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1 凌雪 梅 楼哲丰 吕 建新 * 方可 欣 张春玲黄锋 l 金龙金李传连费 前进 1 张李雅 l Journal of ell Biology 008, 30: mttpase6 基因变异 与 弱精子症的相关分析 (温州 医院命科 院 浙江省医遗传重 点 实验室 温州 ; 1 温州 医院 附属第 一 医院 殖医中 心 温 州 ;温州 医院 实 验中心 温州 ) 为了分析 mttpase6 基 因 突变 与 弱精子症的相关 性 按 WHO 标 准收集 了 7 例弱 精 摘要 子症精 液标本和 8 例精子 活 力正 常精液标本 PR扩 增 mttpase6 基 因 纯化坝1J 序 分析 mttpase6 基因突 变 比 较 两组 突变频率 的 差 异 结合 信息 工 具分析错义突变位点 的 氨基酸进化保守 性及其蛋 白质部分三 级结构 结 果显 示:发现了 6 个 未 曾 报道过的 交交往 点 ;弱精子症纽 mttpase6 基因 平均突变率显著高 于 对照组 可 能 与 弱精子 症有一定的相关 性 G G 和 G905 3 三个错义突变 可 能是多态性位点其余 8 个错义 突变 中的 6 个具有进化保守性 的 位点累 计 突变 频率 弱精 子症 ; mttpase6 ; 点突变;进化保守 ; 三 级 结 构 的缺失 这些缺 失基 因中的哪个基 因才是引起 线粒体 育龄夫妇的 严 重 问 题 003 年 Hir s h [ll 报道 在不 供能障碍的 主要 因 素 或 者是综合 作用 结 果 需要进 一 孕的夫妇中有一 半是因为 男 方的精 子 质量异常或 性 步对单个 基因缺失或 突 变进行研 究 Spiropoulos 等 功能障碍所 引起 精子质 量 下降可 区 分为精 子 密度 [41对 1 名有 mtdn 343G 突变 男 性精 子进行分 析 一 按 WHO 标准 将精子活力分为四级 :a 级精子 为 中检 测到 mttpase6 T881 突变 但这些突变与精 子活力 低 下或少精子 症是否相 关 还不能确 定 级精子为原 地运动精子 d 级精 子 为静止精子 若 a 国 内外 对是否存在 着 其 他 可能与弱精子症相 关的线 级 <5% 且 (a+b) 级 <50 % 可诊断为弱精子症 但引起 粒体基因 突变方面 的 报道还非常少 本研 究采用序 精子活力降 低的原因还不 清 楚 线粒体是 的 供 列分 析 法分析了 7 例弱精 子症和 8 例 正常对照 的 能中心 也是 精子活动 主 要能 量 来源 虽然组 成 线 mttpase6 基 因 突 变 并 结合信 息 途径分 析错 粒体呼吸链 和 氧 化磷酸化代谢酶 复合 体的亚 基 中大 义 突 变位点 在不 同种间 氨基 酸进化保 守 性及其蛋 多数由核基因 编码 但线粒体基 因编码了呼吸链和 氧 白质三级结构预测 试图探讨可能 与 弱精子症相关 的 化磷酸化 TP 酶 4 个 复合体中的 13 个亚基 这 13 个 mttp ase6 基 因点 突变 1. 1 研究对象 弱精子 症精液标本来自本校附 属医院殖医 密切 近年来 对线粒体基因缺失和 点突 变与弱精 接受日期 缺失导致了线粒体 OX3 ND3 ND4L T Pase8 与精子活动 力障碍有 关 收稿日期 : 浙江省自然科基金 (No.Y0658)和温州市科技发展计划项目 (No Y ) 资助 *通 迅作者 Te l: , Ijx@wzmc.net 子症的相关研究越来越 重视 Kao 等[川]报道发现精 TPase 6 1 材料与方法 F_OF_l-TPase 的 第 6 亚单位 主 要构成质 子通道 参 子 mtdn 坤 7345 bp 和 7599 bp 片段缺失 目前 TPase6 和 TPase8 其中 mttpase6 基 因 是编码 与线粒体氧化磷酸化过程 与能量代谢 关 系 非 常 J 快速前向运动 精子 b 级精 子 为慢速前向运动精子 c 相关性 Holyoake 等 [51 在 一 个严重少精 子男 性 精子 认为突变的程度 和 精 子 活动力降低程度有非常强 的 症 临床上 精子活力是衡量 精 子 质量 的 重 要指标之 降低和精子活 力低下 分 别 称为少精子症 和 弱精子 亚基有 DNI-DN6 ND4L OXI - OX3 ytb 明显升高 不孕 症已经成为涉及全球各个国家和 地 区 ND4 ND5 N D 6 ytb 基 因和 8 个 trn 基因 随着社会工业 的不断发展 不育 夫妇的总发病率 关键词 显著高 于 对照 组 这些位点突变可能 与 弱精子症有 关 hine se -

