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1 162 南京中医药大学学报 2018 年 3 月第 34 卷第 2 期 J NanjingUnivTraditChinMedVol.34No.2Mar.2018 补肾益气活血方对干性年龄相关性黄斑变性模型小鼠视网膜氧化损伤的保护作用 谢婧, 李敏, 徐新荣, 杭丽 ( 南京中医药大学附属医院, 江苏南京 ) 摘要 : 目的研究补肾益气活血方对干性年龄相关性黄斑变性 (AMD) 模型小鼠视网膜氧化损伤的保护作用及机制 方法 6 月龄的雌性 C57BL/6 小鼠 60 只, 其中 10 只作为年龄对照组, 另 50 只高脂肪饮食喂养 6 月后, 饮水中加入氢醌 (8%) 继续饲养 3 月构建干性 AMD 小鼠模型, 并随机分为溶媒对照组 阳性药物 ( 乐盯 ) 组 补肾益气活血方组 ( 低 中 高剂量组 ), 灌胃给药, 每日 1 次, 持续 3 月 观察期满处死动物, 摘取眼球, 电镜观察 RPE 细胞下沉积物及 Bruch 膜 ; 眼静脉取血分离血清, 摘取眼球分离视网膜并匀浆, 检测血清和视网膜 SOD GSH Px CAT 酶活性及 ROS MDA 含量 ;qpcr Westernblot 检测 Nr2 HO 1 NQO 1 GCL mrna 转录及蛋白表达 结果与年龄组对照组比, 溶媒对照组小鼠 RPE 下沉积物显著增加,Bruch 膜明显增厚 ; 与溶媒对照组比, 补肾益气活血方组小鼠 RPE 下沉积物减少, 对 Bruch 膜增厚有抑制作用 ; 补肾益气活血方可提高血清及视网膜组织 SOD GSH Px CAT 酶活性, 降低血清及视网膜组织 ROS MDA 含量 ; 补肾益气活血方中 高剂量可显著升高 Nr2 HO 1 NQO 1 GCL mrna 转录水平, 上调胞核 Nr2 及 HO 1 NQO 1 GCL 蛋白表达水平 结论补肾益气活血方对干性 AMD 模型小鼠视网膜氧化损伤有保护作用, 机制可能是激活 Nr2 通路, 提高 SOD GSH Px CAT 酶活性, 上调下游靶基因酶 HO 1 NQO 1 GCL 表达水平, 增强对模型动物体内活性氧的清除作用 关键词 : 年龄相关性黄斑变性 ; 小鼠模型 ; 补肾益气活血方 ; 氧化损伤 ;Nr2 通路中图号 :R285.5 文献标志码 :A 文章编号 : (2018) DOI:114148/j.issn ProtectiveEectoBushenYiqiHuoxueFangonRetinalOxidativeDamageinModelMiceoDryAge RelatedMacularDegeneration XIEJing LIMin XUXin rong HANGLi Ailiated Hospitalo NanjingUniversityoChineseMedicine Nanjing China ABSTRACT OBJECTIVE ThestudywasaimedatevaluatingprotectiveeectoBushenYiqiHuoxueFangonretinaloxidativedamageinmodelmiceodryage relatedmaculardegeneration AMD andtoelucidatetheunderlyingmechanism METH- ODS 60six month oldc57bl 6emale mice 10 wereednormaldietasagingcontrol 50 wereedahigh atdietor6 monthsolowedbyhq 0 8% inthedrinkingwateror3monthstoestablisheddryamd modelmice Modelmiceweredividedrandomlyintovehicalcontrol positivedruglutein and3treatmentgroups dosagelow middlehigh Drugsweregivenonce dailythroughgastrogavageor3months Attheendotheexperimentalperiod themicewerekiledandtheeyesimmediatelyremoved Transmissionelectronmicroscopywereusedtoevaluatesub