四川动物!< 年 第 <! 卷 第! 期 + 2; <= W <!>W!!< FGH = <+ I J = 7= K)*<=!<=!= 基于线粒体 >E 基因和核 Q基因初步探讨广西拟水龟和 艾氏拟水龟的系统发生 胡启平! 黄程新! 许淑茹!! 张秋明<!! 马宁! 钟汉明&!!=广西医科大学细胞生物学与遗传学教研室南宁 &<!!=漳州卫生职业学院福建漳州 <+< <=广西水产技术推广总站南宁 &<!! =广西水产研究所南宁 &<! &=钦州市龟鳖协会广西钦州 &<& 摘要!广西拟水龟和艾氏拟水龟的分类和系统发生多年来存在争议* 通过测定广西拟水龟艾氏拟水龟和黄喉 拟水龟线粒体 ]F 基因和核 基因部分序列 合并 T 7` 7c 中拟水龟属其他物种的 ]F 基因和 基因部 分序列进行分析从分子水平探讨广西拟水龟和艾氏拟水龟的系统发生* ]F 基因数据分析发现 ]i eq和 `H树! W )种间遗传距离为 中广西拟水龟与安南拟水龟的聚类分支相互交织聚为一支二者种内遗传距离均为 W W W <&种间遗传距离明显小于同属内其他种间 W &+ W 的遗传距离表明广西拟水龟与安南拟水龟 可能为同一物种可能是安南拟水龟的同种异名或是作为安南拟水龟的一个亚种&]i树eQ树和 `H树均显示艾 氏拟水龟与黄喉拟水龟的位置和关系最为相近二者间的遗传距离为 W! W <&明显小于拟水龟属其他物种间 遗传距离而明显大于同属各物种内遗传距离艾氏拟水龟与黄喉拟水龟之间系统分类关系是介于种内与种间之 间&乌龟中华花龟安南拟水龟等物种都是与拟水龟属中其他物种先聚成一支后再与同科的地龟属的地龟形成姐 基因数据分析发现拟水龟属各物种间不存在 妹支支持将乌龟属花龟属和安南龟属并入拟水龟属的分类* 明显的遗传距离]i树和 eq树也未能对属中各物种的分子系统发生位置进行有效的界定但在属及属以上阶元的 分子分类系统中 基因可以作为分类依据并与线粒体基因数据有较好的一致性* 关键词! ]F 基因& 基因& 广西拟水龟& 艾氏拟水龟& 系统发生 中图分类号! Y&W +&Y)<文献标识码! M文章编号! K)*<!<! K* K) G Q G+ < 2* +2 7*7 )* +2! 2 )2 Q > R 2 & +) >E V )> QV <! &! \ZY @ 7! \ZM]T>5 7 7! ozn52 2!! [\M]TY 2 7! em] 7! [\G]T\ 7 7!=F @ 7 C> ` 7A T 7 T2 7 e A Z7 ] 77 7&<! >5 7!=[5 7 D 5 2 \ 5 j 7 > [5 7 D 5 2 L2J 7 Q 7 <+< >5 7 <=T2 7 L 5 V 57-7 7 > 7 ] 77 7&<!! >5 7 =L 5 S 5H 7 2 CT2 7 ] 77 7&<! >5 7 &=Y 7D 5 2 V @ 7 M 7 Y 7D 5 2 T2 7 [52 7M2 7 2S 7 &<& >5 7 5 & & V5@5 7 C* @*@ 7A * 5 E 7 A @2 AC =V 7 A 7 5@ 5 7A ]F 7 7A 72 D 5 2 @5 7 C@*@ 7 R2 7 CC b@*@ 7A W+* 7A E E 7 7 5]F 7A 7 R2 7 C 5 * @ A b7 A AC T 7` 7c b 7C A 5 C ]F 7 5 A C@*@ b E 7 5 C 5 A C+ 7 ]i eq 7A `H & 5 7 A 7 b 7 A =! = ) 7 5 C 5 b @ 7A b 7 A = = <& E b 7 5 b @ =V5 A b 2 5 5 7 5 C 5 5 @ 7 5 72= &+ = E A 7A A 5 @*@ b @ E E 7 7 b 5 + 2E @ C+ =N5 b7 7 ]i eq 7A `H A +* @ & 5 7 A 7 E b 7 5 b @ b 7 A =! = <& @ b5 5 b 5 7 5 C 5 5 @ 7 5 72 b5 b 2 5 5 7 5 C 5 5 @ 7 5 72 & 5 A 2@@ 5 5 7 5 @ E b 7 7A +* 7 5 @ 7! A C C 7 7 C 7 @ & V5 7 C @ 7A + 5 b7 7 ]i eq 7A `H 2@@ A 收稿日期!!! * +接受日期!!!!基金项目!水产畜牧业广西地方标准制定项目计划 桂渔牧函+!!&) 号 作者简介!胡启平男副教授研究方向两栖爬行类生物学- 2 E 5R@); 5 = = 7! 通讯作者 > @ 7A 7 2 5 张秋明 - R<)**)&*;<= 钟汉明 - *)&!&<;RR= *
四川动物 年第 卷第 期 & * **& +! ) ) -!&) **& +!) +! & *! &*) * & ) -) *& ) *! E*!!A*! >!)&**! & +&!!+ ) * + &!!)- ) ) **>* *) * + *)! & & & * & 拟水龟属 是淡水龟科 )) 下! 建立的具有硬甲 头颈部具有斑纹的一个属 本文基本遵从 等 的分类 乌龟属! 花龟属 和安南龟属 也并入本属 该属目前有多个种和亚种被广泛接受 * &++ - * 如安南拟水龟 里海拟水龟 日本拟水龟 - 地中海拟水龟 和黄喉拟水龟 等 中国生物物种名录 版 - * 和 中国动物志 认为 除艾氏拟水龟 和黄喉拟水龟外 广西拟水龟 * 也被认为是仅分布在中国广西的一个有效种 尽管在形态学和分子生物学方面对拟水龟属作了大量研究 但广西拟水龟和艾氏拟水龟的分类和系统发生始终存在争议 线粒体 具有分子结构简单 母系遗传 进化速率快 缺少重组等特点 基因适合于种间水平的 分子分类研究 ) 是与鼠源肉瘤病毒!!! A 同源 高度保守 单拷贝且无内含子的一种细胞癌基因 表达产物为卵母细胞成熟因子 该基因在一些爬行类 鸟类和哺乳类等动物的中等阶元的分子系统分类研究中均已得到了很好的应用!* 5 ) 本文拟通过测定采自广西十万大山 南宁等地的广西拟水龟 艾氏拟水龟 安南拟水龟和黄喉拟水龟 根据 中国动物志 鉴定 线粒体还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 脱氢酶亚单位 ) )! & - * 基因和核 基因的部分序列 合并从 < 下载的其他拟水龟属物种的 基因和 基因部分序列进行分析 从分子水平探讨广西拟水龟和艾氏拟水龟的分类归属问题 材料和方法 ) 实验材料本文所用实验材料见表 表 本实验采用的龟类标本 2 2 编号 物种名 采集地点 2 * 采集时间 * ) * 艾氏拟水龟 > A* &@ 艾氏拟水龟 > A* &@ 广西拟水龟 * > A* &@ 广西拟水龟 * > A* &@ 广西拟水龟 * > A* &@ 广西拟水龟 * > A* &@ 黄喉拟水龟 & &@ 黄喉拟水龟 > A* &@ 所有标本现存于广西钦州市野生动物驯养繁殖场 * >!) *) *; >) ) * * ) -!)