2 将序列 比 对结果进行统计分 比 较采用 t 检验 应用 SSPS 软件进行 分析 和 ::t: 1. 所有标本采集前禁欲 3 天 以上 手 氨基酸变异分析和氨基酸进化保守性分析 淫法采集精液标本 3 7. 液化 0-30 min 对筛 查 到的 变异位点 在 Mitomap 数据库中的 mino 1. 主 要试剂 cid Translation Table s 查找氨基 酸的 相 应改变 分 照 a 级和 ( a+b ) 级精 子百分率分 别为 46.9 士 1.3 针 析 组间突变率 的比较采用卡方检验 平均 突变率的 析 基因变异 对应的 氨基酸在不 同 种 之间 保守性则 GGT GTGG-3' {立于 mtdn 通过在 NBI 网站 (www. ncbi. nih.gov)检索到 人 (Homo 下游序列 :5叩GGGTGGTTGGTGTT sapiens) 牛 (Bos taurus) 小 鼠 (Mus musculus) 爪 G-3' 位于 mtdn 扩增片段长 908 bp; 蜡 (Xenopus laevis) 4 种的线粒体 基因组序列对 引 上游序列 :5 飞TITTT TIGT-3' 应的 mttpase6 氨基酸序列 利用 BioEdit 软件包分 GTTGTGTIT-3 ' 位于 mtdn 扩增片 种之间的进化保守性 段长 815 坤 引由 宝 工程 (大连)有限公司合成 ; PR 聚合酶试剂 DN 片段纯化试剂盒为宝工 采用 TMHMM 软件 ( s.dtu. dk/services/ 程(大连)有限公司 产 品;琼脂糖 Tris 试剂为 Promega TMHMM/)进行预测 参数采用默认设 置由于蛋白 公司进口分装 ;蛋白酶 K 为 Merk 公司的产品; Tris- 饱 质的功能主要体现在三级空间结构上 我们 采用基于 和盼(pH 8.0) 为上海 工程技术服务有限公司 产 品 同源建模原理的 phyre 己液化标本用 PBS 洗 采用默认设置 结果可视化 过程在 PdbViewer mmol/l ph 8.0 Tris- /expas y.org/spdbv/) 哮件中操作 (http: / 涤后的精子 加精子裂解液 ( 500 (http : // c.ac.u k/ phyre/) 软件对 mttpase6 三 级结构 进行 预测 参数 精子 mtdn 的 提取 mttpase6 跨膜区 蛋白 质 三 级结构预测 1.3 方 法 析对比 观察错义突变位点编码的氨基酸在 4 个不同 位于 mtdn 下游序列: 5 ' -GTGGπG 5'- 统计 分析 3. ::t: 3.4 殖系统无器质性病变正常 男性作为对 PR 扩增引依据文献 [6l 引 1 上游序列 : 库中检索是否己报道过 1.4. 将序列 比 对所发现的所有 突变位点在 Mitomap 数据 子活动力正 常 (a 级 >5 % 且 a+b 级 >50 %) 平 均 年龄 ::t: 7.04 和 0.38 ::t: 同时我们 选取了 8 例精... hormaspro 软件读取测序结果峰图 进 一步确认 平均年龄 3 O::t: 5 岁 a 级和 ( a+ 阶 级精子百分率分 别 为 粒体剑桥序列进行比对 发现可疑的变异 位点后用 子活动 力低下 ( a 级 < 5 % 且 a+b 级 <50 %) 病例 7 例 中心 按 世界卫 组织 (WHO ) 精液 参数标准 选取精 661 金龙金等 : mttp ase6 基因变异 与弱 精 子症 的相 关 分析 TE 溶解.1 PR 扩增结果 游引和下游 引 ( 10μmollL)各0.5μ1 μ.5 mmol/ 预期产 908 bp 和 mtdn 区域预期 产. 测序比对和突变频率分析 测序结果与剑桥序列 比对 两组 55 例 精子标本共 Free), 0. 1μ1 Taq 酶 补充 ddh 0 至 bp 一致 的目的片段 缓 冲液 (M g+ L 岱HP混合 1. 5μ1 5 mmolll Mg1,.5μ110xPR μl 反应体系在 94. 预变性 5 min 后 按 94. 变性 次 最后 7. 终末延伸 8 min 扩增 产 用 1. 5 % Mitomap 数据库中查找发现 6 个突变位点未见报道过 琼脂糖电泳鉴定 分 别 是 8586G 8811 T T885 T8966 程(大连)有 限公司 DN 片段纯化试剂盒说明书操作 T 910G 突变 (表 1 和图 1) 0 mttpase6 基 因平均突变率在两组间 差异有统计意义 (P<ü.O日 平 按 宝 工 PR 产 的 纯化和序列测定 检测到 mttpase6 基因 0 个位点的 碱基突变 经在 30 s, 58. 退火 45 s, 7. 