 -80 冰箱保存, 用于 RNA 提取取性腺发育成熟的缢蛏亲贝, 通过催产人工授精和幼体培育获得同步发育的 8 个发育时期的样品 ( 未受精卵受精卵 2 细胞胚胎 4 细胞胚胎囊胚担轮幼虫 D 形幼虫和稚贝 ) 取同批繁殖同塘养殖的缢蛏群体 700 颗, 随机取样 115 颗测量壳长壳宽壳高活体质量和软体质量等生长性状, 并活体解剖取足, 经液氮速冻后放 -80 冰箱保存 2.2 实验方法 S-GRB2 基因 DNA 全长克隆提取缢蛏足总 RNA,SMART TM RACEDNA AmpoK 试剂盒 (Co) 合成 DNA 第一链, 作为全长序列快速扩增 (RACE) 的模板利用缢蛏转录组文库获得 S-GRB2 基因 EST 片段, 设计 3' 和 5' 特异性引物 GRB2-F 和 GRB2-R ( 表 1), 进行 3' 和 5'-RACE 扩增, 对 PCR 产物割胶回收连接转化到 T1 大肠杆菌中, 培养过夜, 挑选白斑, 经验证将阳性克隆进行测序为验证 S-GRB2 基因 DNA 全长, 用克隆得到的 DNA 全长设计引物 G-F1 和 G-R1( 表 1) 进行 PCR 扩增, 产物回收纯化克隆步骤同上表 1 实验所用引物及其序列 Tb.1 Pmsdsqusofxpms 引物序列引物信息 GRB2-F GAATACCATCGGAAGTCCTCGGTCAGTC 3'-RACE GRB2-R CCATCTGGGTGAATGAACTTGTCGTCGG 5'-RACE G-F1 ATACGCAAAACCAATATGGAGGC 全长验证 G-R1 AGAGGCAGTAATAACACAAGACAGG 全长验证 R-G-F CCAACTGACAGACAACAGGTAGAA qrt-pcr R-G-R AGATGTTAGCGTCCTGGATTGC qrt-pcr 18S-F TCGGTTCTATTGCGTTGGTTTT qrt-pcr 18S-R CAGTTGGCATCGTTTATGGTCA qrt-pcr S-GRB2-F1 GGGGATACGCAAAACCAATA SNP 筛选 S-GRB2-R1 GAGGCAGTAATAACACAAGACAGG SNP 筛选 S-GRB2 基因的序列及进化分析利用 BLAST 软件拼接 5' 和 3'-RACE 片段序列, 获得 S-GRB2 基因 DNA 全长 ; 使用 DNAMAN6.0 预测其氨基酸序列以及理化性质 ;ORFFd 预测 S- GRB2 基因的开放阅读框 ;CusX 进行氨基酸多序列比对 ; 利用 ExPASy 软件推测该蛋白理化性质 ;Sm 软件进行蛋白质功能域预测 ; 利用 TMHMM 和 Sḡ P 分别进行蛋白质跨膜区和信号肽区域分析 ; 使用 SwssMod 软件进行蛋白质高级结构预测 ;MEGA 6.0 软件的 NJ 法构建系统进化树 S-GRB2 基因不同组织和发育时期的表达差异分析取缢蛏不同组织和发育时期样品, 提取 RNA 并反转录合成 DNA, 作为荧光定量 PCR(qRT-PCR) 的

3 2期赵家熙等:缢蛏生长因子受体结合蛋白 2 基因克隆时空表达及 SNP 筛查 89 模板,用 P m 5 设计引物 R -G -F 和 R -G -R (表 1), 司测序测序结果用 MEGA6.0 软件进行序列比对, 仪进行荧光定量 PCR 反应采用相对值 2- C进行分析内参为 18SRNA 基因,用 7500F s R -T mpcr 查找到的 SNP 位点用 SPSS17.0 进行生长相关性数据处理, SPSS17.0 对不同组织和发育时期的荧光定量结果进行差异分析 3 结果 S -GRB2 基因外显子 SNP 位点筛选取上述随机选取的 115 颗缢蛏样品,提取 RNA 3. 