RPEdepositormationandBruch membrane BrM thickness Theserum wereseparatedromthebloodsamplingomiceeyevein miceretinaweredetachedandhomoḡ enated theserumandretinasod GSH PX CATenzymeactivityandROS MDAcontentweredetected ThemRNAand proteinexpressiononr2 HO 1 NQO 1 GCL weredetectedbyqpcrand Westernblot respectively RESULTS Comparedwithagingcontrolmice thesub RPEdepositswassigniicantlyincreased andthebruch membranewassigniicantly thickenedinvehicalcontrolmice BushenYiqiHuoxueFangcansigniicantlyinhibitsub RPEdepositormationandreduce thickeningobrminmodelmicecomparedtothevehicalcontrolmice thesub RPEdepositswasdecreased BrMthickness wasinhibitedintreatmentmice BushenYiqiHuoxueFangcouldincreaseSOD GSH PXandCATenzymeactivity reduce ROS MDAcontentoretinaandserumin mice mrnaandproteinexpressionsonr2 HO 1 NQO 1 GCLoHO 1 NQO 1wereup regulatedinmicetreatedwithbushenyiqihuoxuefang middle highdosage CONCLUSION BushenYiqi HuoxueFangcouldprotecttheretinaagainstoxidativedamageinmodelmiceodryAMD theunderlyingmechanism maybe toincreasesod GSH PXandCATenzymeactivityandup regulateexpressionsonr2 HO 1 NQO 1 GCLthroughactiva- 收稿日期 : 基金项目 : 江苏省自然科学基金 (BK ) 作者简介 : 谢婧 (1990-), 女, 硕士研究生 通信作者 : 徐新荣, 男, 主任医师, 博士生导师, 主要从事中西医结合治疗眼病研究,E mail:xinrong_xu@aliyun.com

2 谢婧, 等 : 补肾益气活血方对干性年龄相关性黄斑变性模型小鼠视网膜氧化损伤的保护作用 第 2 期 163 tiononr2pathway whichmaystrengthentheclearanceoreactiveoxygenspeciesinmodelmice KEY WORDS age relatedmaculardegeneration modelmice BushenYiqiHuoxueFang oxidativedamage Nr2pathway 年龄相关性黄斑变性 (Age relatedmaculardegeneration,amd) 分干性 湿性两类, 其中干性者约占 90% 干性 AMD 眼底主要表现为脉络膜毛细 血管萎缩 玻璃膜疣以及视网膜色素上皮 (Retinal pigmentepithelium,rpe) 萎缩, 晚期可发生黄斑区地图状萎缩, 导致视力明显下降, 还有部分干性 AMD 会进展为湿性 AMD 湿性 AMD 近年因抗 VEGF 治疗取得较大进展, 但干性 AMD 目前尚无 确切有效的治疗措施 研究表明, 核因子 E2 相关 因子 2(Nuclearactorerythroid2 relatedactor2, Nr2) 通路与 AMD 发病关系密切 [1], 激活 Nr2 通 路可以诱导机体产生抗氧化酶和 I 相代谢酶, 对氧 化损伤 ARPE 19 细胞起到保护作用 [2] 本研究使用的补肾益气活血方是我们治疗干性 