延伸 1 min 程序共循环 均错义突变率组 间 差异无统计意义 (P) (表 ) 司 进行正向测序.3 mt TPase6 单个位点错义突 变频 率分析及 测序返回结果用 Gentle 软件与 Mitomap 数据库 ( 上提供 的人类线 对 mttpase6 基因单 个位点错义突变频率较高 序列 比对 其氨基酸进化保守性分析 的 G G G9053 突变频率 在两组间 1. 4 数 据分析 r 纯化PR产 纯化产 送上海基康技术有限公 经过 PR 分 别 扩增出与 mtdn 区域 1μlDN 模板 上 PR 反应和 产鉴定 结果 56. 消化 h 常规酣 - 氯 仿法抽 提精子基因组 DN H1, 10% SDS, 0 mg/ml 蛋白酶 K 10 mmolll DTT),

3 研究论文 66 mttpase6 基因 0 个变异位点对应的氨基酸相关信息保守性 H/B/M/X NVNfI 表 1 -' 是否报道过是否是是是是是否是否是是是否是是否是否是F/F/FID T/V/I/F NS/L/Y H/H/H/Y S/S/SIS M 爪 1/M/L I/I/I/I I/I/I/L S/G/G!T S/M/M/L 氨基酸变异类科酸基氨点位))刀该--叫吻Danuks才(liSZ引二tHhM咄EMOrKKmakrbt剖J-UUH叮'但拍副而咱们d1u J咀川叫甲叫 mωuj仆 b 向山川一忡aaerrosJd叫到nafpJH叫HHHHUL--zEMmMmmm阶mNLm灿的MNhhhhhuh-悻.,吁ι -P刀'-分-母-字-的-下-栏911却 该-幡-爪-鼠-牛4G ZGFHK中才中川Gf)fJG孔中才 GG-JGTTecTTGTGT--λ.匕曰 ιb句ι4-p刃-分- x - M E,,, - RM - Hn 一栏 l5798一位吁,哼f句fny1m- oonynynynynynye叭可保例数核营酸变异突变位点 TO O OTTOT 8584 内配创业 ω 叫 yn ç çτçoott O T 叫四品山 dj:n l~ 八八八八八八 MMMM l MMM 刷川 lw\ 八阳 wm 川队川 \M 恤灿 d 州的 υ叮fam - " ' nw Fν 俩 匀FU OB T H V f n v,. l n",. ",., 0 图 1 mttpa se6 基因部分突变位点的测序峰图 l: G8584 突变 : 正常 8584 位点 ; Bl: 8794T 突变 B: 正常 8794 位点 ; 1: T88 1 G 突变 : 正常 88 1 位点 ; Dl :T8 85 突变 D: 正常 885 位点 01

4 mttp as e6 基因 的 其余 8 个错义突变因单个位点突 测 结果 尽管人类线粒体基因组只编码 了 1 3 个 蛋白质 的 累 计突变频率在弱精子症组和正常对照组分 别为 但是大多数都还没有获得三 级结构 mttpase6 就是 37.04% 和 % 经卡方检验比较在两组问 差 异具有 其中 一 个代 表本研究对其跨膜区的预测 表明 变频率较 低 两组间没有可比性 这 8 个 突变位点 mttpase6 的结构为 6 次跨膜结 构(图 3); 对三 级结 统计 意义 (P<0.01) ( 表 的 对这 8 个 突变位点所 构(包括 mttpase6 的 59 到 15 位置 ) 观察这部分 蟠这 4 种中不 具有进 化保守性外 nt 860 nt 三 级结构发现其主要由 a 螺旋和环 (loop) 组成 而 b 片 8794 n t 881 n t 885 nt 8966 和 nt 9016 这 6 层结 构不存在 0.89 土 0.67 l l P值 χ 值 百分比 í..'&1 百分比í..'&1 n=7 n=8 为错义突变 对!照 组 G- ð -G T- ð -T ð -G ð T- -T ð -T T-G ð T- ð -T G- -T T- ð -G ð G- ð -T ð T- -G -G 9016 这 6 个 编码氨基酸进化 保守性位 点 中 nt 860 nt 9016 这 个位 点 的 氨基 酸不在可预 测 的 三 级结构 弱将组 核背酸变异 860 n t 8794 n t 88 1 nt 885 nt 8966 矛日 n t mttpase6 基因 0 个突变在弱精子症组和正常对照组中的分布 表 土 0.78 <0.05 平 均错义 突变率 P值 0.96 土 0.84 对照组 1.5 土 号精于症组 平均突变率 突变位点 库 中检索到的 mttpase6 基因突变位 点所编码的 氨 因 0 个 突变位点所编码的 19 个 氨基酸 大部分都 集 基酸 进行分析 也发现类 似现 象 我 们 分析的 n t 和平均错 