424 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷 groupwithinthreemonthsaftertransplantation.conclusion:peripherallymphocytesdistributionof AMLpatientsafteralo HSCTwasaltered

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1 第 27 卷第 5 期 2017 年 9 月 江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.27 No.5 Sept.2017 巨细胞病毒感染对异体造血干细胞移植急性髓系白血病患者外周血 CD8 + /CD4 + T 细胞分布的影响 张洁心, 吴蕾, 戎国栋, 徐婷, 赵鸿, 王芳, 黄 臖 ( 南京医科大学第一附属医院检验学部, 江苏南京 ) [ 摘要 ] 目的 : 分析接受异体造血干细胞移植的急性髓系白血病 (AML) 患者外周血淋巴细胞亚群分布与巨细胞病毒 (CMV) 血症的关系 方法 : 选取接受异体造血干细胞移植的 AML 患者 65 例 根据移植后 CMV 感染状态分为 CMV 阳性组 (n=38) 和 CMV 阴性组 (n=27), 分别采集不同时间点外周血标本检测淋巴细胞亚群比例和巨细胞病毒载量 采用 Kaplan Meier 法 Fisher 精确检验和 Cox 风险回归模型分析 CMV 感染与 AML 患者预后之间的联系 结果 : 移植后 CMV 阳性组 CD8 + /CD4 + T 细胞比值倒置 ; 给予 2 个月更昔洛韦治疗,6 个月内 CMV 拷贝数全部转阴 ;CD8 + /CD4 + T 细胞比值虽回落, 但其值仍高于移植前 移植后 3 个月内 2 组 CD8 + T 细胞比例均发生上调, 但 CMV 阳性组明显高于阴性组 (P<0.05 或 P<0.01) 结论: 异体造血干细胞移植的 AML 患者 CMV 感染后, CD8 + /CD4 + T 细胞比值倒置, 且术后 3 个月内以 CD8 + T 细胞上调为主,CMV 感染有利于 AML 患者移植后无白血病复发存活 [ 关键词 ] 急性髓系白血病 ; 异体造血干细胞移植 ; 巨细胞病毒血症 ; 外周血淋巴细胞 ; 无白血病复发存活 [ 中图分类号 ] R [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2017) DOI: /j.isn y [ 引用格式 ] 张洁心, 吴蕾, 戎国栋, 等. 巨细胞病毒感染对异体造血干细胞移植急性髓系白血病患者外周血 CD8 + /CD4 + T 细胞分布的影响 [J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ),2017,27(5): CMVinfectioninfluencesonperipheralimmunestatusof acutemyeloidleukemiapatientsafteralogeneic hematopoieticstem celtransplantation ZHANGJie xin,wulei,rongguo dong,xuting,zhaohong,wangfang,huangpei jun (DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAfiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,NanjingJiangsu210029,China) [Abstract] Objective:Toanalyzethedistributionofperipherallymphocytesubsetsofacutemyeloid leukemia(aml)patients,whowentthroughalogeneichematopoieticstem celtransplantation(alo HSCT),andtoinvestigatetherelationshipamongcytomegalovirus(CMV)viremia,immunestatusand prognosis.methods:werecruited65amlpatientswhohadreceivedalo HSCT.AccordingtoCMV infectionstatusaftertransplantation,theyweredividedintocmv(+)(n=38)andcmv(-)(n= 