&+) )+ 实验方法 )+) * 扩增与测序 总 提取采用经典酚 氯仿抽提法 取龟前肢肌肉组织约 & 加入 2 裂解液和 2 蛋白酶 & 2 消化约 至溶液透明清亮 次抽提分别加入 2 酚 I 氯仿 I 酚 I 氯仿 I 异戊醇 II 氯仿 I 异戊醇 I 氯仿 每次抽提 离心 加入两倍体积 乙醇沉淀过夜 用 乙醇洗涤 次 自然风干 加入 2 溶液 保存 5 引物根据 < 数据库中拟水龟属 和龟总科 序列信息 采用!!!! 软件设计 经 <2 比对后由上海生工生物工程有限公司合成 上 下游引物分别为 J J J J 上 下游引物分别为 J
四川动物 年第 卷第 期 & J J J 反应体系均为 2 其中 - +! 2 2A& 2 2) 2 2 上 下游引物各 2 模板 2 聚合酶 2 再用 )) 补足至 2 5 循环参数均为 预变性 变性 退火 延伸 个循环 后延伸 每次反应设立不含 模板的空白对照 扩增得到的 5 产物送上海生工生物工程有限公司测序 )+)+ *- 和 基因序列分析 对所测得的序列进行拼接 用 5 软件 5 * 程序比对 同源序列 并经人工核查 所有序列均被视为无序特征 再用 A 软件分析其碱基组成及变异情况 计算其多态位点数 简约信息位点数 并基于! 双参数模型!! *! 计算种 属 科间的遗传距离! )+) *- 和 基因系统发生分析 合并 < 中下载的拟水龟属及外群 序列和 序列数据 表 的对位排列获得一致序列 然后在 A 软件上 以淡水龟科地龟属 的地龟 鼻龟属 的丽环鼻龟 个亚种和龟科 )) 锦龟属!! 的锦龟! )! 箱龟属 + 的普通箱龟 + 为外群 分别用邻接法 &-! & E 和最大简约法 A @! A 构建分子系统树 E 法选用! 双因子参数模型 将序列中的转换和颠换位点均视为信息位点 并对所有位点的一致性赋予相同的加权值 对于序列中的插入与缺失位点成对删除 A 法采用包含所有缺失 缺口 所有编码和非编码位点的启发式搜索! *A 法和 E 法均采用 <* *! 法来检验分子系统树各节点的置信值 重复 次 此外 是线粒体基因 容易饱和且密码子的各个位置进化速率很可能不同 因此本文对 基因序列还用 A!< 软件基于分区贝叶 表 + 从 下载的 *- 基因和 基因序列 2 + *- 编号 科 属 种 基因 登录号 -! 淡水龟科 拟水龟属 黄喉拟水龟 K )) 安南拟水龟 K E 安南拟水龟 = E 安南拟水龟 地中海拟水龟 ; 日本拟水龟 - K 乌龟 K 中华花龟 K 黑颈乌龟 希腊拟水龟 = 里海拟水龟 = 地龟属 地龟 = 鼻龟属 丽环鼻龟索诺拉亚种 丽环鼻龟曼氏亚种 丽环鼻龟雕纹亚种 丽环鼻龟雕纹亚种 龟科 )) 锦龟属 锦龟! K! 箱龟属普通箱龟 + 本文实验结果 * +! *!! +
四川动物 年第 卷第 期 & 斯法构建了贝叶斯 < 树 <! ) 与 A 法和 E 法的建树结果相互验证 基因按照蛋白质编码位点进行分区 分区策略采取从不分区到最多 个分区 最佳核苷酸进化模型利用 A) * 软件和赤池信息量准则 +! *! *! 确定 王绪祯等 + 结果 +) *- 基因和 基因序列分析结果实验获得拟水龟属龟的 基因序列长度为 - 基因序列长度为 - 扩增结果稳定清晰 序列已输入美国生物信息中心 < 的基因库 < 基因登录号为 E E 基因登录号为 E E 经比对后 获得一致序列 基因长 - 基因长 - 应用 A 软件 * * * 程序分析 不含外群 在 序列中获得变异位点 个 总变异率为 简约信息位点! +! * * 个 单变异多态位点 &* * 个 个转换 *! * 个颠换 *!! 