义突变率 的 比较 有意思的是 本研究所检测到的 mttpase6 基 中于 mttpase6 的 6 个 跨膜区同 时 Mitomap 数据 弱 精子症组与正常对照组 mttpase6 基因平均突变率 构的预 测 结果首次得到了 一 部分 mttpase6 三 级结 编码的氨基酸进化 保守性分析 除 nt8684 和 nt 9071 位 点 所编码 的 氨基酸在所分 析的人 牛 小鼠和爪 表.4 3 种 中具有进化保守性 其中 n t 881 和 nt8966 mt TP ase 6 跨 膜 区预测和 部分 三 级结构预 3 个位点 可能是多态性位点 剔除这 3 个 位点后 个 位点 所编码的 氨基酸在 所分析的人 牛 小鼠这 r, 差异具 有统计 意 义 (P<0.05) 根 据上述分析 G G G9053 这 保守性的 6 个 位点累 计 突变频率在弱精 子症组和 正 常对照组分 别 为. % 和 % 经卡 方检验两组 中不 具 有 进化保守性( 表 1 和 图 )... 爪蜡这 4 种中具有高度进化保守性 且具有进化 分析 结果显示在 人 牛 小鼠和爪蜡这 4 种 位点所编码的氨基酸在 所分析的人 牛 小鼠和 同时对这 3 个 突变位点 所编码的 氨基酸 进行保守性 差 异 比 较经卡方检验无统计意义 (P ) (表 3) 663 金龙金等 : mttpa se6 基因变异与 弱精子 症 的相 关分 析

5 <0.01 中 nt 编 码的氨 基 酸位置非常靠 近可预测的 三 只对 nt nt 881 nt 88 5 这 3 个位点 的 氨基 预测 结果在 对 nt 88 1 突变 前 后获得 的 三 级结 构进 88 5 这 个 位点 的 氨基 酸 突变 前 后 Holyoake 等 [7] 发 现 个 最常 见的线粒体基 因 突变 9055 和 在 低 活 动力 精子 中 发率显著 提 高 其 中 9055 突变位于 mttpase 6 基因 Thangar句 等 [8] 图3 mttpase6 跨膜示意图和部分三级结构示 意图 : rn t T Pase6 跨膜结构示意图 其中跨膜区通过 TMHMM 软件 预测获得 B ' 正常情况下的部分 三 级结构示意图 采用 ph y re 软件 在一例低活 动力精子患者中 通过对 mttpase6 基因 预测获得; 测序检测到 10 个 单核昔酸替 换 其中 8678 突变 为 加得到 的 结构示意图 D B 3 讨论 mttpas e 6 三 级 结 构 没有发变 化 三 级结构发 了 非 常明 显 的改变 ( 图 3B - 图 3 D) 但 nt 酸突变引起 mttpase6 部分 三 级 结 构的 影 响进行了 行比较时 ( 比 较方法采 用 superposition ) 发 现其 相 应 w 级结构的 端 可能对预测的 可靠性 有影 响 因 此我们 / P值 : T881G 突 变后的部分 三 级结构示意图; D: B 和 叠 χ 值 为错义 突 变 百分比(%) n=8 T- '" -T '" -T '" T-G '" T- '" T- '" -G '" -T '" 对照组 百分 比( % ) 弱精组 n=7 核背酸变异 mttpase6 基因 8 个错义突变在弱精子症组及正常对照中的分布 合计 8701 n t 8794 nt 881 nt 885 nt 8966 nt n t 表4 突 变 位点 nt mttpase6 基因 11 个错义突变位点在 4 个不同种间的氨基酸进化保守 情 况 和 n t 位点氨基酸进 化 保守性情况 从前到 后 "* "标出分 别 是 nt 8584 n t 860 nt 8684 n t 60 图 50 丰 Homo sap;ens 80S laurus Mus muscu/us Xenopus laev;s 研究论文 11 0 *事 170 * Homo sap;ens 80S taurus M us muscu/us Xenopus laev;s * * 0 10 Homo sap;ens 80S taurus Mus m usculus Xenopus laevls 664

