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仓幸
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1 中国水稻科学 (ChinJRiceSci),2013,27(4): htp:// DOI: /j.issn 水稻幼苗叶色温敏感突变体的鉴定及其基因定位江少华 1 周华 1 林冬枝 1,* 董彦君 1,* 叶胜海 2 张小明 2 (1 上海师范大学生命与环境科学学院植物遗传与功能基因研究室, 上海 ;2 浙江省农业科学院, 杭州 ;* 通讯联系人, dzlin@shnu.edu.cn;dong@shnu.edu.cn) Identificationand Gene Mappingofa Thermo-sensitiveLeaf-color Mutantat SeedlingStageinRice JIANGShao-hua 1,ZHOU Hua 1,LINDongẕhi 1,*,DONGYaṉjun 1,*,YEShengẖai 2,ZHANGXiao-ming 2 (1 Laboratoryof PlantGeneticsand FunctionalGenes,Colegeof Lifeand EnvironmentSciences,ShanghaiNormalUniversity, Shanghai200234,China; 2Zhejiang Academy of AgriculturalSciences,Hangzhou310021,China; *Correspondingauthor, dzlin@shnu.edu.cn;dong@shnu.edu.cn) JIANGShaohua,ZHOU Hua,LIN Dongzhi,etal.Identificationandgene mappingofathermo-sensitiveleaf-color mutantatseedlingstageinrice.chinjricesci,2013,27(4): Abstract:Athermo-sensitiveleaf-colormutant,tsl11,wasselectedfromtheprogenyofthejaponicaricevarietyJiahua 1by 60 Coγ-radiation.Compared withthewilḏtypeparentjiahua1at20,the mutantwascharacterizedyelowseedling,decreasedcontentsofchlorophyla,chlorophylbandcarotenoidby94.6%,88.2% and91.5%,respectively. Simultaneously,theresultofelectron microscopicobservationrevealedthatthestructureofchloroplastsinthetsl11 wasimperfectseriously.however,the mutantwassimilarto wildtypeathightemperatures(32 ).Theseresults indicatedthatthemutantwasobviouslythermo-sensitive.geneticanalysisshowedthatthemutanttraitwascontroled byasinglenuclearrecessivegene,tentativelydesignatedastsl11.moreover,themappingpopulationof4928f2mutant individualsderivedfrom Pei ai64s/tsl11 wereconstructed,thenusingssrandindelmarkers,thetsl11 genewas finalymappedtoaregionof147kbbetweenid14506andid14653onchromosome11. Keywords:thermo-sensitive;leaf-colormutant;chlorophylcontent;genemapping 江少华, 周华, 林冬枝, 等. 