应用说明 3000 转染试剂 采用 3000 试剂 改善慢病毒生产 Invitrogen 3000 转染试剂是一款高效且经济的慢病毒生产工具 ( 图 1) 这种通用型试剂可实现较高的病毒 滴度, 即便是较大或难以包装的基因 在 此, 我们展示了 3000 试剂用 于生产高品质 高滴度慢病毒的有效性, 同时可最大程度缩短时间并减小试剂用量 工作流程如图 2 所示, 随后是更详细的实验方案 慢病毒载体 plenti 表达重组体 plp1 利用 3000 + P3000 试剂转染 ViraPower 包装混合物 plp/vsvg plp2 杀稻瘟菌素 GFP 滴度 采用 3000 试剂进行慢病毒生产的优势 : 出众的性能 与业内现有的试剂比, 未浓缩的病毒滴度更高 ( 图 3) 更大的基因 即便是较大或难以包装的基因亦可获得较高的病毒滴度 293T 或 293FT 细胞 转录 病毒蛋白合成 病毒 RNA 合成 出芽 重组病毒 浓缩 ( 可选 ) 更简单 无需用其他试剂促进慢病毒生产 ( 如磷酸氯喹 丁酸钠 咖啡因 ) 更快速 病毒收集的时间为 24 小时, 较其他试剂更短, 反向转染时间为近 2 天, 较其他试剂获得相当病毒滴度的时间更短 图 1. 采用 3000 试剂进行慢病毒生产 采用 3000 试剂, 将包 含目的基因的慢病毒重组体及慢病毒包装混合物共转染入 293T 或 293FT 细胞 孵育细胞后, 收集包含慢病毒的上清液, 通过离心去除细胞碎片 根据慢病毒重组体的不同, 利用杀稻瘟 菌素筛选或分析 GFP 阳性细胞的百分比, 确定病毒滴度 更容易 无需包被培养板或培养瓶
图 2. 采用 3000 试剂的慢病毒生产流程 第 1 天第 0 天 时间轴步骤详细步骤 ( 规模优化 ) 涡旋振荡 2-3 秒 10-20 分钟 接种 293T 或 293FT 细胞至 95-99% 汇合时转染 制备 A 管 : 使用 Opti-MEM I 培养基稀释 3000 试剂 充分混匀 接种 293T 或 293FT 细胞至制备 B 管 : 使用 Opti-MEM I 培养基稀释 ViraPower 慢病毒包装混合物和 plenti 表达重组体, 然后加入 P3000 Enhancer 试剂并充分混匀 将 A 管加入 B 管 (1:1 比例 ), 充分混匀 孵育 组分 6 孔板 10cm 培养板 T175 培养瓶 包装培养基体积 2mL 12mL 37mL 293T 或 293FT 细胞 / 孔 1.2 x 10 6 7.0 x 10 6 22.1 x 10 6 复合物中的 Opti-MEM I 250 μl 1.5mL 4.6mL 3000 试剂 7 μl 41μL 129 μl 复合物中的 Opti-MEM I 250 μl 1.5mL 4.6mL ViraPower 包装混合物 2.25μg 13.0μg 41.4μg plenti 表达载体 0.75μg 4.3μg 13.8μg P3000 试剂 6μL 35 μl 111μ L A 管体积 250 μl 1.5mL 4.6mL B 管体积 250 μl 1.5mL 4.6mL 室温孵育 10 20 分钟 去除孔中 50% 的培养基去除的培养基体积 1mL 6mL 18.5mL 将 DNA- 脂质体复合物加至细胞中复合物体积 ( 每孔 ) 500 μl 3mL 9.2mL 8 小时 孵育 6 小时 在 37 C 5% CO 2 下孵育 6 小时 去除并更换包装培养基, 然后孵育过夜 包装培养基体积 2mL 12mL 37mL 首次收集病毒上清液 转染 24 小时后, 收集全部的细胞上清液 ; 置于 4 C 保存 第 2 天 替换成预热的包装培养基 替换的包装培养基体积 2mL 12mL 37mL 过夜 孵育 在 37 C 5% CO 2 下过夜孵育 第 2 次收集病毒上清液, 与首次收集的上清液混合 转染 52 小时后, 收集全部的细胞上清液 收集总体积 4mL 24mL 74mL 第 3 天 2,000 rpm 离心病毒上清液 通过 45μm 孔径的过滤器过滤上清液 测量滴度 分装并置于 - 80 C 保存 完全培养基 :500mL Gibco DMEM, 高糖, GlutaMAX 添加剂, 丙酮酸盐及 10% Gibco FBS 慢病毒包装培养基 :500mL Gibco Opti-MEM I 减 血清培养基, 加入 1mM Gibco 丙酮酸钠和 5% Gibco FBS 的 GlutaMAX 添加剂
