120 中国油料作物学报 2015,37(1) 前, 黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法 高效液相色谱法 酶联免疫吸附测定法 质谱法等 基于仪器分析的检测方法对仪器要求较高, 费时费力, 不能满足我国粮油中黄曲霉毒素现场 快速检测的需求 ; 基于免疫分析的快速检测技术具有污染小 耗时短 灵敏度高

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1 中国油料作物学报 ChineseJournalofOilCropSciences 2015,37(1): doi: /j.issn 量子点探针应用于粮油中黄曲霉毒素免疫检测的研究 许琳 1,2,3, 张兆威 1,2,3,4, 李培武 1,2,3,4,5, 张奇 1,2,3,4 1,3,4,5, 张文 (1. 中国农业科学院油料作物研究所, 湖北武汉,430062;2. 农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室, 湖北武汉,430062; 3. 农业部生物毒素检测重点实验室, 湖北武汉,430062;4. 农业部油料产品质量安全风险评估实验室, 湖北武汉,430062; 5. 农业部油料及制品质量监督检验测试中心, 湖北武汉,430062) 摘要 : 为改良检测技术, 拓宽量子点探针在农产品安全领域的应用范围, 制备了用于粮油中黄曲霉毒素检测的 2 种量子点探针, 即碳量子点 (CQD) 探针和石墨烯量子点 (GQD) 荧光免疫探针, 研究 2 种探针应用于黄曲霉毒素检测中的可行性 采用绿色合成方法, 发现以 0.375g/mL 柠檬酸水溶液中获得的石墨烯量子点荧光强度最强 利用 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC HCL) 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS), 将碳量子点和 GQD 与抗黄曲霉毒素的单克隆抗体 1C11 进行共价偶联, 发现偶联前后量子点的荧光光谱变化趋势一致, 而且偶联后均保持了较好的荧光特性, 因此均可作为黄曲霉毒素免疫检测的探针, 且与抗体偶联后的碳量子点的荧光特性优于石墨烯量子点 关键词 : 碳量子点 ; 石墨烯量子点 ; 荧光免疫探针 ; 黄曲霉毒素中图分类号 :S379.7 文献标识码 :A 文章编号 : (2015) Quantum dotslabelinimmunoasaydetectionofaflatoxinsincerealsandoils XULin 1,2,3,ZHANGZhao-wei 1,2,3,4,LIPei-wu 1,2,3,4,5,ZHANGQi 1,2,3,4,ZHANGWen 1,3,4,5 (1.OilCropsResearchInstituteoftheChineseAcademyofAgriculturalSciences,Wuhan430062,China; 2.KeyLaboratoryofBiologyandGeneticImprovementofOilCrops,MinistryofAgriculture,Wuhan430062,China; 3.KeyLaboratoryofDetectionforMycotoxins,MinistryofAgriculture,Wuhan430062,China; 4.LaboratoryofRiskAsesmentforOilsedsProducts,MinistryofAgriculture,Wuhan430062,China; 5.QualityInspectionandTestCenterforOilsedsProducts,MinistryofAgriculture,Wuhan430062,China) Abstract:Todevelopquantum dotapplicationonfoodsafetydetection,cqds(carbonquantum dots)and GQDs(graphenequantum dots)wereevaluatedasthefluorescencelabelsinaflatoxinsdetectionincerealsand oils.usingenvironmentfriendlymethod,gqdsweresynthesizeddirectlyincitricacidsolution,andshowedthe strongestfluorescenceintensityunder0.375g/mlcitricacid.thenthegqdsandcqdswerecovalentcoupledwith