1 S -GRB2 基因DNA 全长克隆和序列分析 S -GRB2 基因 DNA 全长 1223bp( G Bk 登 S -GRB2 基因 DNA 全长为模板设计引物 S -GRB2 F1 S -GRB2 -R1(表 1)进行 PCR 扩增,产物直接送公及 27bp长的 po ya 尾(图 1) 后按照反转录试剂盒 ( TAKARA )合成 DNA 以录号: KX ),开放阅读框 711bp,编码 236 个氨基酸包含终止密码子 ATG,加尾信号 ATTAAA 图 1 S -GRB2 基因的 DNA 全长序列及其推导的氨基酸序列 F 1 T f u g o fdna dd du dm o ds o fs -GRB2g g. qu 阴影代表 po -GRB2 基因的加尾信号起始密码子和终止子,单下划线部分代表 SH3 功能区,双下划线部分为 SH2 功能区, ya,加框代表 S * 代表蛋白翻译结束 T s d dg s spo T sbox s po d y os s, s o do d s op o do. T bo dud d y p ya. y g qu s f u o dom so fsh3.t doub s f u o dom so fsh2.t * s s do f p o s o p p

4 90 海洋学报 40 卷 ExPASyCompu 软件推导出 S-GRB2 蛋白的分子质量 27.44ku, 等电点 pi=6.99;tmhmm 软件和 SgP 软件预测该蛋白质无跨膜区和信号肽 ; ExPASyPos 软件预测显示, 该蛋白质含有较大比例的极性氨基酸, 表现为亲水性功能域预测结果表明,S-GRB2 蛋白存在 3 个结构域 :SH3(8-64)-SH2(65-155)-SH3( ) Swssmod 软件预测显示,S-GRB2 蛋白的二级结构由 4 个 α- 螺旋 136 个 H 键 20 个 β- 折叠片和 25 个转角构成, 两个 α- 螺旋分别分布在 SH2 两端, 每个 SH3 结构域各有 1 个 α- 螺旋并且大多由 β- 折叠组成利用 MEGA6.0 软件, 对缢蛏和其他 12 个物种的氨基酸序列进行了序列比对和系统进化树分析 ( 图 2) 结果表明,S-GRB2 基因与文蛤和泥蚶等双壳贝类同源性较高, 分别为 64% 和 59%, 与日本血吸虫 (Ssosomjpoum,CAX ) 细粒棘球绦虫 (Eoous guosus, CDS ) 科罗拉多甲虫 (Lposdm,ALE ) 尼罗罗非鱼 (Oooms ous,xp_ ) 斑马鱼 (Doo, NP_ ) 大西洋鲑 (Smos,NP_ ) 北美绿蜥蜴 (Aososs, XP _ ) 鸡 (Gus gus, NP _ ) 小家鼠 (Mus musuus, NP _ ) 人 (Homosps,CAG ) 等动物的同源性为 45%~58% 进化树分析表明, 缢蛏与软体动物昆虫类等无脊椎动物的亲缘关系较近, 而与哺乳动物爬行类鱼类鸟类等脊椎动物的亲缘关系较远图 2 采用 MEGA6.0 软件 NJ 法构建的进化树 Fg.2 Tpyogosudby MEGA6.0sofwusgNJmod 3.2 S-GRB2 基因在缢蛏不同组织和不同发育时期的表达差异分析 qrt-pcr 检测结果显示,S-GRB2 基因在缢蛏成贝 7 个组织和 8 个发育时期中均有表达组织差异性表达结果表明, 足中表达量最高, 且极显著地高于其他 6 个组织 (P<0.01), 其次血液中的表达量也较高 ( 图 3) 不同发育阶段结果表明,S- GRB2 基因在缢蛏稚贝之前的表达量很低, 而在稚贝期表达量最高, 并极显著地高于其他发育时期 (P<0.01)( 图 4) 3.3 S-GRB2 基因外显子 SNP 位点筛选 S-GRB2 基因外显子区域 SNP 位点分析发现, 共存在 11 个 SNP 突变位点 ( 表 2), 其中 9 个位点属于个体随机突变, 突变率较低, 而 611 A> G 857C>T 两个位点的突变率较高, 分别为 46% 和 34.7% 生长相关性分析表明, 这些突变位点都没有在群体中表现出显著差异性, 与生长性状不相关