AMD 的经验方, 为进一步提高临床疗效, 我们参考 国内外近年干性 AMD 研究进展, 结合们干性 AMD 药物防治研究成果, 对其进行了优化 本研究观察 优化后的补肾益气活血方对干性 AMD 模型动物视 网膜氧化损伤的保护作用, 以及对 Nr2 通路的影 响, 以探明作用机制, 为临床应用提供依据 1 材料 1 实验动物 6 月龄的雌性 C57BL/6 小鼠 60 只, 体质量 25 ~33g, 购自南京大学模式动物研究所, 生产许可证 号 :SCXK( 苏 ) 实验药物 补肾益气活血方由枸杞子 桑椹子 菟丝子 太 子参 葛根 生山楂 槐花 黄芪 白术 茯苓 川芎 三 七组成 中药饮片购自南京中医药大学附属医院, 药物共同水提后, 浓缩成含生药 2g/mL 的流浸膏 后 4 保存备用 阳性对照药物为乐盯, 主要成份 为叶黄素, 维生素 A, 维生素 C, 维生素 E, 维生素 B1, 葡萄酸锌 每 100g 含叶黄素 51g, 维生素 C06g, 锌 8g 5 60 粒 / 瓶, 广州市范乐医药 科技有限公司生产 3 实验试剂 氢醌 ( 美国 AlaAesar 公司,CAS: ), 逆转录试剂盒 ( 美国 ThermoScientiicFisher 公 司 )(SuperScript Ⅲ, ), 超氧化物歧化酶 (Superoxidedismutase,SOD)(A001 1) 过氧化氢 酶 (Catalase,CAT)(A007 1) 谷胱甘肽过氧化物酶 (Glutathioneperoxidase,GSH PX)(A005) 丙二 醛 (Malondialdehyde,MDA)(S0131) 活性氧 (Reactiveoxygenspecies,ROS)(E004) 试剂盒均自南 京建成生物研究所,Nr2 HO 1 NQO 1 GCL 引物 由南京金斯瑞生物科技有限公司合成, 兔 Nr2 单克 隆抗体 (EP1808Y) 兔 HO 1 多克隆抗体 (ab13243) 兔 GCL 单克隆抗体 (EPR6668) 小鼠 NQO 1 单克隆抗体 (A180) 小鼠 β actin 单克隆抗 体 (AC 15) 兔 Lamin B 多克隆抗体 (ab16048) 羊 抗兔 (ab6721) 和兔抗小鼠 (ab6728)igg/hrp 二抗 均购自 Abcam 公司 4 实验仪器 Bio Tek 酶标仪 ( 美国 Synergy 公司 ), 荧光定 量 PCR 仪 :CFX Real TimeSystem, 电泳系统 : Mini ProtenTetraSystem, 凝胶成像仪 :ChemiDoc XRS+ System( 美国 Bio RAD 公司 ), 超薄切片机 ( 美国 POWERTOMEXL), 透射电镜 ( 美国 FEI 公 司 TecnaiG2SpiritBioTWIN) 2 方法 2.1 动物造模 分组及给药 动物高脂肪饮食喂养 3 月后, 饮水中加入氢醌 至终浓度为 8%, 继续饲养 3 月完成造模 动物分 组 : 年龄对照组 ( 正常饮食 ) 溶媒对照组 ( 高脂饮食 + 氢醌 ) 阳性药物组 ( 高脂饮食 + 氢醌 + 乐盯 ), 补 肾益气活血方组 ( 高脂饮食 + 氢醌 + 中药 ) 补肾益 气活血方分低 中 高 3 个剂量组, 给药量分别为 : g/kg 乐盯给药量 1g/kg 溶媒为 蒸馏水 灌胃给药, 每日 1 次, 持续 3 月 2.2 电镜观察 观察期满处死动物, 摘取眼球, 放入 4% 多聚甲 醛中固定 20min 去除角膜 晶体及玻璃体, 在视 乳头两侧切取 2 4mm 球壁, 常规戊二醛 锇酸固 定, 环氧树脂包埋, 超薄切片后, 醋酸双氧铀及柠檬 酸铅双重染色, 透射电镜观察 摄片 RPE 下沉积 [3] 物半定量评定及 Bruch 膜厚度测量按照文献方法 进行 2.3 小鼠血清和视网膜 SOD GSH Px CAT 活性 检测 观察期满, 眼静脉取血分离血清, 摘取眼球分离