monoclonalantibody1c11by1-ethyl-3-(3-dimethylaminoproyl)carbodimidehydrochloride(edc)andn -hydroxyl-sulfosuccinimidesodiumsalt(nhs).resultsshowedthatbothquantumdotshadstrongfluorescence intensities,whichcouldbeservedasfluorescencelabelsinaflatoxinimmunoasay.cqdsfluorescencepropertywas strongerthanthatofgqdsaftercoupledwithantibody. Keywords:Carbonquantumdots;Graphenequantumdots;Immune-fluorescencelabel;Aflatoxin 黄曲霉毒素 (aflatoxin,aft) 是由黄曲霉和寄生曲霉等产生的一组强毒性的次生代谢产物, 是粮食中常见的真菌毒素, 广泛存在于花生 大米 植物 油等粮油产品中 [1,2] 黄曲霉毒素具有致癌 致畸 致突变和免疫抑制毒性, 污染重, 危害大, 管控难, 造成了巨大的经济损失, 为全球所普遍关注 [3] 目 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 国家科技支撑计划 (2012BAB19B09); 公益性行业 ( 农业 ) 科研专项 ( ) 作者简介 : 许琳 (1989-), 女, 山东莱芜人, 硕士研究生, 研究方向为农产品质量与食物安全, xulinlin2008@126.com 通讯作者 : 李培武 (1961-), 男, 二级研究员, 博士生导师, 主要从事农产品质量安全标准与检测技术研究, peiwuli@oilcrops.cn 张兆威 (1979-), 男, 副研究员, 硕士生导师, 主要从事农产品质量安全检测技术研究, zhangzhaowei@caas.cn

2 120 中国油料作物学报 2015,37(1) 前, 黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法 高效液相色谱法 酶联免疫吸附测定法 质谱法等 基于仪器分析的检测方法对仪器要求较高, 费时费力, 不能满足我国粮油中黄曲霉毒素现场 快速检测的需求 ; 基于免疫分析的快速检测技术具有污染小 耗时短 灵敏度高 操作简单等特点, 但常用的 ELISA 检测方法中显色所需的酶, 其活性易受反应条件影响, 显色液亦需要低温保存 [4~6] 量子点又名半导体纳米晶体, 具有良好的化学惰性 优良的荧光性能 良好的生物相容性 低毒和易于合成等特点 [7] 与传统有机染料相比, 量子点具有发射光谱窄 激发光谱宽 荧光特性可以通过控制粒径进行调节等光学特性 [8], 被广泛应用于重金属检测 生物成像等研究领域 如 Dong [9] 和 Zhang [10] 等用功能化的碳量子点进行了铜和汞的检 [11] 测 ;Ananthanarayanan 等实现了石墨烯量子点对 [12] 铁的检测 ; 邓小燕等研究了叶酸的碳量子点检测 [13] 技术 ;Zheng 等将石墨烯量子点作为标记材料来揭示脂肪细胞中胰岛素受体的作用机理 ; 白建梅 [14] 等将石墨烯量子点应用于光致发光等传感器中 在前期对抗黄曲霉毒素高灵敏度高特异性单克隆抗体的研究基础上, 本文利用合成的量子点 ( 石墨烯量子点和碳量子点 ) 对黄曲霉毒素单克隆抗体进行标记, 从而构建黄曲霉毒素荧光免疫探针 对 2 种量子点的光学特性进行表征并做相应的比较 通过对偶联物特性的表征, 证明量子点在黄曲霉毒素免疫检测中作为探针的可行性 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 一水合柠檬酸 十二水合磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 氢氧化钠 盐酸 氯化钠和氯化钾,N-N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 均购自上海国药化学试剂有限公司 ; 聚乙二醇 20000(PEG20000) 购于天津市科密欧化学试剂开发中心 ;1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC HCL) N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 购自 Sigma 公司 ; 