5 2 期赵家熙等 : 缢蛏生长因子受体结合蛋白 2 基因克隆时空表达及 SNP 筛查 91 续表 2 位置出现次数 / 次百分比 /% 765T>A 9 7.8% 857C>T % 893A>G 3 2.6% 901C>G % 956T>C 5 4.3% 984G>T 4 3.5% 1039G>T 7 6.1% 图 3 S-GRB2 基因在缢蛏不同组织的表达分析 (=3) Fg.3 ExpssoofS-GRB2gdfssusof S.os (=3) 1. 肝胰腺,2. 闭壳肌,3. 鳃,4. 水管,5. 外套膜,6. 足,7. 血液, ** 代表极显著差异,P< Dgsvgd,2.dduomus,3 ġ,4.spo,5.m,6.foo,7.bood,** pssxmysgfdfs,p<0.01 图 4 S-GRB2 基因发育时期表达分析 (>500) Fg.4 AyssofvxpssoofGRB2g ydvopmsgsofs.os (>500) 1. 未受精卵,2. 受精卵,3.2 细胞胚胎,4.4 细胞胚胎,5. 囊胚,6. 担轮幼虫,7.D 形幼虫,8. 稚贝,** 代表极显著差异,P< Ufzd muggs,2.fzdggs,3.2-mbyos, 4.4-mbyos,5.bsu,6.oopo,7.D-spdv, 8.juvms,**pssxmysgfdfs, P<0.01 表 2 S-GRB2 基因外显子序列 SNP 位点统计 Tb.2 SsssuofSNPsxoofS-GRB2 位置出现次数 / 次百分比 /% 95C>A 3 2.6% 386G>A 15 13% 539G>A 3 2.6% 611A>G 53 46% 4 讨论生长因子受体结合蛋白 2, 是一种通过转导多种信号通路来调控细胞生长增殖和分化的接头蛋 [14-15] [9] [10] 白, 在贝类的泥蚶和文蛤中有过报道本实验克隆得到的 S-GRB2 基因编码 236 个氨基酸, 与无脊椎动物中泥蚶 (236 个 ) 文蛤 (223 个 ) 日本血吸虫 (234 个 ) 细粒棘球绦虫 (244 个 ) 可多罗拉甲虫 (211 个 ) 的编码氨基酸数比较发现,GRB2 基因在较低等的无脊椎动物中有一定变异, 而在脊椎动物的鱼纲爬行纲鸟纲和哺乳纲中 GRB2 基因编码氨基酸数都稳定在 217 个, 推测其功能较为相似 GRB2 蛋白的 SH2 结构域与 SH3 结构域紧密结合 [4], 其中 SH3 结构域由 5 或 6 个 β 折叠排列紧凑形成反平行结构, 可特异结合其他蛋白富含 po 和 PXXP 为核心的保守结合基序, 激活相应细胞信号转导通路 [16-18] 该蛋白 C 末端的 SH3 结构域能与 Gb1 蛋白结合, 激活磷脂酰肌醇 3 激酶 (PI3K)-Ak 信号通路影响细胞增殖和生长 [19] ;SH2 结构域中间的 β- 折叠与两侧的两个 α- 螺旋形成扁平半球状, 可结合相关蛋白的酪氨酸磷酸化区域 pyxnx 以及非受体酪氨酸激酶发挥作用 [20-22] 缺失 SH2 结构域的 GRB2 (GRB3-3 剪接体 ) 可抑制细胞增殖 [23] 本研究推导出 S- GRB2 蛋白的结构域由 SH3-SH2-SH3 构成,SH2 结构域由中间的 β- 折叠与两端的 2 个 α- 螺旋组成,SH3 结构域主要由 β- 折叠形成的桶状结构和 1 个 α- 螺旋组成, 这与高等动物中的结构相同 ; 进一步的序列同源性分析发现, 缢蛏 SH2 结构域与泥蚶文蛤的同源性较高 (70% 68%), 与脊椎动物的 SH2 结构域氨基酸序列的同源性为 63%~64%, 这表明 S-GRB2 基因在进化过程中较为保守, 由此推测在缢蛏体内发挥的作用可能与高等动物相似

6 92 海洋学报 40 卷 GRB2 蛋白发挥作用主要通过与 Sos Vv 和 S 等蛋白相互作用得以传递信号来调节各种胞内代谢活动 [24-25] 在高等动物和海洋贝类的研究中, 都发现该基因在各组织中均有表达 [9-10,14] 本研究表明, S-GRB2 基因在缢蛏各个组织中均有表达, 其中足的表达量最高, 且血液的表达量也处于较高水平, 其中足相对于其他组织呈极显著差异 (P<0.01) 该结果与泥蚶 TḡGRB2 基因的组织表达规律有相似之 [9] 处, 董迎辉等研究发现 TḡGRB2 基因在血液中表达量最高, 