中国临床药理学与治疗学 2011Dec;16(12) 1353q 小鼠吸人细菌脂多糖 (LPS) 所致实验性肺炎 模型能够较为理想地模拟人急性重症肺炎 3ˉ 蝴 本研究集中干白黎芦醇对实验性肺炎小鼠的保护作用并探讨其作用环节, 以期为重症肺炎防治的研究和新药开发提供新的思路, 并为临床重症肺炎的治疗

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1 ˉˉ. 剧 朋 H == 一 =ˉˉ 二 = -=-=-=- 呵 出江ˉ副屿呜乍_ 呼ˉ配轧~.慕 r- 己二 =- 挣 耳 = = ˉ-= = 己 = T 三巴 ˉ 酵瑞 be 蜡 ii 瓢懂 辨叶 嚣蕊器 ˉ 墨瓣 苍挚 o]352o 白蔡芦醇对脂多糖诱导的小鼠重症肺炎的保护作用比 基础研究 罐憋赣露镭斡.=嘿衬蚀 哦龄慰螺撼 广~嗓 舔 熟窿 一^: 耀撼, 噎橱 ˉ 犁艘扒 裙ˉ,..Ⅶ嗡 " 三岂 1 = 严.h} 灌 中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办 CN34ˉ1206/R,ISSN1009ˉ2501 http 置 // 2011Dec>16<12);1352_1356 T, ˉˉ 息蹦斜 : 擂野谢忽! 脯郭 ˉ 客 ~ 剖庐 一 金婉冰 浙江省食品药品检验所, 杭州 , 浙江 摘要目的 : 探讨白蔡芦醇对实验性小鼠重症肺 炎的保护作用及机制 方法 : 建立脂多糖吸入所 致的小鼠实验性急性重症肺炎模型, 然后给予白 蔡芦醇腹腔注射给药 观察小鼠肺纽织病理 肺纽 织湿 / 干质量比 支气管肺泡灌洗液中细胞分类计数变化, 并检测肺纽织中 TNFˉα ILˉ1β ILˉ6 等 炎症因子的表达差异 结果 : 实验性急性重症肺 炎模型小鼠在接受白蔡芦醇 3~4d 后症状开始 减轻 肺部炎症缓解 白黎芦醇治疗后 小鼠肺泡 灌洗液中单核巨噬细胞 淋已细胞 中性粒细胞及 白细胞中性粒细胞计数和百分比均小于 肺纽织中 TNFˉα ILˉ1β`IL6 的表达均显著低于 结论 : 白蔡芦醇有一定的抗炎作用 可以 缓解小鼠重症肺炎症状, 其机制可能是降低炎性 肺纽织中 TNFˉα ILˉ1β ILˉ6 等的含量 从而减 轻炎症反应 2011ˉO8-25 收稿 2011ˉ 1ˉ10 修回 金婉冰 女 主管药师 研究方向 : 药理学 Tel:0571ˉ Eˉmail:wbjm@SObu.cOm 关键词白蔡芦醇 ; 小鼠 ; 重症肺炎 ; 保扩作原 中图分类号 : 文献标识码 { 文章编号 { 重症肺炎是弓 起机体多器官功能障碍的肺部 感染性疾病 其产生与病原体感染后失控的炎症反应有关, 而非单纯病原菌和毒素损伤的结果 [1 尽管临床上新的药物不断出现 但重症肺炎的发 病率和病死率仍居高不下, 探索有效的防治途径 成为临床及基础医学领域堕待解决的问题 白黎芦醇 (3 4 5ˉ 三轻基二苯乙烯,ReSveraˉ tr l ReS) 是植物界分布较广的 _ 种多酚类化合 物 它最初作为 _ 种植物抗毒素被发现 从此一直受到医学界的广泛重视和研究 目前已证实具有抗肿瘤 抗氧化 抗心皿管疾病 抗血小板聚集 调节免疫 化学预防及雌激素样作用等作用 近年来人们对其药理作用和机理有了较多的研究和 认识 [2 R965,2 A 1009ˉ2501(2011)12ˉ1352ˉ cellcycle,theexpressi nofαˉsmoothmuscleˉacˉ t1n(αˉsma)wasdetectedbyimmun CytoChemˉ istry themrnalevelfconnectivetissue gr wthfactor(ctgf)wasmeasuredbyrtˉ PCR.RESULTS:TGFˉβlmarkedlyincreaSedthe cellprliferation GBEeffeCtiVelyinhibitedthe pr liferationinaconcentrationˉtimedependent way.thesphase fcellsintgfˉβ!groupwere graduallyincreased,theexpress1 n fα=sma andctgfwerealsomarkedlyincreasedinduced bytgfˉβ],whichwaspartlyattenuatedby 亨 GBECONCLUSION:GinkgobilbaextractCan inhibithtcfsproliferatinanddwnregulation thetgfˉβlinducedαˉsmaandctgfmrna VerexpreSS1on KEYwORDSGinkgObilObaextract;Human Tenn ScapSulefibrOblaStS;TranSfOrming growthfact rˉβ1;αˉsmo thmuscleˉactin;conˉ nectivetissue 虹 wthfact r 本文编辑 : 储冀汝