A 20 18 16 14 12 慢病毒滴度水平 3000 试剂与其他同类产品 Titer (x10 6 ) 10 8 6 4 2 0 C CaCl 2 2000 FuGENE HD FuGENE 6 JetPEI 3000 B 生产细胞系 插入基因大小 3000 vs. FuGENE HD 病毒滴度的增加倍数比较 3000 vs. 3000 vs. CaCl 2 FuGENE 6 3000 vs. JetPEI reagent 293FT 293T 0.7kb 3x 26x 9x 4x 3kb 8x 16x 9x 17x 0.7kb 4x 10x 5x 1x 3kb 4x 10x 4x 4x 图 3. 3000 试剂的慢病毒生产性能远优于主要竞争厂商的转染试剂 (A) 使用 3000 试剂与常用试剂在 293FT 细胞中采用 3kb 插入 基因获得的滴度比较 (B) 采用两种不同的细胞系和插入片段大小的滴度水平增加倍数概括 (C) 连续稀释和浓缩病毒的杀稻瘟菌素筛选表明, 采用 3000 试剂可获得较高的滴度水平 使用 3000 试剂进行慢病毒生产的详细实验方案 材料 注 : 所有的病毒制备和操作均应遵循您所在机构的生物安全 2 试剂 货号 级 (BL-2) 实验方案指导原则 培养基配制 DMEM, 高糖,GlutaMAX 添加剂, 丙酮酸盐 10569010 完全培养基 经过认证的胎牛血清, 澳洲产 16000044 Geneticin 选择性抗生素 (50mg/mL) 10131035 Opti-MEM I 减血清培养基, GlutaMAX 添加剂 51985034 Opti-MEM I 减血清培养基 31985062 丙酮酸钠 (100mM) 11360070 ViraPower 慢病毒包装混合物 3000 转染试剂 K497500 L3000015 要配制 293T 和 293FT 细胞的完全培养基, 在无菌条件下将下列组分混匀 : 450mL DMEM, 高糖,GlutaMAX 添加剂, 丙酮酸盐 50mL 经过认证的胎牛血清, 澳洲产 如果使用 293FT 细胞, 则另外加入 500μg/mL Geneticin 选择性抗生素 慢病毒包装培养基 Vivid Colors plenti6.3/v5-gw/emgfp 表达对照载体 V37006 要配制慢病毒包装培养基, 在无菌条件下将下列组分混匀 :
474mL 的 Opti-MEM I 减血清培养基,GlutaMAX 添加剂 25mL 经过认证的胎牛血清, 澳洲产 1mL 丙酮酸钠 (100mM) 正向转染 (6 孔板 ) 下列说明针对 6 孔板规格 如需扩大转染规模, 请参见 表 1. 第 1 天 ( 下午 ): 细胞接种 1. 将 293T 或 293FT 细胞以 ~1.2 x 10 6 个细胞 / 孔的密度接种于含有 2mL 慢病毒包装培养基的 6 孔培养板中 2. 置于 37 C 5% CO 2 条件下孵育细胞过夜 第 2 天 ( 早上 ): 转染 转染时细胞密度应达到 95-99% 汇合 组分 A 管 Opti-MEM I 减血清培养基 3000 转染试剂 B 管 Opti-MEM I 减血清培养基 P3000 Enhancer 试剂 ViraPower 慢病毒包装混合物 (1μg/μL) plenti 表达载体 1. 