认为 GRB2 基因以血液为载体发挥代谢调节免疫调节等功能另外, 有研究显示 GRB2 基因调控的 MAPK 通路对脂肪葡萄糖代谢具有调节作用, 也能与 Gb1 结合激活 PI3K-Ak 信号通路影响细胞的增殖生长 [20,24] 而缢蛏的足作为主要的运动器官, 具有很强的钻洞掘穴能力, 细胞代谢旺盛, 因此该基因在足部表达量最高或与此有关 GRB2 基因在物种间较为保守, 为胚胎正常发育所需 [26] 在小鼠的研究中发现,GRB2 基因的低表达会导致小鼠心血管发育异常, 敲除 GRB2 基因的小鼠早期胚胎会出现致死现象, 而使用 GRB2 的 SH2 结构域则可代替 Rs 挽救致死胚胎 [26-27] ; 亚等位基因实验还发现,GRB2 基因在小鼠胚胎发育过程中具有促进上皮细胞形成以及血管生成等功能 [28] 此外, GRB2 作为接头蛋白参与 FGF-ERK1 (Fbobs gowfo-exusg-gudks1, 成纤维细胞生长因子 - 细胞外信号调节激酶 ) 信号通路, 调控 FGF 控制内中胚层细胞的分化响应 [29-30] [31] 刘阳敲低 GRB2 基因后, 发现该基因低表达会导致 FGF 信号下游转录因子表达降低, 阻碍胚层形成 [32] Fuvo 等在非洲绿猴 (Copusops) 的 RNA 实验中也发现, 降低细胞内 GRB2 基因的表达会抑制细胞增殖本实验结果显示,GRB2 基因在缢蛏的未受精卵受精卵 2 细胞胚胎 4 细胞胚胎囊胚期担轮幼虫 D 形幼虫稚贝等 8 个时期均有表达, 其中稚贝期极显著高于其他时期 (P<0.01), 这与文蛤 Mm-GRB2 基因不同发育时期的表达特征相似 [10], 可能由于缢蛏稚贝期是生长旺盛的时期, 各组织快速发育, 体内新陈代谢细胞分裂加速, 而 GRB2 基因的大量表达对细胞的增殖生长和分化有明显促进作用 [2,33] SNP 是指在基因组上单个核苷酸的变异, 一些位点与生长抗逆抗病等经济性状相关联在海洋 [34] 贝类中已有相关研究报道, 如 Bo 等在泥蚶血红蛋白基因 (Hb) 中发现了与免疫相关的 SNP 位点 ; 谢 [13] 淑媚等在缢蛏 IGFBP 基因的 2136bp 处筛选到 1 [10] 个与生长相关的 SNP 位点 ; 高晓艳等在文蛤 HDAC1 基因在外显子中发现了 3 个生长相关的 SNP 位点本实验在 S-GRB2 基因外显子中共筛选到 11 个 SNP 突变位点, 其中 9 个位点属于随机突变位点, 而 611A>G 和 857C>T 两个位点也属于同义突变, 检测到 3 个基因型, 但这 3 个基因型的生长数据没有呈现显著差异 (P>0.05), 表明缢蛏 GRB2 基因的外显子变异对其生长性状无显著影响在缢蛏的启动子和内含子中是否会有与生长相关的 SNP 位点, 有待后续研究验证参考文献 : [1] LowsEJ,DyRJ,BzAG,.TSH2dSH3dom-ogpoGRB2kspoyoskssossgg [J].C,1992,70(3): [2] ZgYud,XuGuoxg,LuGg,.mR-411-5pbspofodmsssofbsvggGRB2[J].BomdBopysRsCommuos,2016,476(4): [3] RdkD,LSM,SzumsN,.Gb2smpofoTdvopm,Tdfo,dduoofxpmuommupomys[J].TJouofImmuoogy,2016,196(7): [4] CdP,CussD,MgS,.TGRB2dpo[J].FEBSLs,1995;369(1): [5] LN,BzA,DyR,.Gu-uod-sgfosos1bdsoGb2dkspoyoskssoRssgg[J].Nu,1993,363(6424): [6] AvuJ,ZgXfg,KyksJM.RfmsRs:ompgfmwokofsgsduopwy[J].TdsBom Ss,1994,19(7): [7] LLy,ZgK,JgHog,.QuvpoomsvsdowguoofGRB2spomodofF806-gd pofowok[j].jouofpooms,2015,117: [8] AmdZ,LCu,SuK M,.Gb2oospospoyoofFGFR2bybgpoksdSp2pospsvy [J].JouofCBoogy,2013,200(4): [9] 董迎辉, 项翔, 姚韩韩, 等. 泥蚶 (Tggos) 生长因子受体结合蛋白 2(GRB2) 基因的克隆与表达分析 [J]. 海洋与湖沼,2013,44