27)groups.Werespectivelycolectedtheirperipheralbloodsamplesindiferenttime pointstoanalyse theratiosoflymphocytesubgroupsandvirusloads.kaplan Meiermethod,Fisher sexacttest,andthe CoxproportionalhazardsregresionmodelwereusedforstatisticalanalysisbetweenCMVinfectionand prognosis.results:immediatelyaftertransplantation,cmv(+)groupshowedinvertedcd8 + /CD4 + Tcelsratio.CMVnegativelyturnedinperipheralbloodwithinsixmonthsbygancicloviradministration fortwomonths.althoughcd8 + /CD4 + Tcelsratiofelback,itwasstilhigherthanthatbeforetrans plantation.cd8 + TcelsweregeneralyupregulatedinbothgroupsbutmoreprominentinCMV(+) [ 基金项目 ] 江苏省自然科学基金资助项目 (BK ) [ 作者简介 ] 张洁心 (1985 ), 女, 江苏南京人, 助理研究员, 主要从事感染与肿瘤研究 ; 赵鸿 ( 通讯作者 ), 主管技师,zhaohong_jsph@ 163.com

2 424 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷 groupwithinthreemonthsaftertransplantation.conclusion:peripherallymphocytesdistributionof AMLpatientsafteralo HSCTwasalteredbyCMVinfection,leadingtoinvertedCD8 + /CD4 + Tcels ratio.cd8 + Tcelwasupregulatedwithinthreemonthspost surgery.thesecmvinfectionandresul tedinimmuneactivationmightfavorleukemiafreesurvival. [Keywords] acutemyeloidleukemia;alogeneichematopoieticstemceltransplantation;cytomegalo virusviremia;peripheralbloodlymphocytes;leukemia freesurvival 巨细胞病毒 (cytomegalovivus,cmv) 属于疱疹病毒科 β 属 DNA 病毒 机体免疫功能正常时, CMV 感染通常无或呈轻微临床症状 [1] ; 但当机体免疫功能尤其细胞免疫功能受到抑制, 如器官移植 先天性免疫缺陷综合征,CMV 可被重新激活, 并持续高水平复制, 产生有严重临床症状的 CMV 感染性疾病 [2] 近年随着大量新型免疫抑制剂的应用, 异体造血干细胞移植技术得到快速发展, 但移植后患者极易发生 CMV 感染 免疫系统在控制病毒感染 存活和复制等方面发挥重要作用 [3] CD4 + T 细胞分泌干扰素 γ 肿瘤坏死因子 α 以及白介素 2 诱发 Th1 型免疫反应 CD8 + T 细胞协助自然杀伤细胞表达免疫球蛋白样受体, 以进一步清除病毒 本研究通过检测异体干细胞移植后急性髓系白血病 (AML) 患者外周血淋巴细胞亚群分布, 探讨 CMV 感染对循环免疫状况及预后的影响 1 对象与方法 1.1 病例本研究纳入 2010 年 1 月至 2015 年 12 月在南京医科大学第一附属医院接受异体造血干细胞移植手术的 65 例 AML 患者, 年龄 6~65 岁, 中位数为 37 岁 排除接受 2 次及 2 次以上异体造血干细胞移植手术的 AML 患者 所有 AML 患者根据移植后有无 CMV 病毒血症, 分为 CMV 阳性组和 CMV 阴性组 更昔洛韦给药分移植前预防性用药和移植后控制性用药 所有患者均给予术前预防性用药 2 个月, 而 CMV 阳性组患者术后持续服用更昔洛韦 两组患者一般资料见表 实时荧光定量 PCR 检测血清 CMV 载量收集干细胞移植前后患者外周血 4mL,3000 r/min 离心 5min 留取血清, 采用 CMV 核酸定量检测试剂盒 ( 中山大学达安基因股份有限公司 ) 检测血清中 CMV 载量 反应程序 :93 预变性 2min, 93 变性 5s,57 