水稻幼苗叶色温敏感突变体的鉴定及其基因定位. 中国水稻科学,2013,27(4): 摘要 : 在粳稻嘉花 1 号水稻品种经 60 Coγ 辐照后代中筛选到一个幼苗叶色温敏感突变体 tsl11 与野生型嘉花 1 号相比, 该突变体在 20 下, 幼苗叶色呈黄色 ; 叶绿素 a 叶绿素 b 和类胡萝卜素含量分别下降 94.6% 88.2% 和 91.5%; 且电镜结果显示叶绿体内部结构不完整而在高温 (32 ) 条件下突变体的叶色表型光合色素含量和叶绿体发育与野生型基本一致, 显示出明显的温度敏感性遗传分析表明, 该突变体叶色性状受 1 对隐性核基因控制, 暂命名为 tsl11(thermo-sensitiveleafcolor11) 以该突变体与籼稻培矮 64S 杂交, 构建 4928 株突变型 F 2, 利用 SSR 和 InDel 分子标记将 tsl11 基因定位于水稻第 11 染色体上的 ID14506 与 ID14653 之间的 147kb 的区间内关键词 : 温敏感 ; 叶色突变体 ; 叶绿素含量 ; 基因定位中图分类号 :Q343.5;Q754;Q 文献标识码 :A 文章编号 : (2013) 水稻是世界上最重要的粮食作物之一, 全球近一半的人口以稻米为主食水稻产量与其植株叶片的光合作用有着密切关系而水稻叶色的突变往往直接影响叶绿素合成, 从而影响植株的光合作用, 造成产量减产甚至整个植株死亡因此, 叶色突变体的研究价值受到极大关注关于叶色突变体的研究较早,20 世纪 30 年代开始报道迄今, 已经在几乎所有的高等植物中发现了叶色突变体如今叶色突变体已广泛应用于高等植物光合作用机制叶绿素生物合成和叶绿体结构发育的研究另外, 水稻叶色 [1-3] 突变体在杂交育种中得以应用目前已经有接近 134 个水稻叶绿素缺失叶色突变体相关基因被报道, 这些突变基因分布在水稻的 [4] 12 条染色体上遗传研究表明, 大部分水稻叶色收稿日期 : ; 修改稿收到日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ); 上海市科委项目 (09DJ , ,10DZ ,12ZR ); 上海市教委项目 (J50401)

2 360 中国水稻科学 (ChinJRiceSci) 第 27 卷第 4 期 (2013 年 7 月 ) 突变性状受 1 对隐性核基因控制 [5], 而由显性基因控制或是细胞质基因控制的叶色突变体非常少见 [6-7] 叶色突变体根据苗期叶色不同可分为白化黄化浅绿绿白白翠黄绿绿黄和条纹等 8 种类型 [8] ; 另外, 叶色突变体也可根据温度影响可分为温敏感型和温钝感型 [9] 温敏感叶色突变体是因为叶绿素和叶绿体的形成与温度密切相关, 导致很多叶色突变体在不同温度下的表型变化比较明显近几年关于温敏感叶色突变体的报道比较多, 占已报道叶色突变体的 20% 如 W17 [10] W25 [10] tsc-1 [11] cisc(t) [12] al12 [13] tws [14] gra(t) [15] v1 [16] v2 [17] v3 [18] 和 stl [18] 这些突变体在低温条件下叶色异常, 当温度升高至 30 ~35 时叶片叶色表现正常 ; 另外还有 W4 [10] W11 [10] 和 cdel(t) [19] 在高温下叶片叶色表现突变性状, 并随着温度降低叶色逐渐转为绿色这些温敏感叶色突变体叶色均能出现转绿现象, 虽然已经有 5 个温敏感突变基因克隆成功, 但目前对于温敏感叶色突变体转绿作用机理还不明确本研究利用嘉花 1 号经 60 Coγ 射线辐照后筛选得到的一个新的水稻幼苗叶色温敏感突变体 tsl11, 对其在不同温度下光合色素含量和叶绿体超微结构进行研究, 同时对突变基因开展了遗传分析和基因定位, 