转换频率大约是颠换的 倍 其中 间的转换 比 间的转换 发生频率稍高 和 的颠换也稍高于 和 基因片段中 碱基平均含量分别为 其中 G 的含量 明显高于 G 的含量 这与脊椎动物线粒体 的 2 链碱基组成相一致 刘自民等 王湘君 赵尔宓 在 序列中获得变异位点 个 总变异率为 因在一个广西拟水龟个体中一条链的 位点发生 突变为 形成杂合子所致 而其他 个个体间无差异 无简约信息位点和单变异多态位点 合并 < 中的拟水龟属及外群数据进行对位排列和 * * * 程序分析 序列中共获得一致序列 - 变异位点 个 总变异率为 简约信息位点 个 单变异多态位点 个 个转换 个颠换 转换频率大约是颠换的 倍 其中 间的转换比 间的转换发生频率稍高 和 的颠换各仅有 个 无 和 的颠换 序列中共获得一致序列 - 获得变异位点 个 总变异率为 简约信息位点 个 个转换 个颠换 转换数明显高于颠换数 其中 间 的转换比 间的转换发生频率高 的颠换仅有 个 无 和 的颠换 +)+ 遗传距离分析从 基因分析 内群 个个体中 最大和最小遗传距离分别为 和 平均距离为 其中同种间的遗传距离最小 如艾氏拟水龟间为 广西拟水龟及安南拟水龟间均为 黄喉拟水龟间为 同属种之间的遗传距离次之 如艾氏拟水龟与广西拟水龟 黄喉拟水龟 安南拟水龟 地中海拟水龟 日本拟水龟 乌龟 中华花龟 大头乌龟 希腊拟水龟和里海拟水龟等之间为 与 等 报道的水龟属! 内各种间 的遗传距离相近 同科属间种的遗传距离再次之 如地龟与拟水龟属各种间的遗传距离为 科间种之间的遗传距离为最大 如锦龟与地龟及拟水龟属各龟之间的遗传距离达 从 基因分析 内群 个个体中 遗传距离为 仅一个广西拟水龟个体和地中海拟水龟与其他个体有差异 其他个体间遗传距离为 拟水龟属与鼻龟属间的遗传距离为 而与龟科的箱龟属间的遗传距离则达到 丽环鼻龟 个亚种间的遗传距离为 同一亚种间的遗传距离为 可见 核 基因显示的各阶元的差异均比线粒体 基因所显示的小 用来进行种级分子系统分类时其分辨率低于线粒体 基因 +) 基于 *- 基因和 基因部分序列构建的系统树基于 基因构建的系统树中 图 E 树 A 树所显示的各供试种的位置和关系基本一致 E 树中 安南拟水龟与广西拟水龟相互交织并聚为一支 黄喉拟水龟与艾氏拟水龟首先各自聚为一支 然后两支形成姐妹支 乌龟与黑颈乌龟聚成一支后 再与日本拟水龟 中华花龟聚为一支 这三支再与里海拟水龟 希腊拟水龟和地中海拟水龟共同构成拟水龟属分支 与 E 树中不同的是 A 树中乌龟与黑颈乌龟没有首先聚成一支 两树中各供试种的位置和关系都得到 以上的支持率 < 树构建过程中 基因不分区及分区数据经 A) * 软件检测得最佳核苷酸进化模型为普通时间可逆 &! *!! - 5 模型 位点间差异比率采用 分布比率差异 &
四川动物!< 年 第 <! 卷 第! 期 + 2; <= W <!>W!!< A E2 A 7 其中部分为不变位点 持率偏低的节点发生了变化但还是基于不分区的 其余参数为默认值& 采 @ @ 7 C 7 7 `H树的各个分支的后验概率 @ @ E E 用 e ` 软件 法运算 代 每 QQ 值最高故本文只显示基于不分区的 `H树 图 代取样 次 从得到的样本中舍弃!