退火延伸 45s, 共 40 个循环 若病毒载量 500 拷贝 /ml, 则判为阳性,7d 后再次检测 ; 若 <500 拷贝 /ml, 则判为阴性, 停止检测 1.3 流式细胞术检测外周血淋巴细胞比例收集 AML 患者移植前 移植后 7d 移植后第 1 ~3 月期间和移植后 3~6 个月期间这 4 个时间点 EDTA K2 抗凝外周静脉血 2mL 采用淋巴细胞分离液 ( 天津灏洋生物公司 ) 分离外周血单个核细胞, PBS 清洗 1 次后计数, 取 细胞加入抗 CD3 抗 CD4 和抗 CD8 抗体 (BD 公司 ), 室温避光孵育染色 20min,PBS 洗涤 2 次后弃上清液, 加入 200μLPBS 重悬细胞, 使用 BDFACSCalibur 流式细胞仪检测 T 细胞标记信号 1.4 统计学分析采用卡方检验或 Fisher 精确概率法分析患者临床信息与 CMV 感染间的联系 采用 Kaplan Meier 法评估患者整体生存率 ( 生存时间定义为从移植当天起到死亡日期或者是随访截止时间 ) 采用 Cox 比例回归模型分析与无白血病复发生存时间相关的危险因素 无白血病复发生存时间定义为移植当天起到复发时间点或随访时间截点期间无白血病复发 所有数据应用 SPSS17.0 软件进行分析 P 值 <0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 AML 患者 CMV 感染与临床各参数间的关系 65 例 AML 患者术前外周血 CMV 检测结果均阴性, 术后 38 例 (58.5%) 在 100 天内感染 CMV 进一步结合其他临床资料进行统计, 结果显示, 接受人类白细胞抗原 (humanleukocyteantigen;hla) 相符的无关供者造血干细胞移植 采用环孢素和甲氨蝶呤二联预防移植物抗宿主病和患有急性移植物抗宿主病的 AML 患者移植术后更易发生 CMV 感染 ( 均 P<0.01) 见表 异体造血干细胞移植后 CMV 感染改变外周血 CD8 + /CD4 + T 细胞比例流式细胞术检测结果显示,CMV 阳性组 CD4 + T 细胞相对于 CMV 阴性组比例明显下调, 而 CD8 + T 细胞比例明显上调,CD8 + /CD4 + T 细胞比值显著增加 (P<0.05 或 P<0.01) 见图 1

3 第 期 张洁心 巨细胞病毒感染对异体造血干细胞移植急性髓系白血病患者外周血 CD CD T细胞分布的影响 等 表 例急性髓系白血病患者 CMV感染与临床参数间关系 临床参数 n 男 女 病例 CMV阳性组 CMV阴性组 供体来源 HLA相符同胞供者 HLA相符无关供者 干细胞来源 外周血 脐血干细胞 外周血干细胞 清髓性预处理 减低强度预处理 急性移植物抗宿主病 慢性移植物抗宿主病 脐血干细胞 预处理方式 移植物抗宿主病预防 环孢素 甲氨蝶呤 抗胸腺球蛋白 移植物抗宿主病 例 χ值 P值 图 异体造血干细胞移植 AML患者 CMV感染后外周血 CD CD 细胞变化 术 后 控 制 CMV感 染 可 逆 转 外 周 血 CD 显示 CMV病毒转阴后 CD T细胞和 CD T细胞 CD T细胞比例 比例有所恢复 CD CD T细胞比值回落 与转 我们共收集到 例 CMV阳性患者病 毒转阴前后的流式细胞术检测数据 经自身比较后 阴前比较 差异均具有统计学意义 P 或 P 见图 图 例干细胞移植 AML患者 CMV转阴前后外周血 CD CD T细胞比例 术后活动性 CMV短期内对外周血淋巴细胞分 例 CMV感染患者全部转阴 比较 个外周血采集 布影响更大 时间点的流式细胞检测结果 显示 CD T细胞和 对接受异体造血干细胞移植的所有 AML患者 外周血淋巴细胞亚群分布比例结果跟踪 个月 CD T细胞比例改变主要发生在术后 个月 但 CMV阳性组的改变幅度大于 CMV阴性组 见图

4 江苏大学学报 医学版 第 卷 图 术后活动 CMV短期内对外周血淋巴细胞分布影响 CMV感染有助于临床预后 如图 所示 CMV阴性组的平均生 存 时 间 比 CMV阳性组略长 个月与 个月 两组 生存率无统计学差异 P 根据多变量 C x 比例风险模型可知 CMV感染和干细胞来源对 AML 患者无白血病复发存活有利 而移植物抗宿主病的 预防性治疗以及急性移植物抗宿主病的发生则是风 险因素 表 另一种途径 本研究中 我们对 例接受异体造血干细胞移 植的 AML患者进行回顾性分析 其中 例患者发 生 CMV感染 其 CD T细胞比例显著升高 导致 CD CD T细胞比值倒置 在使用抗病毒药物 更昔洛韦控制病毒感染后 CD T细胞比例呈下降 趋势 CD CD T细胞比值 也 恢 复 到 移 植 前 水 平 我们的研究还表明无白血病复发存活时间与 CMV感染呈正相关 AML患者可能受益于异体造 