3 164 南京中医药大学学报 2018 年 3 月第 34 卷第 2 期 视网膜并匀浆, 在 3000r/min,4 下离心 10min, 上清用于检测 检测时取样 100μL, 分别在 nm 波长下按照 SOD CAT 和 GSH PX 检测试剂盒说明书操作测定 OD 值, 计算酶活性 2.4 小鼠血清和视网膜 ROS MDA 含量测定血清及组织取材同上 血清 ROS 检测采用 Fenton 反应及 griess 试剂显色法测定, 组织匀浆 ROS 检测采用 DCFH DA 法, 血清及组织匀浆 MDA 检测采用 TBA 比色法 上述检测均按试剂盒说明书操作 2.5 qpcr 实验观察期满处死动物, 用 Trizol 等试剂提取视网膜和脉络膜总 RNA, 按照逆转录试剂盒操作步骤进行反转录 所得 cdna 在实时荧光定量 PCR 仪上进行反应 每次扩增的同时设置 cdna 的阴性对照 将 PCR 产物做熔解曲线, 证实以上 PCR 反应 各组实验动物电镜观察代表性图片见图 1, RPE 下沉积物评分及 Bruch 膜厚度见表 1 与年龄对照组比, 溶媒对照组 RPE 下沉积物显著增加, Bruch 膜明显增厚 (01); 与溶媒对照组比, 阳性药物组模型小鼠 RPE 下沉积物减少 (P<05), 但对 Bruch 膜厚度影响不明显, 补肾益气活血方高 中 低 3 个剂量组均可使 RPE 下沉积物减少 (P< 05), 且中 高剂量的补肾益气活血方对 Bruch 膜厚度增厚有抑制作用 (P<05) 产物特异性良好 统计 Ct 值以比较各组 mrna 的表达 引物 :Nr2 F:5' AGTGACTCGGAAATG- GATGAG 3',R:5' TGTGCTGGCTGTGCGT- TAGG 3';HO 1F:5' GCTGGTGATGGCTGCCT- TGT 3',R:5' ACTGGGTGCTGCTTGTTGCG 3'; NQO 1F:5' ATGTATGACAATGGACCCTTCC 3';R:5' TCCCTTGCAGAGTGTCCATGG 3';GCL F:5' GAAGTGGATGTGGACACTAGATG 3';R: 5' TTGTAGTCAGGATGGTCTGCGATAA 3'; GAPDHF:5' ATGACATCAAGACGGTGGTG 3'; R:5' CATACCAGGTATGAGCTTG 3' 2.6 Westernblot 实验 从视网膜和脉络膜组织提取蛋白 (Nr2 另提取 核蛋白 ),BCA 法测定蛋白浓度 变性后取 50μg 上样, 用 10% 分离胶 5% 浓缩胶电泳, 之后转到硝 酸纤维素膜上 加一抗 (1:1000)4 孵育过夜后 加兔二抗 (1 5000),GAPDH 为内参 ( 核蛋白内参 为 Lamin B), 按 1mL/cm 2 加入化学发光试剂, 采 用凝胶成像分析系统检测各蛋白条带 2.7 统计学方法 采用 SPSS18.0 统计软件,2 组比较采用 t 检 验, 多组比较采用单因素方差分析 (One wayano- VA), 计量结果以 x±s 表示 P<05 为差异有统 计学意义 3 结果 1 电镜观察 A. 年龄对照组 ;B. 溶媒对照组 ;C. 阳性药物组 ; D. 补肾益气活血方低剂量组 ;E. 中剂量组 ;F. 高剂量组图 1 各组实验动物电镜观察结果 ( 11000) 2 SOD GSH Px CAT 活性各组实验动物血清及视网膜组织 SOD GSH Px CAT 活性检测结果见表 2 由表 2 可见, 血清 SOD GSH Px CAT 活性明显高于视网膜组织 ; 与年龄对照组比, 溶媒对照组动物血清及视网膜组织上述 3 种酶活性显著降低 (01); 与溶媒对照组比, 阳性药物组对 3 种酶活性没有影响, 补肾益气活血方高 中 低 3 个剂量组中, 低剂量补肾益气活血方提高血清及视网膜组织 GSH Px 血清 CAT 酶活性 (P<05), 中剂量补肾益气活血方能提高血清 3 种酶 (P<05~01) 及视网膜组织 GSH Px 酶活性 (P<01), 高剂量补肾益气活血方则能提高血清及视网膜组织 3 种酶活性 (P<05~01), 且对 SOD 酶活性提高作用优于中 低剂量 ( 05) 3 ROS MDA 含量血清及视网膜组织 ROS MDA 含量测定结果见表 3 由表 3 可见, 血清 ROS MDA 含量明显高于视网膜组织 ; 与年龄对照组比, 溶媒对照组动物血清及视网膜组织 ROS MDA 含量显著升高 ( 01); 与溶媒对照组比, 阳性药物 补肾益气活血方均