2 中国临床药理学与治疗学 2011Dec;16(12) 1353q 小鼠吸人细菌脂多糖 (LPS) 所致实验性肺炎 模型能够较为理想地模拟人急性重症肺炎 3ˉ 蝴 本研究集中干白黎芦醇对实验性肺炎小鼠的保护作用并探讨其作用环节, 以期为重症肺炎防治的研究和新药开发提供新的思路, 并为临床重症肺炎的治疗提供另 - 新手段 也为白黎芦醇临床的新用途提供实验 依据 1 材料与方法 牟 1.1 药品及试剂白黎芦醇 LPS 购自美国 Sigˉ ma 公司 用 ph7 4`10mmol/L 的 PBS 稀释成合适浓度 经 0.22 尸 m 滤膜过滤后 4 保存备用 Triz l 试剂购干 PrOmega 公司 RT 试剂盒为 InvitrOgen 公司产品,RealˉtimePCR 相关试剂购于 BlOˉRad 公司 其余试剂均为国产分析纯 1.2 小鼠重症肺炎模型的复制及分组与用药 ] 采用 4~6 周龄 Balb/c 小鼠 ( 购自浙江中医药大学实验动物中心 ) 体重 20~25g 小鼠腹腔注射水合氯醛 ( 浓度 100g/L 4mL/kg 体重 ) 麻醉后仰位于 45 的平板上 用镊子牵拉小鼠的舌, 用移液枪吸取 1g/L 的 LPS50 件 L 滴于小鼠咽后壁 并马上捏住小鼠的鼻子 20S 后松开舌及鼻 放干笼中让其自然苏醒 同时 设置 以等量的 ph7o4`10mm l/lpbs 滴于小鼠咽后壁取 造模后 4h, 将接受 LPS 刺激的动物随机分为 3 组 ; 低剂量白黎芦醇组 (10mg/kg) 和高剂量白蔡芦醇组 (40mg/kg) 每组 20 只小鼠 按小鼠体重称取白黎芦醇 先用 1mL75% 乙醇溶解 再加无菌生理盐水配制成相应浓度 按分组进行腹腔注射给药, 每天一次, 连续给药 4d 和未接受 LPS 刺激的小鼠 给予等量生理盐水 每个时间点每组取 5 只小鼠进行检测 1.3 肺组织病理检查小鼠腹腔注射 100g/L 的水合氯醛 (4mL/kg 体重 ) 麻醉后 打开胸腔 迅速取出肺组织 用 4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定 12h 常规石蜡包埋切片 HE 染色后普通光学显微镜观察形态学变化 1 4 肺组织湿 / 干质量比测定小鼠麻醉后取出肺组织适量 称量肺组织湿质量后, 置 80 烤箱烘烤 72h, 称量干质量 计算湿 / 干质量比值 1.5 支气营肺泡灌洗液中细胞染色分类计数 小鼠腹腔注射 100g/L 的水合氯醛 (4mL/kg 体重 ) 麻醉后 行颈部手术分离气管进行插管 以 α5mlpbs 灌洗 3 次 收集灌洗液并干 40 储存 对支气管肺泡灌洗液中加人 PBS 0.5mL 2000g 离心 5mm, 弃去上清液 残留 100 供 L 左右的液体 取 20 尸 L 涂片 自然风干后备用 用瑞氏染液染 30S 用水冲洗 ; 用新配制的 Giemsa 工作液 ( 将 50 匹 Glemsa 储存液溶干 1mL 缓冲液中 ) 染色 5mm 镜下观察着色后用水冲洗 晾干后用中性树胶封片 镜下观察, 随机取 5 个视野进行血细胞分类计数 1 6 肺组织炎症因子表达的变化小鼠麻醉后 打开胸腔 迅速取出肺组织在液氮中研磨 用 Trˉ iz lˉ 氯仿 ˉ 异丙醇法提取总 RNA 取 2 件 grna 逆转录合成 cdna 并进行 RealˉTimePCR 以 TNFˉα ILˉ1β`ILˉ6 为目的基因 βˉactin 为内参 用标准曲线法进行相对定量 所用弓 物为 ;TNF α F 5 ˉGAACAACCCTACGAGCACCTˉ3 R;5 ˉGGGTAGTTTGGCTGGGATAAˉ3 ; ILˉ6 F;5ˉTGTTCTCAGGGAGATCTGG ˉ3 R:5 ˉTCCAGGTAGAAACGGAACTCˉ 3 ;βˉactin F:5 ˉCGGTCAGGTCATCAC