以期为相关基因克隆功能分析和应用奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料水稻幼苗叶色温敏感突变体 tsl11 是从 60 Coγ 射线诱变粳稻嘉花 1 号产生的 M2 群体中获得的, 经多次自交繁殖和选择, 该突变体各种农艺性状已稳定 1.2 方法突变体幼苗叶色温敏感性鉴定为了明确突变体叶色温敏感性, 将突变体 tsl11 与野生型嘉花 1 号的种子在 28 下催芽 4d, 然后将发芽后的种子种于盛有水稻土的培养皿中, 分别置于和 32 的光照培养箱 (GXZ 智能型, 宁波江南仪器厂 ) 中, 光照强度 180μmol/ (m 2 s),12h 光照 /12h 黑暗 7d 后开始观察突变体和野生型幼苗的叶色光合作用色素含量的测定在幼苗长至 3 叶期时, 分别称取 4 种温度下生长的突变体和嘉花 1 号幼苗的第 3 叶 0.02g, 参照 [20] 沈伟其的方法, 剪碎, 放入具塞试管中, 加混合提取液 5mL(V 乙醇 V 丙酮 V 水 =5 4 1), 常温避光处理 18 h 以上, 叶色褪白后, 采用 BECKMAN- COULTER-DU720 分光光度计测定上清液在 470 nm 645nm 和 663nm 下的吸光度值, 分别计算叶绿素 a b 和类胡萝卜素的含量试验均重复 3 次幼苗叶片叶绿体超微结构观察分别取 20 和 32 下生长到 3 叶期的 tsl11 和嘉花 1 号的第 3 叶相同部位叶片, 先用 2.5% 戊二醛和 1% 锇酸 (OsO4)4 下固定 5 h, 接着用 0.2mol/L 的磷酸缓冲液漂洗, 依次于 50% 70% 80% 95% 和 100% 的乙醇和丙酮梯度脱水, 最后用环氧化树脂 70 过夜包埋成块切片经醋酸铀 - 柠檬酸铅双染色后, 用透射电镜 (Hitachi765 型 ) 观察拍照突变体遗传分析与定位群体构建 2010 年, 在上海种植的 tsl11 突变体与籼稻培矮 64S 杂交获得 F1 种子, 同年冬季在海南陵水加代种植, 获得 F2 种子, 然后将 F2 种子经 28 催芽后, 播种于装有水稻土的不锈钢铁盒内并用保鲜膜封好, 放置于光照培养箱 (GXZ 智能型, 宁波江南仪器厂 ) 内培养, 温度 20, 光照强度为 180μmol/(m 2 s), 每天光照 12h 约 10d 后观察幼苗叶色分离情况, 进行统计分析同时从 F2 群体中挑取突变型幼苗, 并移至 32 光照培养箱中继续生长, 用于 DNA 提取及基因定位水稻 DNA 的提取亲本和 F2 代定位群体的基因组 DNA 均采用改 [21] 良后的 CTAB 法提取突变体基因定位首先采用本实验室保存用于初定位的 64 对 SSR 和 InDel 分子标记检测突变体 tsl11 与籼稻培矮 64S 的多态性然后利用在 12 条染色体上平均分布有多态性的引物对 22 株突变型单株进行染色体连锁分析定位, 并进一步扩大 F2 群体至 200 株之后在目标区域内通过 NCBI(htp:// nlm.nihġov) 公布的粳稻日本晴和籼稻 9311 的全基因组序列差异寻找插入 / 缺失 (InDel) 位点, 利用 PrimerPremiers5.0 软件设计 InDel 分子标记, 对突变基因精细定位 ( 引物由上海生工生物工程技术服务公司合成 ) 25 μl 的 PCR 体系包括 100 mmol/ltris-hcl(ph 9.0) 100 mmol/l KCl 20 mmol/l MgSO4 80 mmol/l (NH4 ) 2 SO4 2.5

江少华等 : 水稻幼苗叶色温敏感突变体的鉴定及其基因定位 361 mmol/ldntp 10μmol/L 引物 5 U/mLTaq 酶和 20ng 模板 DNA 在 EppendorfPCR 仪上进行扩增,PCR 程序如下 :94 C 下预变性 4 min,94 C 下变性 30s,55 C 下复性 30s( 退火温度随引物变化 ),72 C 下延伸 30s,35 个循环 ;72 C