4 可降低血清及视网 膜 组 织 ROS MDA 含 量 ( 05~ 01),在高 中 低剂量补肾益气活血方 3 个观 165 第2期 谢婧,等:补肾益气活血方对干性年龄相关性黄斑变性模型小鼠视网膜氧化损伤的保护作用 察组中,高 剂 量 组 作 用 优 于 中 低 剂 量 组 ( 05) 表 1 小鼠 RPE 下沉积物评分及 Br uch ±s, 膜厚度比较( x n=5) 组别 RPE 下沉积物评分 Br uch 膜厚度/μm 4. 29± 03 68± 09 18± 44# 56± 07 86± 45 年龄对照组 溶媒对照组 35± 06 59± 08 24± 47# 阳性药物组 中药低剂量组 06± 39 48± 07# # 中药中剂量组 2. 91± 38 45± 06# # 中药高剂量组 注:与年龄对照组比较, 01,与溶媒对照组比较, ±s, 表 2 小鼠血清及视网膜组织 SOD GSH Px CAT 活性比较( x n=5) 组别 血清/( U ml-1 ) SOD 年龄对照组 GSH Px ± ± ± ±1 37 CAT 1 38± ± 57# # 7 35±9. 14# # 52± 39# # 溶媒对照组 阳性药物组 中药低剂量组 4. 69± ± ± GSH Px 2 81± ± 69 CAT 47± ± 89# # 06± 31# # 18± 06# # 1 14± ± 35 73± ± ± ± ± ± 72 中药高剂量组 5 62± ± ± 75 中药中剂量组 SOD 组织/( U mg-1 ) 24± ± ± 57 26± ± ± 58 85± ± 16 注:与年龄对照组比较,## 01;与溶媒对照组比较, 05, 01;与低剂量组比较, ±s, 表 3 小鼠血清及视网膜组织 ROS MDA 含量比较( x n=5) 组别 年龄对照组 溶媒对照组 阳性药物组 中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组 血清 ROS( FI) MDA/( nmo l ml-1 ) ± ±2. 5 ROS( FI) 组织 72 3±3 7 MDA/( nmo l ml-1 ) 5. 5± ±176. 2# # 39. 6±5. 1# # 139 5±5 2# # 25. 9±2. 9# # ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 5 注:与年龄对照组比较,## 05;与溶媒对照组比较, 05, 01;与低剂量组比较, 4 qpcr 各 组 实 验 动 物 Nr HO GCL mrna 转录水平 胞浆 Nr 2 表达水 平 无 显 著 差 异;与 溶 媒 对 照 组 比, 物 Nr HO GCL 转录水 平 升 高( 上调( 01),高 剂 量 组 显 著 高 于 低 剂 量 组 ( P< 05),阳 性 药 物 及 补 肾 益 气 活 血 方 低 剂 量 组 胞 浆 结果见图 2 与 年 龄 对 照 组 比,溶 媒 对 照 组 动 05);与溶媒对照组比,阳性药物 低剂量补肾益气活 血方组 Nr HO GCL 转录水平 没 有 统 计学差异,补肾益气 活 血 方 高 剂 量 组 转 录 水 平 则 明 显高于溶媒对照组(HO 1: 01, Nr GCL: 05),中剂量组 HO 1转录水平 阳性药物组胞核 胞浆 Nr 2 表达水平没有显著性差 异,补肾益气活血方 3 个剂量组胞核 Nr 2 表达水平 Nr 2 表达水平 无 明 显 差 异,补 肾 益 气 活 血 方 中 高 剂量组表达上调( 05) 升高 5 We s t e rnb l o t法分析各组实验动物胞 核 胞 浆 Nr 2 表达水平 结果见图 3 由图 3 可 知,与 年 龄 对 照 组 比,溶 媒对照组动物胞核 Nr 2 表达水平升高( 05), 图 2 各组动物 Nr HO NQO GCL mrna 转录水平比较

5 166 南京中医药大学学报 2018 年 3 月第 34 卷第 2 期 素 维生素 C 和维生素 E 锌和铜等对 AMD 进展及 视敏度的影响,证实 应 用 抗 氧 化 剂 可 以 在 5 年 内 使 晚期 AMD 进展的风 险 降 低 25%,中 度 视 力 下 降 的 风险降低 19% [4] 乐盯的主 要 成 分 是 叶 黄 素,具 有 很强的抗氧化作用,我 们 的 研 究 发 现 枸 杞 提 取 物 及 其成分叶黄素和玉米黄素对氧化损伤模型小鼠视网 [] 膜及 ARPE 19 细胞有保护作用 5 此外,乐盯中的 维生素 C 维生素 E 和锌离子也有抗氧化作用 中医认为本 病 属 视 瞻 昏 渺,发 病 与 肝 脾 肾 的 功能失调有关 目为肝之窍,肝受血而能视,五脏六 腑之精气皆上濡 于 目;肾 为 先 天 之 