将 Opti-MEM I 减血清培养基恢复至室温, 如下表所述制备 A 管和 B 管 : 注 : 使用 Opti-MEM 培养基稀释的 3000 试剂 应在稀释后 15 分钟内用完 时间过长会导致转染效率下 降 体积 250μL 7μL 250μL 6μL 2.25μL 0.75μg 2. 制备脂质体 -DNA 复合物, 将 A 管内容物转移至 B 管并充分混匀 4. 加入复合物前, 每孔去除 1mL 的培养基, 使每孔总体积为 1mL 5. 向每孔加入 500μL 的脂质体 -DNA 复合物, 小心地靠着孔壁加入液体, 以免破坏细胞 轻轻搅拌培养板, 使其分布 均匀 6. 将培养板置于 37 C 5% CO 2 条件下孵育 6 小时 7. 转染 6 小时后, 更换每孔中的平板培养基 从每孔中小心吸去包含脂质体 -DNA 复合物的培养基, 吸出的培养基用 10% 漂白溶液处理后再处置 替换成 2mL 预热的慢病毒包装培养基 注 : 由于去除的培养基中包含少量慢病毒, 应遵循机构指导 原则用漂白溶液妥善处理并丢弃 8. 将培养板放回培养箱, 在 37 C 5% CO 2 下过夜孵育 第 3 天 ( 早上 ): 收集第一批病毒 1. 转染 24 小时后, 从每孔中收集 2mL 细胞上清液, 装入 15mL 锥形管中并置于 4 C 保存 2. 用 2mL 预热的慢病毒包装培养基替换收集的培养基 3. 将培养板置于 37 C 5% CO 2 条件下过夜孵育 第 4 天 ( 下午 3 点左右 ): 收集第二批病毒 1. 转染约 52 小时后, 从每孔中收集 2mL 的细胞上清液, 与首次收集的上清液混合, 使收集上清液总体积为 4mL 注 : 处置前, 用 10% 漂白溶液处理所有细胞培养容器和吸 头 2. 室温下以 2,000 rpm 离心收集的 4mL 上清液 10 分钟, 去除细胞碎片 收集并转移上清液, 弃去细胞 沉淀 3. 采用 45μm 孔径过滤器过滤澄清的慢病毒上清液, 去除残留的细胞碎片 4. 将病毒分装至冻存管, 置于 -80 C 保存 也可以在冷冻之前浓缩病毒 限制分装病毒冻融次数, 以维 持滴度 3. 室温孵育复合物 10-20 分钟
表 1. 使用正向转染扩大病毒生产规模 DNA 共转染 细胞培养容器 倍增系数 * 包装培养基接种体积 (ml) 每孔 293T 或 293FT 细胞数 复合物中的 Opti-MEM I 培养基体积 慢病毒包装 (DNA) ViraPower 包装混合物 (μg) 基于 plenti 的载体 (μg) P3000 试剂 (μl) 3000 试剂 (μl) 替换的慢病毒收集的慢病毒包装培养基体总体积 (ml) 积 (ml) 6-well 1 2 1.2 x 10 6 2 x 250µL 2.25 0.75 6 7 2 2 x 2 60mm 2.2 4 2.6 x 10 6 2 x 500µL 5.0 1.7 13 15 4 2 x 4 10cm 5.8 12 7.0 x 10 6 2 x 1.5mL 13.0 4.3 35 41 12 2 x 12 T75 7.9 16 9.5 x 10 6 2 x 2mL 17.8 5.9 47 55 16 2 x 16 T175 18.4 37 22.1 x 10 6 2 x 4.6mL 41.4 13.8 111 129 37 2 x 37 * 倍增系数基于 6 孔板生长区域 转染前一天需要达到 ~75-80% 汇合, 转染时达到 ~95-99% 汇合 反向转染 (6 孔板 ) 第 1 天 ( 早上 ): 复合物形成和细胞接种 1. 在预热的慢病毒包装培养基中制备适当浓度的细胞悬液 ( 参见表 2) 2. 将 Opti-MEM I 减血清培养基恢复至室温, 如下表所述制备 A 管和 B 管 组分 A 管 Opti-MEM I 减血清培养基 3000 转染试剂 B 管 Opti-MEM I 减血清培养基 P3000 Enhancer 试剂 ViraPower 慢病毒包装混合物 (1μg/μL) plenti 表达载体 体积 250μL 7μL 250μL 6μL 2.25μL 0.75μg 3. 