7 2 期赵家熙等 : 缢蛏生长因子受体结合蛋白 2 基因克隆时空表达及 SNP 筛查 93 (4): DogYgu,XgXg,YoH,.CogdxpssoofGRB2gfomboodmTggos[J].Ooog LmoogS,2013,44(4): [10] 高晓艳, 董迎辉, 施沈佳, 等. 文蛤生长因子受体结合蛋白 2(GRB2) 基因克隆时空表达及 SNP 位点筛查 [J]. 水产学报,2015,39(9): GoXoy,DogYgu,SSj,.Cog,spompoxpssodSNPsdfoofGRB2gdm Mx mx[j].jouoffssofc,2015,39(9): [11] 徐凤山, 张素萍. 中国海产双壳类图志 [M]. 北京 : 科学出版社,2008: XuFgs,ZgSupg.AIusdBvvMousFuofCSs[M].Bjg:SPss,2008: [12] 牛东红, 冯冰冰, 李家乐. 缢蛏铁蛋白基因的分子特性及其表达分析 [J]. 上海海洋大学学报,2012,21(5): NuDogog,FgBgbg,LJ.MoussdxpssoyssoffgfomSoovuos[J].Jou ofsgouvsy,2012,21(5): [13] 谢淑媚, 牛东红, 阮海灯, 等. 缢蛏 IGFBP 基因结构及生长性状相关 SNP 筛选 [J]. 水产学报,2015,39(6): XSum,NuDogog,RuHdg,.MouzoofIGFBP dssooysswgowszo msoovuos[j].jouoffssofc,2015,39(6): [14] DowwdJ.TGRB2/Sm-5dpopo[J].FEBSLs,1994,338(2): [15] HsE,MooP,FgZq,.TyospospoyoofGRB2:opo/pdmgowfoosskmmmy pgowddfo[j].moudcuboogy,2009,29(10): [16] WMF.IRS2gssu/IGF1sggwmbosm,uodgodogvy[J].Dbs,Obsyd Mbosm, 2014,16Supp1:4-15. [17] MDodCB,BV,MksDC,.BvbdgdvsfomoofGb2-Gb1sggompxooopvm [J].FEBSJou,2012,279(12): [18] LuS,ZgH,LM,.RumofGb2dSHIP1byITT-kmofofTIGITsuppsssgupozodyooxy ofnks[j].cd& Dfo,2013,20(3): [19] BmC,BmW,GdE,.M,msss,moydmo[J].NuRvwsMouCBoogy,2003,4(12): [20] BovA A,MommdM.Gb2,doub-dgdswodofpoyoskssgg[J].SSgg,2012,5(249):p49. [21] SoM M,FdkAF,BkS,.T-dmsosouosuuofSomoogydom-2ofgowfopoboudpo-2[J].JouofBomouNMR,1998,11(2): [22] JCY H,NJg,WuCggg,.NovSomoogy3dom-bdgmofsdfdfompoomsofPo-go [J].Mou& CuPooms,2005,4(8): [23] 潘智.Gb2 与 AMPK TSC2 的相互作用及其在细胞生长调控中的功能研究 [D]. 