3 江少华等 : 水稻幼苗叶色温敏感突变体的鉴定及其基因定位 361 mmol/ldntp 10μmol/L 引物 5 U/mLTaq 酶和 20ng 模板 DNA 在 EppendorfPCR 仪上进行扩增,PCR 程序如下 :94 C 下预变性 4 min,94 C 下变性 30s,55 C 下复性 30s( 退火温度随引物变化 ),72 C 下延伸 30s,35 个循环 ;72 C 下延伸 7 min 反应产物用 2.0% ~2.5% 琼脂糖凝胶电泳检测, 经溴化乙锭染色后在 UVP 凝胶成像仪上成像, 而对于较难分辨的 DNA 扩增条带, 用 8% 聚丙烯酰胺凝胶检测, 银染后于冷光源胶片观察灯上观察, 拍照记录连锁分析将 F2 代中与 tsl11 突变体 DNA 带型一致的单株记为 A, 与培矮 64S 带型一致的单株记为 B, 与 F1 带型一致的单株记为 H, 带型不清楚的单株记为 -, 将电泳图谱转换成数据群, 利用 [22] MAPMAKER/EXP3.0 软件进行连锁分析和遗传距离计算 2 结果与分析 2.1 突变体幼苗叶色温敏感特性在 4 种温度下 ( 和 32 ) 对突变体 tsl11 与野生型嘉花 1 号苗期叶色表型进行观察对比 ( 图 1), 结果发现野生型嘉花 1 号的幼苗叶色一直呈绿色, 与温度没有相关性 ; 而突变体 tsl11 在 20 和 24 下第 3 4 叶片均为黄色, 在 28 下表现为黄绿相间,32 下则与野生型一致呈绿色突变体一直在 20 条件下生长, 至 5 叶期时第 4 叶也开始转绿, 第 5 叶完全呈绿色可见, 该突变体幼苗叶色随着温度升高由黄转绿, 具有明显的温敏感性, 与叶龄相关 2.2 不同温度条件下突变体与野生型光合色素含量对比在不同温度下对突变体 tsl11 与野生型嘉花 1 号的光合色素含量进行比较如图 2 所示, 与野生型嘉花 1 号相比, 在 20 下, 突变体 tsl11 的叶绿素 a b 及类胡萝卜素含量均达到最低值, 分别下降 94.6% 88.2% 和 91.5%; 在 24 与 28 下, 突变体 tsl11 的叶绿素 a b 含量及类胡萝卜素含量分别下降 25.8%~47.6% 37.3%~43.5% 和 36.5%~ 42.3%; 而在 32 下, 突变体 tsl11 的叶绿素 a 叶绿素 b 和类胡萝卜素含量仅下降 5.03% 3.85% 和 3.57% 另外, 突变体 tsl11 光合色素含量随着温度下降显著降低上述结果显示在不同温度下光合色图 1 不同温度条件下野生型嘉花 1 号 ( 左 ) 和突变体 tsl11( 右 ) 幼苗叶色表型 Fig.1.Theseedlingleafcolorofwildtype(left)andtsl11 (right)at diferenttemperatures. 素含量变化与叶色表型变化一致, 同样具有温敏感性因此, 我们推测该突变性状是由低温导致叶绿素合成受阻引起的 2.3 突变体叶绿体超微结构为了进一步了解突变体的特征, 对 tsl11 和嘉花 1 号幼苗第 3 叶叶肉细胞结构进行透射电镜观察结果显示, 在 32 下 tsl11 与嘉花 1 号无论是叶绿体数量大小, 还是类囊体片层结构均无明显区别 ( 图 3-A,B); 而在 20 下, 突变体 tsl11 与嘉花 1 号相比,tsl11 叶绿体发育严重不良, 几乎看不到完整片层并垛叠整齐的类囊体结构 ( 图 3-C,D) 说明 tsl11 突变体叶绿体发育, 与叶色和叶绿素含量一致, 具有温敏感性 2.4 突变体遗传分析突变体 tsl11 与培矮 64S 正反交后代中, 所有的 F1 个体都表现为正常表型, 说明突变性状为隐性核

4 362 中国水稻科学 (ChinJRiceSci) 第 27 卷第 4 期 (2013 年 7 月 ) 同一品种不同温度之间标相同字母表示无显著差异 ; * 表示同一温度下不同品种之间差异显著 (P<0.05) Foracultivar,thesameletersabovethebarsshownosignificantdiference; * Atasametemperature,showsignificantdiference(P<0.05). 图 2 4 种温度下野生型嘉花 1 号与突变体 tsl11 幼苗叶片光合色素含量的比较 ( 平均值 ± 标准差 ) Fig.2.Comparisonofphotosyntheticpigmentcontentsbetweentsl11anditswild-typeJiahua1underfourtemperaturesduringtheseedlingstage (Mean±SD). 64S 两个亲本间表现出多态性利用这些多态性引物对培矮 64S 与 tsl11 杂交后代的 22 株 F2 代突变 A,C- 野生型 ;B,D- 突变型 AandC,Wildtype;BandD,Mutanttype. 图 3 不同温度下野生型嘉花 1 号和突变体 tsl11 的叶绿体超微结构 Fig.3.Chloroplastultra-structureofwildtype (left)andtsl11 mutant(right)atdiferenttemparetures. 基因突变随机调查了培矮 64S/tsl11 杂交组合的 F2 代群体中 479 株幼苗, 发现野生型 371 株, 突变型 108 株, 经 χ 2 测验, 其分离比例符合 3 1( χ 2 =1.41 <χ =3.84) 说明该温敏感突变性状由一对隐性核基因控制, 暂将该基因命名为 tsl 幼苗叶色温敏感突变体的基因定位通过对本实验室保存 SSR 和 InDel 分子标记进行多态性检测, 发现有 49 对引物在突变体和培矮株进行初步连锁分析, 发现突变基因 tsl11 与第 11 染色体上的分子标记 RM536 连锁, 接着扩大定位群体至 200 株, 将 tsl11 基因初定位于第 11 染色体分子标记 ID11974 与 MM1431 之间, 距 ID11974 和 MM1431 分别为 1.5cM 和 2.8cM, 然后进一步发展新的 InDel 分子标记 ( 表 1) 并扩大群体至 4928 株, 最后将 tsl11 基因定位于 ID14506 与 ID14653 之间 ( 图 4) 的 147kb 的区间内, 跨越 3 个 BAC, 并发现两个共分离分子标记 (ID14508 和 ID14541) 3 讨论叶色突变体是比较常见一类水稻突变体本研究中叶色突变体 tsl11 是一种幼苗低温敏感叶色体, 在低于 24 的条件下,5 叶期前其幼苗呈黄色, 叶绿体发育严重不良, 具有明显的低温敏感性目前, 在已报道的众多水稻叶色突变体中, 与本研究叶色表型类似的低温敏感叶色突变体有 3 个,mr20 [23] mr21 [24] 和 v2 [19], 其在低温条件下幼苗叶色呈黄色, 高温正常绿色, 但其突变基因所在染色体与 tsl11 不同, 均不在第 11 染色体上另外, 与 tsl11 处于同一染色体上的叶色突变基因有 9 个, 包括 2 个斑点型突变体 z1 和 z2 [25] 以及 5 个白化转绿突变体 sgra [26] tsc-11 [27] gwgl [28] v4 [29] 和 v9 [30], 以及 2

5 江少华等 : 水稻幼苗叶色温敏感突变体的鉴定及其基因定位 363 图 4 幼苗叶色温敏感突变基因 tsl11 的连锁图谱和基因定位 Fig.4.Linkagemapandgenemappingofgenetsl11. 表 1 本研究开发的多态性分子标记 Table1.Developedpolymorphicmarkersinthisstudy. 标记 Marker 引物序列 (5-3 ) Sequenceofprimers(5-3 ) 引物位置 Locationofprimers ID11974 TTGGTTTGGGGTGAACGGTCCGCACCGACATTTTGCTAGTT AC ID14102 AAGACACCGACTGCATGCATGGCTTGTCTTCTTCCTCCTCCGTA AC ID14326 CAATAAGTAGGCAACAGGGACAGTGCAAGCGACATGCAGCACCTAAT AC ID14506 GTGAATAGATTCGAAGGTAAGGTCGGTTTTGACTCTGAATTGTA