将 A 管内容物加至 B 管, 室温孵育 10-20 分钟 4. 将 500μL 的脂质体 -DNA 复合物直接加入 6 孔培养板的孔中 5. 用 1mL 慢病毒包装培养基将 293T 或 293FT 细胞以 ~3.6 x 10 6 个细胞 / 孔的密度接种于 6 孔培养板中 第 1 天 ( 下午 ): 培养基更换 7. 转染 6 小时后, 更换每孔中的平板培养基 从每孔中小心吸去包含复合物的培养基, 用 10% 漂白溶液处理后再处置 用 2mL 预热的慢病毒包装培养基替换 8. 将培养板放回培养箱, 在 37 C 5% CO 2 下过夜孵育 第 2 天 ( 早上 ): 收集第一批病毒 1. 转染 24 小时后, 从每孔中收集 2mL 细胞上清液, 装入 15mL 锥形管中并置于 4 C 保存 2. 用 2mL 预热的慢病毒包装培养基替换收集的培养基 3. 将培养板置于 37 C 5% CO2 条件下过夜孵育 第 3 天 ( 下午 3 点左右 ): 收集第二批病毒 1. 转染约 52 小时后, 从每孔中收集 2mL 的细胞上清液, 与首次收集的上清液混合, 使收集上清液总体积为 4mL 2. 室温下以 2,000 rpm 离心 4mL 收集的上清液 10 分钟, 去除细胞碎片 收集并转移上清液, 弃去细胞沉淀 3. 采用 45μm 孔径过滤器过滤澄清的慢病毒上清液, 去除残留的细胞碎片 4. 将病毒分装至冻存管, 置于 -80 C 保存 也可以在冷冻之前浓缩病毒 限制分装病毒冻融次数, 以维持滴度 采用正向和反向转染获得的滴度比较如图 3 所示 注 : 对于反向转染, 细胞接种密度比正向转染高 3x 6. 将培养板置于 37 C 5% CO 2 条件下孵育 6 小时
表 2. 使用反向转染扩大病毒生产规模 DNA cotransfection 细胞培养容器 倍增系数 * 包装培养基接种体积 (ml) 每孔 293T 或 293FT 细胞数 复合物中的 Opti-MEM I 培养基体积 慢病毒包装 (DNA) ViraPower 包装混合物 (μg) 基于 plenti 的载体 (μg) P3000 试剂 (μl) 3000 试剂 (μl) 替换的慢病毒包装培养基体积 (ml) 收集的慢病毒总体积 (ml) 6-well 1 1 3.6 x 10 6 2 x 250μL 2.25 0.75 6 7 2 2 x 2 60mm 2.2 2 7.92 x 10 6 2 x 500μL 5.0 1.7 13 15 4 2 x 4 10cm 5.8 6 21 x 10 6 2 x 1.5mL 13.0 4.3 35 41 12 2 x 12 T75 7.9 8 28.4 x 10 6 2 x 2mL 17.8 5.9 47 55 16 2 x 16 T175 18.4 18 66.2 x 10 6 2 x 4.6mL 41.4 13.8 111 129 37 2 x 37 * 倍增系数基于 6 孔板生长区域 7e+6 6e+6 10kb DNA 大小 7.8kb 3e+7 2.5e+7 10kb DNA 大小 7.8kb 5e+6 2e+7 滴度 4e+6 3e+6 2e+6 1e+6 滴度 1.5e+7 1e+7 5e+6 0e+6 正向反向正向反向 293FT 0e+0 正向反向正向反向 293T 图 3. 采用正向和反向转染获得的滴度比较 采用正向和反向转染实验方案和 2 种不同的基因大小, 比较在 293FT 和 293T 细胞中的滴度 两种方法的滴度水平相当 通过 GFP 筛选或杀稻瘟菌素筛选测量慢病毒滴度重要提示 : 在整个使用过程中慢病毒必须解冻后置于冰上 解冻后, 轻轻拍打试管或慢慢上下颠倒混合病毒 不可涡旋振荡 必须遵循机构指导原则处理慢病毒 所以材料必须用 10% 漂白溶液处理后再处置 通过 GFP 筛选进行滴定 材料 慢病毒 HT1080 细胞系 培养基 : Gibco DMEM, 高糖, GlutaMAX 添加剂, 丙酮酸盐及 10% FBS