血干细胞移植后的早期 CMV感染 移植术后外周 血中早期出现 CMV可调动机体免疫系统 启动机体 抗病毒感染免疫 比如活化 γδt细胞可交叉识别 CMV感染的宿主细胞和白血病细胞 利于机体清除 癌细胞 有研究指出 自然杀伤细胞是移植后最 早再生的细胞类型之一 CMV感染能上调特殊类型 自然杀伤细胞 并激活其表面免疫球蛋白样受体 由 此增加后者抗肿瘤细胞效应 CMV感染如同 一把双刃剑 移植后 AML患者处于免疫抑制状态 图 两组 AML患者移植术后的生存曲线 表 C x回归分析 AML患者无白血病 复发存活相关临床指标 临床指标 风险比 CI P值 CMV感染 年龄 性别 干细胞来源 移植物抗宿主病预防 急性移植物抗宿主病 讨论 骨髓造血祖细胞为 CMV的主要潜伏部位和生 物储存库 被感染的造血祖细胞的分化和成熟导致 了 CMV的大量扩增 这可能是 CMV感染的根源之 一 白血病患者在术后常使用多种免疫抑制药 物进行治疗 这为 CMV感染提供了机会 有研究认 为异基因单核细胞源性巨噬细胞能够使潜伏的病毒 再激活 这也是异体造血干细胞移植后 CMV感染的 而潜伏的 CMV易在此时造成活动性感染 但值得 关注的是 CD T细胞比例在 CMV感染期间和感 染后都保持相对较高的水平 研究表明 慢性淋巴 细胞性白血病中 CD T和 CD T细胞均大量扩 增 虽然 CD T细胞在本研究 CMV阳性组中 数量没有增加 但是 CMV特异性 CD T细胞可通 过 Th 细胞因子和抗原提呈细胞的活化提高细胞毒 性 T细胞的活性 而且其亦可促进 CMV特异性 CD T细胞的分化及增殖 另外 CMV特异性 CD T细胞功能的恢复和维持需要 CMV特异性 T 辅助细胞的增殖和活化 但目前为止 CMV作用于白血病患者的分子机 制仍不清晰 今后我们将进一步研究 CMV和人体 免疫系统之间的关系 趋利避害 以便指导移植手术 后 AML患者的个体化治疗 参考文献 Ra f a l d spi M u r t z u k ueg Va r b b t si C e ta l

5 第 5 期 张洁心, 等. 巨细胞病毒感染对异体造血干细胞移植急性髓系白血病患者外周血 CD8 + /CD4 + T 细胞分布的影响 427 licitedbycmv reactivationafteralo SCTcros recog nizecmvandleukemia[j].leukemia,2013,27(6): [7] GreenML,LeisenringWM,XieH,etal.CMVreacti vationafteralogeneichctandrelapserisk:evidence forearlyprotection in acutemyeloid leukemia[j]. Blood,2013,122(7): [8] CookM,BriggsD,CraddockC,etal.DonorKIRgen otypehasamajorinfluenceontherateofcytomegalovir usreactivationfolowingt celrepletestem celtrans plantation[j].blood,2006,107(3): [9] ShedlockDJ,ShenH.RequirementforCD4Tcelhelp ingeneratingfunctionalcd8tcelmemory[j].sci ence,2003,300(5617): [10] RidgeJP,DiRosaF,MatzingerP.Aconditionedden driticcelcanbeatemporalbridgebetweenacd4 + T helperand at kilercel[j]. Nature,1998,393 (6684): [11] FosterAE,GotliebDJ,SartorM,etal.Cytomegalovir us specificcd4 + andcd8 + T celsfolowasimilarre constitutionpaternafteralogeneicstemceltransplanta tion[j].biolbloodmarowtransplant,2002,8(9): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 陈海林 ( 上接第 422 页 ) [6] ThomasH,LineO,MortenL,etal.Brainexpresed micrornasimplicated in schizophreniaetiology[j]. PLoSOne,2007,2(9):e873. [7] 刘平.ICD 10 精神与行为障碍分类 [M]. 