TATCG-3 R;5 ˉTTCCATACCCAGGAA GGAAG-3 [5=6] L7 统计学方法实验测定数据以均数 ± 标准差 ( 贡 ±5) 表示, 采用差异显著性统计分析 ( 用 SPSSV13.0 软件进行统计 ) 进行多组结果比较时采用单因素方差分析 ( newayanova) 进 - 步采用 StudentˉNewmanˉKeulS 法进行两组间的比较分析 以 P<0 05 为差异具有统计学意义 2 结果 2.1 各组肺组织病理变化和相比, 小鼠在 6h 开胸后就可见肺脏明显充血 ( 数据未显示 ),12h 可见肺泡大小不等 肺泡隔增厚 已经很少见到正常形态的肺泡结构 明显充 血 并可见灶性出血, 这些改变在 12h~4d- 直很明显 低剂量白黎芦醇组小鼠 肺脏在 24h 内和模型相类似 从 2d 开始可以发现肺泡隔增厚 程度 充血均弱干 高剂量白蔡芦醇组小鼠肺脏在 24h 内和相类似 在 2d 开始可 I 霉霉霉 {

3 0 +一7 0 +一5 2 +一7 4 +一1 镶镶 ]354 以发现肺泡隔增厚程度 ` 充血均远远弱子 也弱干低剂量缉 在 4d 时其外观颜色 结构等已趋干缓和 如图 1 所示 在 4d 时 虽然各组的炎性细胞均比 2d 时大量增加 但和相比 接受白黎芦醇治疗的小鼠肺部炎性细胞较少 其中今高剂量组的效果更为明显 2.2 肺组织湿 / 干质量比比较 LPS 作用后 小鼠肺组织湿 / 干质量比显著高于 (P<0,05) 表明出现肺水肿 模型复制成功 和相比 白黎芦醇组小鼠肺在 2d 以后组织湿 / 干质量比明显降低 (P<0,05) 结果见表 支气管肺泡灌洗液中白细胞总数和分类计数比较在不同时间点取支气管肺泡灌洗液迸行细胞染色分类计数 ( 表 2~5) 单核巨噬细胞 淋巴细胞 壬 ± Ⅱ ` 巴 干中 { 工狸性粒细胞及白细胞在中均显著 ^ 山川巴 ~ 吕 = 冉 些 一 ˉ-= chinjclinpharmacolther2011dec;16(12) 的小鼠和相比 在 2d 4d 均有明显下降 (P<0.05) 其中高剂量组的效果好于低剂量组 (P<0.05) 升高且持续到 4d 以上 而接受了白黎芦醇治疗图 1 各组肺组织病理变化 (HE 100) 表 1 肺组织湿 / 干质量比较 ( 贡 ±s Ⅶ=20 组别 量剂言R 组e S 5.81± C 578±O42b 6 5 C 向与比较 bp<0.o5 与比较 ep<α05 5 6ˉ03±α31b 8 9 ± ± d 6D8±0 51b 5.71±O 31c 5.49±α23 嚼 6 0 4d 2 4 b 5ˉ40± ± 轰 2 小鼠肺炎模型支气管肺泡灌洗液中的单核巨噬细 咆盒奎 ± 垫坚些 g 兰 12h1d2d 组别 37± g8±0.83,8±α73.6± { ±O.8 一2b 5.2± ]0ˉ9±0,7 2]ˉ2 士 6 7t 5 4±α b 42.3±10.1k +_ 一0 齐5 1 量R 组吗l0.9±0.8 e S 哩=一向与比较 bp<0.05 一3 小鼠肺炎模型支气管肺泡灌洗液中的淋巴细胞分类计数 ( α! 一 g1 兰 衣 d 4d 1d 12b 组别 L63±O.9C L59±0,89 142±α84 13O± ± ± O ± b 254±α ˉ76±2 34 一1 2b 233± ±0 34 ` 1 2 =剂鲁R 组6D3±2.02b e s 223±α4C L54±0 22 向=4d 与比较 bp<0.o5 2.4 肺组织炎症因子表达的变化 LPS 是已知的多类炎症因子的强诱导剂,TNFˉα ILˉ1β ILˉ6 的含量也是评价炎症的指标之一 在不同时段获 取肺组织匀浆, 用 Rea1ˉTimePCR 的方法检测几类炎症因子 mrna 表达情况 ( 图 2 以相对于 12hmRNA 表达量的相对激活倍数表示 )