6 家系的 3 个患者研究发现 培养的患者成 纤维 未见报道过 其中 T88 5 T T 这 3 TP酶复合体发组装的改变和结构的不稳定性 该 个为错义突变 这些发现为线粒体基因突变研究丰富 位点氨基酸在爪蠕 小鼠 牛 人也 具有高度的 了资料 对在 mttpas e6 基因所检测出的突变率的 进化保守性 如果将进化不保守的 个位 点剔除 6 个进化保守位点的累计突变发频率在 弱精子症组 T 88 5 T T 910G 这 6 个突变 1 个带有 mttpase6 T8993G 突变的婴儿乳酸尿毒症 间进行比较 mttpase6 基因平均突变率具有统计 因 此我们 推测:这 6 个位点的突变与弱精 子症的发 意义 (P<O. O日 提示 mttpase6 基因的突变率与弱精 可能存在 一 定的相关性 或者 6 个位点中 某 几个位点 子 症 可能有相关性 从理论上讲错义突变对蛋白质 突变与弱精子症存在 一 定的相关性 我们 进 一 步对 的结构和功能可能产 影响但统计结果 mttpase6 6 个进化保守位点中可预测 三 级结构的 3 个位点 氨基 和正常对照组间比较 差 异具有统计意义 (P<0. 05 ) 因的平均错义突变率 对弱精子症组和正常对照组之 (P>O.O日 我们推测可能是其中存在多态性变异位点 T881G 突变引起的氨基酸变异使 mttpase6 部分三 酸突变对蛋白质 三 级结构 的 影响进行预测 发现 基因平均错义突变 率 两组间比较 差 异无统计意义 这 3 个发频率较高的错义突变位点 突变率两组间 同 同为错义突变但突变性质和突变后氨 基酸变化不 比较 差 异无统计意义 (P>0. 05 ) 突变位点所编码的 同 Holyoake 等同时进行了单精子分析 发现在 氨基酸在分析的 4 种中不具有进化保守性 这些 未成熟精中有 7 % 的突变而在成熟精 子中未发 Holyoake 等 [5] 在严重少精子症中发现的 突变位点相 我们首先分析了 G G G9053 现突变 他们认为 T881 突变使精成 熟障碍 由 此 我们 认为 T881G 突变在 6 个进化保 守位点 的 错 所检测出的其余 8 个错义突变率在两组间进行比较 义突变中更值得关注 结果提示这 3 个突变位点可能是多态性位点 如果 这 一 推测成立 我们 剔除这 3 个突变 将 mttpas e6 级结构发了非常明显的改变 ( 图 匀 该 突变位点与 并对统计结果产了影响 变可能影响蛋白质空间结构和功能 Houstek 等 [9]对 M itoma p 数据库中查找发现 8586G 8811 T 比较 我们统计了 mttpase6 基因平均突变率及其基 形成和稳定 蛋白质功能的形成具有重要作 用 其突 进行了分析 共检测出 0 个位点的碱基突变 经在 保守性角度推测 这 6 个位点对于蛋白质 空 间 结构的 8 例精子活动力正常对照精子 mttpase6 基因序列 性 但与爪蜡比较该位点氨基酸具有 差 异 从进 化 在本研究中 我们用序列分析法对 7 例弱精子症和 错义突变 而在血液中没有发现核昔酸替换 665 金龙金等 : mttp ase6 基 因变异与弱精子症的相 关 分析 由 于单个位点的突变率都很低 两组间没有可比性 参考 文 献 ( Referen ces) 现 nt 88 1 nt 8966 位点密码子编码的氨基酸在爪 蟠 小鼠 牛 人具有高度进化保守性; nt 860 nt 8794 nt 885 和 nt 9016 位点所编码的氨基酸在 P画 ~ 所 分 析的人 牛 小鼠这 3 种中具有进化保守 错义突变在 4 种不同种间的氨基酸进化保守性 发 当 我们采用信息工具分析这 8 个位点的 Hirsh. BMJ, 003, 37: 669 Kao SH et al. Biol Reprod, 1995, 5: 79 Kao SH et a l. Mol Hum Reprod, 1998, 4: 657 Spiropoulos J et al. Mol Hu m Rep rod, 00, 8: 719 Holyoake J et al. ndrologia, 1999, 31 : 339 Rieder MJ et al. Nucleic cids Res, 1998, 6: 967 Holyoake J et al. Int J ndrol, 001, 4: 175 Thangaraj K et al. J ndrol, 003, 4: 388 Houstek J et al. Biochim Biophys cta, 1995, 171: 349 现弱精子症组显著高于对照组 具有统计意义(P<ü.Ol) [1 ) [) [3) [4) [5 ) [6) [7) [8 ) [9) 我们比较了两组间这些错义突变的累计发频率 发