保定 : 河北大学,2007. PZ.TfuosudyofGb2oswAMPKdTSC2[D].Bodg:HbUvsy,2007. [24] SmpsoA,UoJ,RodkU,.Dfxpssodsubudsbuoofmousmsss-ssodposM1d M3[J].G,2001,273(1): [25] HudsoER,PDA,JmsJ,.AovdomAMP-vdpoksussgyogsogbodssmoossdydyms[J].CuBoogy,2003,13(10): [26] CgA M,SxoT M,SkR,.MmmGb2gusmupspsmbyodvopmdmgsfomo[J]. C,1998,95(6): [27] SxoT M,CgA M,OgSH,.Gdosg-dpdfuosfopospoyos-Gb2sggdugmmmssumopogss[J].CuBoogy,2001,11(9): [28] PuoLA,PsojmspK,KgCC,ṗ21-vdks1(PAK1)swGb2dppoooupogowfo sgg[j].jouofboogcmsy,2003,278(11): [29] MosoG M,OkoomopououI,MgusRP,.AodfvdodmfomESCsvsofoFGFsgg[J].CSm C,2008,3(4): [30] CY,LXofg,EswkumVP,.Fbobsgowfo(FGF)sggougPI3-ksdAk/PKBsqudfombyodbodydfo[J].Oog,2000,19(33): [31] 刘阳.MoRNA-200 调节 Gb2 抑制小鼠胚胎干细胞的中内胚层分化 [D]. 上海 : 第二军医大学,2013. LuYg.MoRNA-200gusGb2dsuppsssdfoofmousmbyosmsododmdmsodm[D].Sḡ :TSodMyMdUvsy,2013. [32] FuvoM D,HksK M,Gomz-CmbooJ.So-pRNA-mddsbsgofGb2mpsgowdDNAsyss [J].BomdBopysRsCommuos,2007,357(3): [33] 王如才, 王昭萍. 海水贝类养殖学 [M]. 青岛 : 中国海洋大学出版社,2008. WgRu,WgZopg.SofMSfsCuu[M].Qgdo:COUvsyofCPss,2008.

8 94 海洋学报 40 卷 [34] BoYogbo,LPf,DogYgu,.PoymopsmofmupmogobsboodmTggosdsssoow dssssovbopmoyus[j].fs& SfsImmuoogy,2013,34(5): Cog,spompoxpsodSNPsdfoofGRB2g Soovuos ZoJx 1,CuBoyu 2,DogYgu 1,YoH 1,LZu 1 (1.KyLbooyofAquGmpsmRsouofZjgPov,ZjgWUvsy,Ngbo315100,C;2. CogofFsydLfSs,SgOUvsy,Sg201306,C) Abs:To xpo mousuudboogfuoofgrb2soovuos(s- GRB2),sDNA wsodbysmartracequs,bofoms,snpsxodxpssopofsdfssusddvopmsgswyzd.tsusddfug DNAofS-GRB2gws1223bp,ogomp711bpORFodg236mods.Compsos ofmdsqu,s-grb2sgomoogywbvvsofmxmxdtggos (64% d59%).s-grb2somoogouswoss45%-58%smy,dgrb2svyosvv.tsuofqrt-pcrdfssussowds-grb2xpssdsvssus, xpssooffoowsxmysgfygos(p<0.01).tvxpssodfsgsvdxpssoofjuvmswsxmysgfygosgs(p< 0.01).Aoof11SNPsxoofS-GRB2wdfd. Kywods:Soovuos;GRB2;gog;SNP

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