4 巴盐 q 0 蹿} 上驱撅四m挫 凶勺 毛 兰 U 中国临床药理学与治疗学 2011Dec;16(12) 1355 强烈激活了 TNFˉα ILˉ1β ILˉ6 的表达 且高剂量组效果好干低剂量组 而接受白黎芦醇治疗后炎症因子表达显著降低 表 4 小鼠肺炎模型支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞分类计数 ( 104/mL 12b 1d 2d 4d 1.01± ± ± ± ± ± ± ± ±11.1C ± ± ,57±79.42b 高剂量 ReS 组 士 士 9L ±110.22b 士 6025b 凸与比较 bp<0 05 表 5 小鼠肺炎模型支气管肺泡灌洗液中的白细胞分类计数 ( 10 绷 /ml) 组剔 12b ] 后 2d 4 用 4 53± ± ± ± ,67± ± ±127, ± ± ± ± ±78.44 高剂量 ReS 组 士 2O 士 9O83 351ˉ54+ ] ±6O94!] 与比较 bp<0.05 TNF α ILˉ1β IL 宦 圆固低剂量 Res 组 4(] l 团高剂量 Res 组图高剂量 ReS 组氟辙 毕32 00 毕同高剂量 ReS 组埋蜒熟蜒组别 胆挺 卓 了吁刊十 q{ 50 > 枷 ; }} 扑 + 广上川冗<卜钢瑟 Ⅷ刚 门Ⅶ β 广 刮 = 司厂 7 霖广 瞬 ˉ 爵 0 β ˉ 镭下壬 w&们12h1d2d4d12h1d2d4d12h1d2d4d 切图 2 肺组织炎症因子 mrna 表达的变化 ( 勇 ±S Ⅲ=20) 3 讨论成功的 人及动物多种急 慢性炎症性疾病 已有研究证. 的效果还存在 _ 定的剂量效应 慈犁撇%叭 聪咖 耻 印燃镶 i 肆 ˉ拦墅ˉ月P = 出 日译巴> 0尸.=季 ˉU 鳃 叫窍 n 玉 理刹贵 廷噬d铡蔚R唾翱毕鲤 凹瓣瓣b 叮辩 细胞显著升高 说明小鼠重症肺炎模型的建立是 重症肺炎是肺实质炎症的危重状态, 容易合通过肺组织病理检查 肺组织湿 / 干质量比测 并急性呼吸窘迫综合征 急性心功能不全以及多定和支气管肺泡灌洗液中细胞分类计数等指标 器官功能衰竭等并发症 目前认为 重症肺炎的我们发现吸人 LPS 可导致小鼠出现严重的肺损 发生除与严重的细菌 病毒感染有关外 机体防御伤 但白黎芦醇对小鼠的重症肺炎肺损伤有 _ 定 机制的过度激活 ` 炎 性细胞因子的大量释放在发的保护作用 在接受白黎芦醇治疗后的 2d 起 病中起重要作用 小鼠的肺水肿开始趋干缓和 炎性细胞数量也较 LPS 是细菌主要的致病因子之 _ 可以弓 起未接受治疗的有显著降低 同时保护作用 实液体咽后壁吸人 LPS 所造成的肺部炎症比较炎症反应对机体的损害主要由炎症过程中释 均一稳定 并且可以进行定量研究 炎症的程度和放的多种炎症因子共同作用所致 TNFˉα 是参时程与患者情况相似 [,ˉ 喇. 本研究中, 小与炎症反应重要的炎症因子, 爸作用干多种细胞, 鼠均出现明显的感染中毒症状 呼吸急促 部分出激发 _ 系列级联反应 诱导 IL-6 ILˉ1β 等多种炎 现嗜睡 尿量显著减少 肺组织大体及光镜下均显症因子导致炎症 7] 其中 ILˉ6 能催化和放大炎 示双侧多叶的病变, 肺泡灌洗液白细胞及中 性粒性反应和毒性作用 造成组织细胞的损害 已有 嗡墨蕊孽蕴聪露臻霉霉霉霉露 出勤

5 一 == F T 镶镶可 同 刊巴~~0]9560 憾徽.戮攘 ˉ辩瓣函酷镭研究发现, 白黎芦醇在抗急性胰腺炎 病毒性心肌炎 ` 关节炎方面 的机理主要是通过抑制 NFˉ 爬 B 的活化等多种方式降低巨噬细胞释放 TNFˉα ILˉ 1β IL-6 NO 等炎症因子 抑制 Thl 型细胞功能亢进 以及抗氧化 清除自由基等 [2 在本研究中, 白黎芦醇处理 4d 后 与比较, 肺泡灌洗液白细胞及中性粒细胞 单核巨噬细胞 ` 淋巴细胞数目 以及肺内总 TNFˉα ILˉ1β ILˉ6 等炎症因子的 mrna 表达均呈现明显的下降趋势, 说明白黎芦醇对控制炎症反应的发展有一定的作用 本研究发现白黎芦醇能够显著抑制肺部感染引发的炎症反应的发展进程, 对重症肺炎导致的肺损伤有较显著的保护作用 其机制可能是降低炎性肺组织中 TNFˉα`ILˉ1β ILˉ6 等的含量, 从而减轻炎症反应 今后, 配合抗生素等药物 白黎芦醇极有可能为临床重症肺炎的治疗提供新的策 略 参考文献 [1]TSushimaK KingLS AggarwalNR etal.acute lunginjuryreview[j]intemmed 2O09 48(9): 62]-630ˉ =Ⅲ0 攘o懒撼 橇 :: 赣 ; 慧 宰蹲p 岳$ 一望 g= 2 嚣譬焉 墅 F 罐守 = 7 罗摆器煽铲 ChinJClinPharmaCOlTher2011DeC;16(12) [2 PervaizS,HolmeAL Resveratr l:itsbiologictarˉ getsandfunctionalactivity[j AntioxidRedoxSigˉ nal (11): ChenH BaiC,wangX.Thevalueofthelipopoˉ lysaccharideˉinducedacutelunginjurymodelinreˉ splratorymedicine[j]expertrevrespirmed, (6): [4 GuoL LiW XuM,etal,AmOusemodelo{aˉ CutelunginflammatiOninduCedbylipopolySacchaˉ rideinhalation[j]beijingdaxuexuebao 20O9, 41(2);226 一 229. [5]ThakurV,PritchardMT McMullenMR etal. AdipOneCtinnOrmalizesLPSˉStimulatedTNRαprOˉ ductionbyratkup{{ercellsafterchronjcethanol {eeding[j]amjphysi lgastr intestliverphysiˉ ol, :G998_G1007 [6]CaoH,GuoY weil etal.e{{ectofartemisinin onlunginjuryinsepticrats[j]actaacademiae MedicinaeMilitariSTertiae (10): [7]Yimin KOhanawaM.Aregulatorye{fectofthe balancebetweentnf_alphaandilˉ6inthegranuˉ lomatousandin{lammatoryresponsetorhodococˉ cusaurantiacusinfectioninmice[j]jimmunl 2006,177(1): β 日 ˉ PrOteCtiVeeffectOfReSVeratrOlOnLPS inducingmiceacutelunginˉ flammation JINWanˉbing Zhe/tα?gP UiⅦciαlI725 雄况 tg/o =FOOdα7!αD 厂况 gco!t 厂 O Hα gzho 况 31O004,Zhejiα g,chi lα ABSTRACTAIM:TStudytheprteCt1Ve effectofresveratrol ntheacutelunginflammaˉ tininexperimentalmiceanditsmechanismof action.me1hods:theacutelunginflammaˉ tinmdelwasestablishedinmiceandmice werei p.treatedwithresveratrorvehiclein4 d.thecurativeeffect {`ReSVeratrOlwereObˉ SerVed,aswellaStheChangeSOfdifferentialleuˉ kocytescountinbronchoalveolarlavagefluid, theexpressionoftnfˉαil-1βandilˉ6after treatment.results:theresultsshowedthat ReSVeratrOlcOuldSignifiCantlyrelieVetheCliniCal SymptmSOfaCutelungin{lammatiOnandcOuld reducethenumbersandpercentagesofleuk ˉ CyteSinthebrOnCh alve larlavagefluid The activati noftnfˉαilˉ1βandilˉ6wereinhibiˉ tedbyresveratr LCONCLUSION:TheSe{indˉ ingsindicatedthatresveratrlpssessedreliable Curat1VeeffeCtfraCutelunginflammation in whichtheinhibition finflammatory{actors esˉ peciallytnfˉα ILˉ1βandILˉ6waSapOtential antiphlogisticmechanism. KEYWORDSReSVeratrol;MiCe;ACutelung inflammatin;protectiveeffect 本文编辑 : 储冀汝

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