& 个老化样本 ` * `H树所显示的结果与 ]i树结果基本一致 后总结得到共有树* 结果表明基于不分区及分区 且更清晰地表明了里海拟水龟希腊拟水龟和地中 的 `H树拓扑结构基本一致 差异在于树中一些支 海拟水龟与属中三个分支的关系* 图 基于淡水龟科拟水龟属 ]F 基因部分序列构建的分子系统树 L WV5 2 @5 7 E A 7 ]F 7 R2 7 7 C* T A A MW基于 _ 2 双因子参数模型构建的 ]i树支上数值为 次自助统计得到的对该分支的支持百分数&`W基于 TVS模型构建的 `H树支 间数值为对该分支的后验概率 MW] 5E i 7 7@5 7 2 A 2 7 5_ 2! @ 7 e-tmw WV5E @ 7C A 7 2 C 5 E 7 5 5 b7 E @ & `W`H@5 7 2 A 2 7TVS 7 e ` <W 5@ @ E E C QQ 5 E 7 5 5 b7 E 7A E b 5E 7 5 b 7 5E 7 5 基于 基因建构的系统树中]i树和 eq 分序列的遗传距离显示出! 科间距离 h属间距离 h 树所显 示 的 各 供 试 种 的 位 置 和 关 系 基 本 一 致 图 种间距离&亚种间距离&亚种内距离 的趋势这表! ]i树和 eq树中拟水龟属各物种并为一支且 明基于线粒体 ]F 基因和核 基因部分序列的 都获得近 )f的支持率但均未能进一步形成有效 分子系统分类与基于外部及解剖特征的形态分类是 分支&]i树中拟水龟属分支与同科而不同属的丽 基本一致的* 环鼻龟 < 个亚种聚成的分支形成姐妹支该姐妹支 DA@拟水龟属内各物种的系统分类 再与龟科的普通箱龟并支而在 eq树中拟水龟属 从 ]F 基因分析]i eq和 `H树中所有拟水 分支先与普通箱龟形成姐妹支该姐妹支再与丽环 龟属物种都是先聚成一支后再与同科的地龟属的地 鼻龟各亚种并支* 龟形成姐妹支而且各分支节点均获得 )f以上的 D@讨论!* 只龟的线粒体 ]F 基因和核 基因部 * 支持率&从 基因分析]i树和 eq树均显示拟 水龟属所有物种并为一支且都获得近 )f的支持 率但均未能进一步形成有效分支说明在拟水龟属
四川动物!< 年 第 <! 卷 第! 期 + 2; <= W <!>W!!< 图!基于淡水龟科拟水龟属 基因部分序列构建的分子系统树 L W!V5 2 @5 7 E A 7 7 R2 7 7 C* T A A 基于 _ 2 双因子参数模型构建的 ]i树支上数值为 次自助统计得到的对该分支的支持&+f的百分数 ] 5E i 7 7@5 7 2 A 2 7 5_ 2! @ 7 e-tmw WV5E @ 7C A 7 2 &+f C 5 E 7 5 5 b7 E 7A E b 5E 7 5 @ 中 基因不能作为属内种间的分子分类系统依 遗传距离而与同属其他物种间遗传距离差别不大& 据&鼻龟属丽环鼻龟三个亚种并为一支后再与同科 分子系统树和遗传距离等数据均表明广西拟水龟 的拟水龟属聚成一支最后再与龟科箱龟属的普通 与安南拟水龟为同一物种的可能性较大而不支持 基因可以作为属及属以上阶 箱龟并支表明 广西拟水龟是艾氏拟水龟的同种异名广西拟水龟 元的分子系统分类的依据* 从线粒体 ]F 基因看 是艾氏拟水龟和黄喉拟水龟的复合物等建议* 如果 本文数据支持 N@ 7c等! 郑将臣等! 将 广西拟水龟和安南拟水龟是同一物种由于安南拟 乌龟属花龟属和安南龟属并入拟水龟属的分类* 水龟 W+ N E 7 c < 先命名于广西 DAC@广西拟水龟的属内分类地位 拟水龟 W@*@ > 7 故 W@*@ [5 和 MA < 等认为广西拟水龟是艾氏 应该是 W+ 的同种异名* 拟水龟的同种异名而 Q 5 和 N5! 