生物透析袋购自 Thermo 公司 ; 碳量子点由西南大学洁净能源与先进材料研究院提供 ; 抗黄曲霉毒素 B 1 的单克隆抗体 1C11( 以下简称为单抗 ) 为本实验室自制 ; 超纯水由 Mili-Q 超纯水机生产 0.01mol/L 的 PBS 溶液的配制 :24g 氯化钠,8.7 g 十二水合磷酸氢二钠,0.6g 氯化钾和 0.6g 磷酸二氢钾溶于 3L 超纯水中 1.2 主要仪器 UV500 紫外分光光度计 ( 美国 Unicam 公司 ); HitachiF-4500 荧光分光光度计, 高速冷冻离心机 ( 日本 Hitachi 公司 ); 超滤离心管,Mili-Q 超纯水机 ( 美国 Milipore 公司 );HQ-60 型旋涡混合器 ( 北方同正生物技术发展公司 );BCD-198 冰箱 ( 德国西门子公司 ); 定温恒温干燥箱,ZNCL-7 磁力搅拌电热套 ( 上海爱朗仪器有限公司 ); 聚四氟乙烯反应釜 ( 西安常仪仪器设备有限公司 ) 1.3 石墨烯量子点的合成参考文献 [10,15] 报道的方法合成石墨烯量子点 GQD, 并对石墨烯量子点合成原料 ( 柠檬酸 ) 的浓度进行优化 将不同质量的柠檬酸溶于超纯水中, 充分溶解后, 获得一系列不同浓度的柠檬酸水溶液 ( g/mL) 取相同体积的柠檬酸水溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中, 于定温恒温干燥箱中 200 下加热 3h 后取出自然冷却 将反应液置于生物透析袋中用 0.01mol/L 的 PBS 透析 3d 进行纯化处理, 每天更换透析液 3 次, 然后用超滤管进行超滤纯化, 纯化后的石墨烯量子点溶液用 PEG20000 做进一步的浓缩处理, 获得的石墨烯量子点溶液置于 4 避光储藏备用 1.4 碳量子点和石墨烯量子点与单克隆抗体的偶联石墨烯量子点的偶联 : 取上述浓度的石墨烯量子点处理液 1mL, 用氢氧化钠和盐酸调节 ph 至 7.4 左右, 加入用 DMF 溶解的 EDC(2.1mg/mL)2mL 与量子点边缘的羧基反应形成中间体 [12], 再加入 NHS (3mg/mL)840μL, 在室温下磁力缓和搅拌反应 30min, 然后加入 1mg/mL 抗黄曲霉毒素 B 1 的单克隆抗体 1C11 溶液 1mL,30 下磁力缓和搅拌避光反应 3h, 反应结束后, 置于 4 静置过夜 再用 0.01 mol/l 的 PBS 透析,4 至 6h 更换一次透析液, 除去未反应的小分子物质,4 避光储存备用 碳量子点的偶联方法同上 2 结果与分析 2.1 量子点的表征分析首先合成并探究了不同柠檬酸浓度合成的一系列石墨烯量子点的荧光光谱 ( 图 1) 由图可知, 随着柠檬酸浓度的改变, 合成的量子点的发射波长出现红移现象, 发射波长由 412nm 变化到 438nm 由图可知, 当柠檬酸浓度为 0.375g/mL 时, 获得的石墨烯量子点的荧光强度最强, 所以选择该浓度的柠檬酸进行石墨烯量子点的合成 与已报道的以氧化

3 许 琳等 : 量子点探针应用于粮油中黄曲霉毒素免疫检测的研究 121 [16] 石墨烯为原料的合成方法相比, 本文采用一步法合成的水溶性石墨烯量子点, 原料价格低廉, 合成步骤简单, 减少了高温处理步骤和有机溶剂的使用 图 1 不同柠檬酸浓度合成的石墨烯量子点的荧光光谱 ( 激发波长为 330nm) Fig.1 FL(fluorescencelabel)spectra (excitationwavelength330nm)of GQDsatdiferentconcentrationsofcitricacid 继而考察了碳量子点和石墨烯量子点 2 种量子点的紫外吸收光谱和在不同激发波长下的荧光光谱 由图 2 可知, 石墨烯量子点最大吸收波长在 330nm 左右, 碳量子点最大吸收波长在 340nm 左右 与碳量子点相比, 石墨烯量子点具有更强的荧光强度 由图 3 可知, 激发波长由 330nm 到 370nm 的变化范围中, 石墨烯量子点的荧光强度逐渐减小, 荧光光谱图较为分散, 发射波长为 419nm, 此时激发波长为 330nm 碳量子点的荧光光谱图较为集中, 发射波长为 423nm, 此时激发波长为 340nm, 与石墨烯量子点相比, 碳量子点的半峰宽更窄 2 种量子点获得最大发射峰的激发波长存在一定差异, 但差异不大 同时, 在发射最高峰下, 石墨烯量子点的荧光强度大于碳量子点 图 2 偶联所用石墨烯量子点 (a b) 和碳量子点 (c d) 的吸收光谱 (a c) 和荧光光谱 (b d) Fig.2 UV-VISabsorption(a,c)andcorrespondingFLspectra(b,d)ofGQDs(a,b)andCQDs(c,d) 