10mg/mL Polybrene 试剂 (Fisher Scientific 货号 :NCO663391) Corning 96 孔圆底培养板, 用于稀释 (Fisher Scientific 货号 :05539200) 第 1 天 ( 早上 ) 本实验方案针对 96 孔板规格, 适用于高通量流式细胞 仪分析 1. 将 HT1080 细胞以 7,000 个细胞 / 孔的密度接种于含有 100μL 培养基的 96 孔板中 N 1 N 2 10 1 N 3 N 4 10 2 10 3 10 4 2. 在培养箱中保存 4-5 个小时, 直至转导 3. 转导之前, 按下述方法制备新鲜的病毒稀释液 : a. 将 15mL 新鲜培养基与 12μL 的 10mg/mL Polybrene 试剂混合 ( 终浓度为 8mg/mL) 涡旋混匀 b. 对于每个病毒样本, 将上一步制备的 135μL 培养基加入 96 孔圆底培养板的 16 个孔中, 采用 4 孔 4 孔的模式 ( 参见上图 ) 注 : 建议采用 n = 4 进行滴定 c. 将 15μL 慢病毒上清液加至第一排的各孔中 ( 总体积 150μL;1:10 稀释 ) d. 使用吸头混匀 e. 对第 1 排进行连续稀释 ( 使用多通道移液器, 如有 ): 从第 1 排转移 15μL 至第 2 排, 混匀 (1:100) 从第 2 排转移 15μL 至第 3 排, 混匀 (1:1,000) 从第 3 排转移 15μL 至第 4 排, 混匀 (1:10,000) 4. 要转导细胞, 去除 HT1080 细胞中的平板培养基, 将 100μL 制备好的稀释液转移至每个相应的孔中 ( 使用多通道移液器, 如有 ) 第 2 天 1. 去除包含病毒上清液的培养基, 替换成新鲜的 HT1080 培养基 ( 不含 Polybrene 试剂 ) 2. 孵育细胞 3 天, 分析 GFP 阳性细胞的百分比 ( 建议采用流式细胞仪分析 ) 滴度的计算 1. 要计算单位为 TU/mL 的滴度, 根据 GFP 阳性细胞的百分比确定适当的稀释因子 2. 使用下列公式 : 滴度 = (F C/V) D, 其中 F = GFP 阳性细胞频率 (GFP 阳性细胞百分比 /100) C = 转导时的每孔细胞数 (7,000 个细胞 ) V = 菌液体积 (ml) (0.1mL) D = 慢病毒稀释因子 示例 : ( 依据 96 孔实验方案 ) 慢病毒稀释度 GFP 阳性细胞 10 2 82% 10 3 30% 10 4 4.4% 选择慢病毒稀释度 104 进行计算, 因为 GFP 阳性细胞 值在理想的 1-20% 范围内 : F = 4.4/100 C = 7,000 ( 转导时的细胞数 ) V = 0.1 (100μL 培养基 ) D = 10 4 计算公式如下滴度 = (0.044 x 7,000/0.1) 10 4 = 3.08 10 7 TU/mL 通过杀稻瘟菌素筛选进行滴定 材料 : 慢病毒 HT1080 细胞系 培养基 : Gibco DMEM, 高糖, GlutaMAX 添加剂, 丙酮酸盐及 10% FBS 5. 室温下以 2,000 rpm 离心培养板 30 分钟 6. 孵育细胞培养板过夜