等认为 N@ 7c等!! 分析闭壳龟属 * 个个 广西拟水龟是艾氏拟水龟和黄喉拟水龟的复合物 体& 个核基因数据后发现核基因数据在种的界 因为它的模式种包括了艾氏拟水龟和黄喉拟水龟的 定和系统发生分析上与线粒体分子数据不一致并 特征&此外[5 和 MA < Q 5 等! 认为核基因数据在种的界定和系统发生分析上更为 认为广西拟水龟和艾氏拟水龟的模式种都是购自 可靠* ` 等! 用 个核基因位点解决了 当地居民或宠物市场其模式产地是未知的* 但上 龟系统发生分析中! 个极其使人困惑悬而未决的 述观点没有正式发表* 基因数据不管从遗传 节点问题* 从本文核 从 ]F 基因分析本文图 中 ]i树和 `H树均 距离还是从分子系统树分析都无法在拟水龟属中 显示广西拟水龟与安南拟水龟的聚类分支相互交 进行种的界定但在鼻龟属却可以界定至亚种表明 织在一起聚为一支然后与艾氏拟水龟和黄喉拟水 单个特定的基因并不适合于所有物种的分子系统分 龟聚合形成的分支成为姐妹支&广西拟水龟和安南 类* 尽管 ]F 基因分子数据表明广西拟水龟与安 拟水龟种内遗传距离均为 W! W)种间遗传 南拟水龟应为同一物种但两个物种间在外部形态 W <&种间遗传距离则明显小于同 距离为 W 基因 和解剖结构上仍有较大区别现有的核 属内其他种间 W&+ W 的遗传距离 黄喉拟水 分子数据也未能说明两者间的系统发生关系广西 龟与艾氏拟水龟之间除外 &广西拟水龟与艾氏拟水 拟水龟能否作为安南拟水龟的一个亚种以及二者 龟和 黄 喉 拟 水 龟 的 遗 传 距 离 分 别 达 到 W&+ 的系统分类地位是以分子数据为主还是以外部形态 W+W+ W *+明显高于与安南拟水龟间的 和解剖结构特征为主尚待进一步补充数据讨论* *&
四川动物 年第 卷第 期 & ) 艾氏拟水龟 ) 的属内分类地位基于同种异型酶 形态学 野外分布和线粒体 等数据研究 等! 和 及 等提出艾氏拟水龟是三线闭壳龟! 和黄喉拟水龟的杂交种 或是闭壳龟属一个未知种与拟水龟属或花龟属一个物种的杂交种 从 基因分析 图 中 E 树和 < 树均显示 两个艾氏拟水龟个体先聚为一支 然后再与 个黄喉拟水龟个体聚合形成的分支聚合成姐妹支 即二者各自先聚为一支 然后再聚为姐妹支 可见 E 树和 A 树所显示的各供试种中 艾氏拟水龟与黄喉拟水龟的位置和关系最为相近 艾氏拟水龟与黄喉拟水龟之间的遗传距离是 明显小于拟水龟属其他龟种间遗传距离 广西拟水龟与安南拟水龟之间除外 而明显大于拟水龟属各龟种内遗传距离 但从核 基因数据中未能得到艾氏拟水龟与黄喉拟水龟及其他拟水龟属种间的关系 从现有的线粒体 基因数据来看 艾氏拟水龟与黄喉拟水龟之间系统分类关系是介于种内与种之间 由于取材的限制 广西拟水龟和艾氏拟水龟的系统分类地位有待于进一步补充数据研究确认 - 参考文献 刘自民 韦毅 麻秀珍 等 白头叶猴线粒体 基因和 环区的序列及其分类地位的初探 E 广西科学 王湘君 赵尔宓 华北地区的短尾蝮分类地位的确定及短尾蝮种下分类的探讨 E 四川动物 王绪祯 甘小妮 李俊兵 等 基于分区贝叶斯法和最大似然法的鲤科鱼类系统发育分析及其系统学意义 E 中国科学 生命科学 郑将臣 万全 程起群 等 基于!5 序列探讨龟鳖类的遗传分化和系统发生 E 湖南农业大学学报 自然科学版 中国科学院 中国动物志 第一卷 A 北京 科学出版社出版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