图 3 不同激发波长下石墨烯量子点 (a) 和碳量子点的荧光光谱 (b) Fig.3 CorrespondingFLspectraofGQDs(a)andCQDsatexcitationwavelength(b) 另外,2 种量子点的发射光谱均较窄, 说明所得 2 种量子点的粒径分布都比较均匀 2.2 量子点 - 单克隆抗体的表征分析合成的碳量子点和石墨烯量子点与单克隆抗体 1C11 通过 EDC 和 NHS 以共价连接的方式偶联, 偶 联过程中确保量子点过量, 使单克隆抗体偶联上尽可能多的量子点 对偶联后的石墨烯量子点和碳量子点在不同激发波长下的荧光强度做了比较, 同时对偶联前后稀释相同倍数的量子点和量子点 - 抗体偶联物进行荧光光谱的比较

4 122 中国油料作物学报 2015,37(1) 图 4 不同激发波长下石墨烯量子点抗体偶联物 (a) 和碳量子点抗体偶联物 (b) 的荧光光谱 Fig.4 CorrespondingFLspectraofGQDs-AbandCQDs-Abatexcitationwavelength 由图 4 可知, 偶联后量子点的荧光光谱的变化趋势与偶联前一致 说明 2 种量子点均保持了较好的荧光特性 偶联前后量子点的发射波长 ( 石墨烯量子点的激发波长为 330nm, 碳量子点的激发波长为 340nm 时, 此时荧光强度最强 ) 基本没有变化 ( 图 5), 说明石墨烯量子点 - 单抗偶联物和碳量子点 - 单抗偶联 物保持了原有水溶性量子点的荧光发射特性 但偶联后偶联物的荧光强度明显降低, 说明偶联或纯化使量子点的荧光强度发生了改变, 有所损失 同时可以看出, 石墨烯量子点荧光强度的减少量和减小幅度比碳量子点都要大 利用两种量子点免疫探针的荧光特性, 可实现黄曲霉毒素的免疫检测 [17] 注 /Note:a:GQDs;b:GQDs-monoclonalantibody;c:CQDs;d:CQDs-monoclonalantibody 图 5 石墨烯量子点和碳量子点偶联前后的荧光光谱 Fig.5 FLspectraoftheoriginalGQDs/CQDsandGQDs/CQDsconjugatedtomonoclonalantibody 3 讨论 近年来, 国内食品安全事件层出不穷, 引起全社会越来越多的关注, 黄曲霉毒素由于其高毒性也成为重点关注之一 量子点作为一类新型荧光标记材料, 被广泛应用 本文利用合成的水溶性石墨烯量子点和碳量子点与抗黄曲霉毒素的单克隆抗体进行偶联, 证明了量子点探针在黄曲霉毒素免疫检测中应用的可行性 同时, 对 2 种量子点及其偶联物的光学特性做了比较, 可知碳量子点具有更强的荧光强度和更好的稳定性 拟将此探针应用于黄曲霉毒素免疫试纸条的制作, 进而应用于黄曲霉毒素的免疫检测 碳量子点的荧光特性可能与其电子排布特征以及杂化和激发跃迁相关 [18] 除此之外, 我们还可以将量子点表面大量的结合位点, 用于毒素检测中的信号放大 [19], 从而提高检测的灵敏度 或者, 利用量子点与其它纳米材料之间的相互调节作用来 进行信号的传导, 实现毒素的免疫检测 [20] 综上, 量子点在毒素检测中具有广泛的应用前景 参考文献 : [1] AycicekH,AksoyA,SaygiS.Determinationofaflatoxin levelsinsomedairyandfoodproductswhichconsumedin Ankara,Turkey[J].FoodControl,2005,16: [2] EhrlichKC,KobbemanK,MontalbanoBG,etal.Af latoxin-producingaspergilusspeciesfrom Thailand [J].IntJFoodMicrobio,2007,114: [3] 林海, 张丽丽, 孟庆玉, 等. 食品中黄曲霉毒素的检测方法 [J]. 农产品加工 ( 学刊 ),2013(6): [4] TurnerNW,SubrahmanyamS,PiletskySA.Analytical methodsfordeterminationofmycotoxins[j].analytica ChimicaActa,2009,632: [5] LiP,ZhangQ,ZhangW.Immunoasaysforaflatoxins [J].TrAC,2009,28(9): [6] 周茜, 张文, 张奇, 等. 黄曲霉毒素 G 族人工抗