北京 : 人民卫生出版社,1995. [8] 司天梅, 杨建中, 舒良, 等. 阳性和阴性症状量表 (PANSS, 中文版 ) 的信 效度研究 [J]. 中国心理卫生杂志,2004,18(1): [9] KondoH,ShimonoY,MukohyamaJ,etal.Discord anceofmcm7mrnaanditsintronicmicrornalevels underhypoxia[j].anticancerres,2017,37(7): [10] FaraveliI,CortiS.MicroRNA directedneuronalrepro grammingasatherapeuticstrategyforneurologicaldisea ses[j].molneurobiol,2017,[epubaheadofprint]. [11] KocerhaJ,KauppinenS,WahlestedtC.microRNAsin CNSdisorders[J]. NeuromolecularMed,2009,11 Severecytomegalovirusinfectioninapparentlyimmuno competentpatients:asystematicreview[j].virolj, 2008,5: [2] NakamuraR,BatiwalaM,SolomonS,etal.Persisting postransplantation cytomegalovirusantigenemia core lateswithpoorlymphocyteproliferationtocytomegalovir usantigenandpredictsforincreasedlaterelapseand treatmentfailure[j].biolbloodmarow Transplant, 2004,10(1): [3] PourgheysariB,BrutonR,ParyH,etal.Thenumber ofcytomegalovirus specificcd4 + Tcelsismarkedlyex pandedinpatientswithb celchroniclymphocyticleu kemiaanddeterminesthetotalcd4 + T celrepertoire [J].Blood,2010,116(16): [4] LiuWT,SunJR,LinCH,etal.Anindicatorcelas sayfordetectionofhumancytomegalovirusbasedonen hancedgreenfluorescentprotein[j].jvirolmethods, 2001,96(1): [5] MoreloCS,CranmerLD,SpectorDH.Invivoreplica tion,latency,andimmunogenicityofmurinecytomega lovirusmutantswith deletionsin them83 and M84 genes,theputativehomologsofhumancytomegalovirus pp65(ul83)[j].jvirol,1999,73(9): [6] ScheperW,vanDorpS,KerstingS,etal.γδTcelse (3): [12] 孙欣羊. 精神分裂症特异性生物标记物 microrna 的临床初步验证 [D]. 上海 : 第二军医大学,2014. [13] NafeeN,GoudaN.Nucleicacids basednanotherapeu ticscrosingthebloodbrainbarier[j].curgenet her,2017,17(2): [14] GardinerE,BeveridgeNJ,WuJQ,etal.Imprinted DLK1 DIO3regionof14q32definesaschizophrenia as sociatedmirna signatureinperipheralbloodmononu clearcels[j].molpsychiatry,2011,17(8): [15] LaiCY,YuSL,HsiehMH,etal.MicroRNAexpres sionaberationaspotentialperipheralbloodbiomarkers forschizophrenia[j].plosone,2011,6(6):e [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 何承志

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