7 666 Mutation nalysis of the mttpase6 ssociated with sthenospermia Patients Long-Jin Jin, huan-lian Li, Qian-Jin Fei 1, hun-ling Zhang, Xue-Feng Huang 1, Zhe-Feng Lou, Li-Ya Zhang 1, Ke-Xin Fang, Xue-Mei Ling, Jian-Xin Lu* - 研究论文 (Zhejiang Provincial Key Laboratory for Medical Genetics, School of L 扩 è Sciences, Wenzhou Medical ollege, '" 的 lzhou 35035, hina; lreproductive Medicine enter, Fi 川 ffiliated Hospital, Wenzhou Medical ollege, 陆 n zhou 35001, hina; bstract entral Laboratory of Biológy, 陆 nzhou Medical ollege, Wenzhou 35035, hina) This research attempted to investigate whether there was correlationship between mttpase6 point mutation in sperms and asthenospermia. fter 7 asthenospermia cases and 8 control cases were collected under the WHO criterion, the regions of nt and of them were amplified by using PR of two pairs primers. onsequently, the point mutation, mutation rate as well as evolutionary conservation pattern were analyzed by employing sequencing technology and bioinformatics tools. s a result, 0 point mutations were fo und, among which six had never been identified before: 8586G, 8811T, T885, T8966, 9071T and 910G. Meanwhile, a significant difference (P<Ü.05) was detected in 由 e average mutation rate between asthenosperrnia (1.5:t0.98) and control groups (0.96 士 0. 84), which suggests that a remarkable increase of mttpase6 average mutation rate may correlate with asthenosperrnia in asthenospermia.group. The three specific missense point mutation, namely, the G8584, 8701G and G9053, may be potential polymorphism. Besides, the differences between asthenosperrnia (.%) and control groups (%) were statistically significant (P<0.05) in terms of the cumulative mutation...~ rates for the remaining six sites with evolution conservation, which may have the relationship with asthenosperrnia. Key words asthenosperrnia; mttpase6; point mutation; evolution conservation Received: May 5, 008 ccepted: J une 17, 008 This work was supported by the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No.Y0658) and Wenzhou Science & Technology Development Program (No.Y ) *orresponding author. Tel : , lj x@wzmc.net -'

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