本,肾 藏 精,受 五 注:与年龄对照组比较,## 01;与溶媒对照组比较, 05, 01;与低剂量组比较, 图 3 各组动物胞核 胞浆 Nr 2 蛋白表达比较 各组实验 动 物 HO GCL 表 达 水 平 检测及分析 结 果 见 图 4 由 图 4 可 知,与 年 龄 对 照 组比,溶 媒 对 照 组 动 物 HO GCL 表 达 水 平 上 调 ( 05) 表 达 水 平 差 异 不 明 显;与 溶 媒 对 照 组 脏六腑之精而藏之,肾精充足,方能目视精明 肝肾 阴精不足 脾气亏虚则目失所养,视物不清 肝肾阴 虚,虚火 上 炎,炼 液 为 瘀;脾 气 虚,推 动 无 力,血 行 迟 涩而为瘀;津血不足,脉络空虚,血行停滞亦可致瘀 瘀血留滞于脉络,导致脉络瘀滞,使精血不能上行于 目,目失所养而视 物 不 明 因 此, AMD 为 本 虚 标 实 之证,脾 气 虚 弱 肝 肾 精 血 不 足 是 本,痰 湿 血 瘀 是 比,阳性药物组 HO GCL 表达水平 没 有 标,前者始终 贯 穿 于 疾 病 的 全 过 程 基 于 AMD 的 病机,不少医家采 用 滋 补 肝 肾 益 气 健 脾 活 血 化 瘀 上调( 05),而 低 剂 量 组 仅 在 1 表 达 上 调 法治疗肝肾亏损 气 血 亏 虚 型 干 性 AMD[6],关 红 丹 显著性差异,补肾益气活血方高 中剂量组表达水平 法治疗干性 AMD,如 陆 萍 等 用 柔 肝 健 脾 滋 阴 明 目 用滋补肝肾 健脾祛 湿 法 治 疗 AMD[7],均 取 得 一 定 效果 临床上,我们以滋补肝肾 益气健脾经验方治 疗干性 AMD,发 现 能 减 缓 早 中 期 干 性 AMD 的 进 展,疗效优于乐盯 本研究采用 的 是 优 化 后 的 组 方 其 中 枸 杞 子 桑椹子滋阴明目;菟 丝 子 山 萸 肉 为 平 补 阴 阳 要 药, 用其有阳中求阴 之 意;田 七 川 芎 生 山 楂 具 有 祛 瘀 生新 活 血 明 目 功 能;葛 根 理 气 活 血;太 子 参 黄 芪 白术 茯苓益气健 脾;槐 花 有 清 热 作 用,其 主 要 成 分 槲皮素有很强 抗 氧 化 作 用,能 显 著 减 轻 H2O2 诱 导 [] 的 ARPE 19 细胞氧化损伤 8 本研究观察到,乐盯 及补肾益气活 血 方 高 中 低 3 个 剂 量 均 可 使 RPE 下 沉 积 物 减 少,中 高 剂 量 的 补 肾 益 气 活 血 方 对 注:与年龄对照组比较,# 05,与溶媒对照组比较, 图 4 各组动物 HO GCL 蛋白表达比较 4 讨论 大量研 究 表 明,氧 化 损 伤 是 AMD 最 为 重 要 的 发病 机 制,抗 氧 化 损 伤 是 AMD 防 治 的 有 效 途 径 如 AREDS (Age Re l a t ed Eye Di s e a s es t udy, AREDS)在 2001 年 开 展 的 首 个 多 中 心 随 机 前 瞻 性 研究,评 估 了 药 理 剂 量 的 抗 氧 化 剂,包 括 β 胡 萝 卜 Bruch 膜厚度增 厚 有 抑 制 作 用,显 示 乐 盯 及 补 肾 益 气活血方 对 干 性 AMD 模 型 动 物 视 网 膜 有 保 护 作 用,中 高剂量的补 肾 益 气 活 血 方 优 于 乐 盯;乐 盯 对 SOD GSH Px CAT3 种 重 要 的 抗 氧 化 酶 活 性 没 有 影响,高剂量补肾益 气 活 血 方 则 能 提 高 动 物 血 清 及 视网膜组织 3 种酶的活性,对 SOD 酶活性提高作用 优于中 低剂量;乐 盯 补 肾 益 气 活 血 方 均 可 降 低 动 物血清及视网膜组织 ROS MDA 含量,补肾益气活

6 谢婧, 等 : 补肾益气活血方对干性年龄相关性黄斑变性模型小鼠视网膜氧化损伤的保护作用 第 2 期 167 血方高剂量作用优于中 低剂量 这些研究结果提示, 乐盯对模型动物视网膜的保护作用可能与其成分中的抗氧化剂直接中和活性氧有关, 而补肾益气活血方的作用与提高抗氧化酶的活性有关 研究表明,Nr2 通路与 AMD 发病关系密切 为此, 本研究观察了乐盯 补肾益气活血方对 Nr2 通路及其下游靶基因酶 HO 1 NQO 1 GCL 表达水平的影响, 发现乐盯对 Nr2 HO 1 NQO 1 GCL 转录水平没有影响, 补肾益气活血方中 高剂量组则转录水平明显升高 ; 乐盯对胞核 胞浆 Nr2 蛋白表达水平没有影响, 