AC ID14508 TAGTGGTTGCTTATGGGTGATTTTCAGTCAATCCTATCAAG AC ID14541 GGTCCTATTAAGATTGATGCTAATCCTCTTGTACAGCGGTG AC ID14653 AGACATATCTTCGCAGTTGGGCGAGATCTATTTTTCTAAGGC AC ID14901 GCCTCTCCAAATACAAGCTGCAGAGCTTTGGTTGAGCCAAGC AC MM1431 CGCCTTTCTTTGTCCTCAAGTAAAAGCTTAGCTCGGCTCG AC ID16144 TCGTTTCTGATGGGGGGTTCGCTACTCAGAGTCCGCATTTCCCTGGTGTC AC 个黄叶突变基因 xnt [31] 和 yl11 [32] 其中,xnt 位于短臂上的 RM7283-ID9201 之间,yl11 定位在与 tsl11 相差约 0.6 Mb 的 MM2199 和 ID21039 之间因此, 依据叶色表型和突变基因位置, 可以得出 tsl11 突变体是 1 个新的叶色突变体本研究利用从培矮 64S/tsl11 的后代分离出 4928 个突变型株作为定位群体, 将突变基因 tsl11 锁定在第 11 染色体上的 147kb 区间内通过生物信息学分析该区间跨越 3 个 BAC(AC146522, AC 和 AC146526) 包含 23 个预测基因, 尚未发现与叶绿素合成或叶绿体发育相关候选基因推测 tsl11 基因是一个受温度调控的早期叶绿体发育相关新基因因此, 进一步对 tsl11 克隆及功能研究将有助于加深我们对温度对水稻早期叶绿体发育调控反应分子机理的理解参考文献 : [1] 董彦君, 董文其, 张小明, 等. 突变体 Fan5 苗色低温敏感性状的遗传分析. 中国水稻科学,1995,9(4): [2] 董文其, 董彦君, 石守鋆, 等. 两用核不育水稻 7436S 的温敏感白苗标志性状的遗传及其育性研究. 作物品种资源,1995 (1): [3] 章志兴, 徐开盛, 陈俊涛, 等. 叶色标记技术在杂交水稻种子生产中的应用. 种子科技,2001,19(1): [4] 邓晓娟, 张海清, 王悦, 等. 水稻叶色突变基因研究进展. 杂交水稻,2012,27(5):9-14. [5] 魏彦林, 施勇烽, 吴建利. 水稻核基因控制的叶色变异. 核农学报,2011,25(6): [6] 李贤勇, 王楚桃, 李顺武, 等. 一个水稻高叶绿素含量基因的发现. 西南农业学报,2002,15(4): [7] 钱前, 朱旭东, 曾大力, 等. 细胞质基因控制的新特异材料白绿苗的研究. 作物品种资源,1996(4): [8] Awan M,KonzakDF,RutgerJN.Mutagenicefectofsodi-

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+ 上海师范大学学报自然科学版! "!# $ # # 年引言水稻是世界上第二大粮食作物也是中国最主要的粮食作物之一因此如何提高水稻的产量以解决日益严峻的粮食不足问题显得越发重要光合作用是影响水稻产量的关键因素之一而叶片是进行光合作用的主要器官叶色在很大程度上决定了光合作用的效率叶

+ 上海师范大学学报自然科学版! !# $ # # 年引言水稻是世界上第二大粮食作物也是中国最主要的粮食作物之一因此如何提高水稻的产量以解决日益严峻的粮食不足问题显得越发重要光合作用是影响水稻产量的关键因素之一而叶片是进行光合作用的主要器官叶色在很大程度上决定了光合作用的效率叶第!" 卷第# 期 #)*+ 年! 月上海师范大学学报! 自然科学版" - / 23 3 ( 6 7/! ( - 2 / " $ '!" #('# >?'# # ) * + $*)' CD"D E 'B 22(' *))) FG*C+' #)*+' )#' )#C @AB 一个新水稻低温敏感叶色突变体 ( 2 的鉴定及基因定位王文娟*! 吴兰兰*! 雷晓庆*! 赵怀玉*! 林冬枝*!#! 董彦君*!#!