5 许 琳等 : 量子点探针应用于粮油中黄曲霉毒素免疫检测的研究 123 原的合成与免疫效果研究 [J]. 化学试剂,2010,32 (10): [7] ShenJH,ZhuYH,YangXL,etal.Graphenequan tum dots:emergentnanolightsforbioimaging,sensors, catalysisandphotovoltaicdevices[j].chemicalcommu nications,2012,48: [8] Pérez-LópezB,Merko ia.nanoparticlesforthedevel opmentofimproved(bio)sensingsystems[j].analbio analchem,2011,399: [9] DongYQ,WangRX,LiGL,etal.Polyamine-Func tionalizedcarbonquantum dotsasfluorescentprobesfor selectiveandsensitivedetectionofcopperions[j].ana lyticalchemistry,2012,84(14): [10] ZhangRZ,ChenW.Nitrogen-dopedcarbonquantum dots:facilesynthesisandapplicationasa"turn-of" fluorescentprobefordetectionofhg 2+ ions[j].biosen sorsandbioelectronics,2014,55: [11] AnanthanarayananA,WangXW,RouthP,etal.Fac ilesynthesisofgraphenequantumdotsfrom3dgraphene andtheirapplicationforfe 3+ sensing[j].advanced FunctionalMaterials,2014,24(20): [12] 邓小燕, 李佳渝, 谭克俊. 基于碳量子点荧光分光光度法检测叶酸 [J]. 分析化学,2014,42(4): [13] ZhengXT,ThanA,AnanthanarayaA,etal.Graphene quantumdotsasuniversalfluorophoresandtheirusein revealingregulatedtrafickingofinsulinreceptorsinadi pocytes[j].acsnano,2013,7(7): [14] 白建梅. 石墨烯量子点的制备及其在光致发光传感中的应用 [D]. 南昌 : 南昌大学,2013. [15] DongYQ,ShaoJW,ChenCQ,etal.Bluelumines centgraphenequantum dotsandgrapheneoxidepre paredbytuningthecarbonizationdegreeofcitricacid [J].Carbon,2012,50(12): [16] HabibRazmi,RahimMohammad-Rezaei.Graphene quantumdotsasanewsubstrateforimmobilizationand directelectrochemistryofglucoseoxidase:applicationto sensitiveglucosedetermination[j].biosensorsandbio electronics,2013,41: [17] 李园园, 李培武, 张奇, 等. 量子点标记荧光免疫法检测花生中黄曲霉毒素 B 1 [J]. 中国油料作物学报, 2012,34(4): [18] 周瑞琪, 吕华, 陈佳慧, 等. 碳量子点的合成 表征及应用 [J]. 药学进展,2013,37(1): [19] WangX,ChenLJ,SuXR,etal.Electrochemicalim munosensorwithgraphenequantum dotsandapoferitin -encapsulatedcunanoparticlesdouble-asistedsig nalamplificationfordetectionofavianlleukosisvirus subgroupj[j].biosensorsandbioelectronics,2013,47: [20] ZhaoHM,ChangYY,LiuM,etal.Auniversalim munosensingstrategybasedonregulationoftheinterac tionbetweengrapheneandgraphenequantum dots[j]. ChemicalCommunications,2013,49: ( 责任编辑 : 肖唐华 )

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