补肾益气活血方能显著上调胞核 Nr2 蛋白表达水平, 对胞浆 Nr2 蛋白表达水平也有一定影响 ; 乐盯对 HO 1 NQO 1 GCL 表达水平没有影响, 而补肾益气活血方高 中剂量可显著上调 HO 1 NQO 1 GCL 表达水平 这些结果提示, 补肾益气活血方可能通过激活 Nr2 通路, 提高 SOD GSH Px CAT 酶活性, 上调下游靶基因酶 HO 1 NQO 1 GCL 表达水平, 从而增强对活性氧的清除作用, 对氧化损伤模型小鼠视网膜起到保护作用 总之, 优化后的补肾益气活血方可能通过激活 Nr2 通路, 提高 SOD GSH Px CAT 酶活性, 上调下游靶基因酶 HO 1 NQO 1 GCL 表达水平, 增强对模型动物体内活性氧的清除, 对视网膜氧化损伤起到保护作用 本研究通过干性 AMD 模型动物证实了补肾益气活血方的有效性, 并初步探明了作用机制, 为下一步开展临床研究提供了依据 参考文献 : [1]ZHAOZ,CHENY,WANGJ,etal.Age relatedretinopathyin NRF2 deicientmice[j].plosone,2011,6(4):e [2]XU XR,LIM,CHEN WW,etal.Apigeninatenuatesoxidativeinjuryin ARPE 19celsthoroughactivationoNr2pathway[J].Oxid MedCelLongev,2016: [3] 黄冰林, 杭丽, 郑仕中, 等. 枸杞提取物对高脂饮食及氢醌诱发的小鼠视网膜色素上皮下沉积物形成的抑制作用 [J]. 南京中医药大学学报,2013,29(1): [4]Age RelatedEyeDiseaseStudyResearchGroup.Arandomized, placebo controled,clinicaltrialohighdosesupplememation withvitaminscande,betacarotene,andzincorage related maculardegenerationandvisionloss.aredsreportno.8[j]. ArchOphthalmol,2001,119: [5]XU XR,HANGL,HUANGBL,etal.Eicacyoethanolextractoructuslycianditsconstituentslutein/zeaxanthinin protectingretinal pigment epithelium cels against oxidative stress:invivoandinvitromodelsoage relatedmaculardegeneration[j].jophthalmol,2013: [6] 陆萍, 邹菊生, 阮雯洁, 等. 柔肝健脾 滋阴明目法治疗萎缩性老年性黄斑变性的随机对照临床研究 [J]. 上海中医药杂志,2012, 46(6):71 7 [7] 关红丹. 黄斑宁汤治疗年龄相关性黄斑变性的临床观察 [J]. 河北中医,2008,30(5): [8]XU XR,YU HT,YANGY,etal.Quercetinphospholipidcomplexsigniicantlyprotectsagainstoxidativeinjuryin ARPE 19 celsassociatedwithactivationonr2pathway[j].eurjpharmacol,2016,770:1 8. ( 编辑 : 董宇 )

1600 1000 40 50 2030 2000 采 取 行 动 的 机 会 90% 开 拓 成 功 的 道 路 2

1600 1000 40 50 2030 2000 采 取 行 动 的 机 会 90% 开 拓 成 功 的 道 路 2 简 略 版 本 :2015 3 10 2016 2021 全 球 卫 生 部 门 病 毒 性 肝 炎 战 略 2016 2021 2015 3 12 2012 2010 2014 2015 2016 2021 140 55% 35% 5 15% 5 20% 2.4 1.3 1.5 1 1600 1000 40 50 2030 2000 采 取 行 动 的 机 会 90% 开 拓 成 功 的 道 路

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