10mg/mL Polybrene 试剂 (Fisher Scientific 货号 :NCO663391) 结晶紫 (Fisher Scientific 货号 :ICN15251150) 筛选培养基 : 含有 Gibco 杀稻瘟菌素 S HCl 的培养基 ( 货号 :A1113903,10μg/mL 终浓度 ) 第 1 天 ( 早上 ) 本实验方案针对 24 孔板规格 1. 将 HT1080 细胞以 42,000 个细胞 / 孔的密度 (30-50% 汇合 ) 接种于含有 500μL 培养基的 24 孔板中 2. 在培养箱中保存 4-5 个小时, 直至转导 注 : 建议重复滴定两次 3. 转导之前, 按下述方法制备的新鲜病毒稀释液 : a. 将 15mL 新鲜培养基与 12μL 的 10mg/mL Polybrene 试剂混合 ( 终浓度为 8mg/mL) 涡旋混匀 b. 制备 5 份步骤 a 中的 135μL 培养基, 标记为管 1-5 c. 将 15μL 慢病毒加入管 1 中, 吹打混匀 进行连续稀释 : 从管 1 转移 15μL 至管 2, 混匀 (1:100) 从管 2 转移 15μL 至管 3, 混匀 (1:1,000) 从管 3 转移 15μL 至管 4, 混匀 (1:10,000) 从管 4 转移 15μL 至管 5, 混匀 (1:100,000) 4. 接种后 4-5 小时, 吸弃 24 孔板中的培养基, 替换成 450μL 步骤 a 中制备的培养基 将孔编号为 1-5 以及一个对照 5. 将 50μL 的稀释液 1 转移至孔 1 中, 吹打混匀, 转导 HT1080 细胞 注 : 此步骤进一步 10 倍稀释您的病毒, 这样孔 1 现在的稀释 度为 10 2 7. 对于对照, 将 50μL 的含有 Polybrene 试剂的培养基 ( 来自步骤 a) 加至对照孔中 8. 轻轻晃动培养板混匀 9. 室温下以 2,000 rpm 离心培养板 30 分钟 10. 孵育细胞培养板过夜 杀稻瘟菌素筛选 1. 更换每个孔中的培养基, 替换为 500μL 的培养基 ( 不含 polybrene) 2. 孵育细胞 24 小时 Blasticidin Selection 1. 转导 48 小时后, 去除培养基, 用筛选培养基替换 ( 含有杀稻瘟菌素 S HCl 的培养基, 终浓度为 10μg/mL) 2. 每 2 天更换一次筛选培养基, 培养 10 天 注 : 转染之前对照孔中应无存活的细胞 第 12 天 1. 去除培养基, 用 1mL PBS 冲洗每个孔 2. 使用 10% 乙醇溶液配制 1% 结晶紫工作液, 溶于水中 3. 加入 250μL 稀释的结晶紫, 染色细胞 4. 室温下孵育培养板 20 分钟 5. 吸出并收集染液 ( 染液可重复使用或弃去 ) 6. 用水冲洗培养板数次, 以降低背景 滴度的计算 1. 要计算病毒滴度, 计数每孔中用结晶紫染色的菌落数 使用下列公式计算病毒储液的滴度 (TU/mL): TU/mL = ( 分离的菌落数 x 稀释因子 )/ 菌液体积 示例 : 1:100,000 稀释孔中染色的 35 个空斑计数 稀释的病毒体积 :0.5mL 滴定 = (35 x 10 5 )/0.5 = 7 x 10 6 TU/mL 6. 重复步骤 5, 处理剩余的制备好的稀释液 2-5, 将稀释液转移至对照编号的孔中 仅供研究使用 不得用于诊断 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. 版权所有 除特别说明外, 所有商标均为 Thermo Fisher Scientific 及其附属公司的财产 FuGene 是 Fugent LLC 的商标 JetPEI 是 Polyplus Transfection 的商标 Polybrene 是 Abbott Laboratories 的商标 Corning 是 Corning Incorporated 的商标 CO37279 0715 免费服务电话 :800 820 8982/400 820 8982 销售服务信箱 :sales-cn@thermofisher.com 技术咨询信箱 :cntechsupport@thermofisher.com www.thermofisher.com 上海办事处电话 :021-61452000 北京办事处电话 :010-84461800 广州办事处电话 :020-38975100 成都办事处电话 :028-65545388