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生物技术通报 BIOTECHNOLOGY 研究报告 BULLETIN 0年第9期 重组人 EGFL6 在 HEK9 细胞中的瞬时表达 亢中奎 张晋霞 姜浩武 王宏 宋其芳 黄建芳 邓宁 广东省分子免疫与抗体工程重点实验室 暨南大学抗体工程研究中心 广州 506 摘 要 旨在通过构建 EGFL6 的真核表达载体 在 HEK9T 细胞中进行表达 并利用 HEK9T 细胞表达的 EGFL6 条件 培养基 探讨 EGFL6 对人黑色素瘤 A75 细胞和人卵巢癌 SKOV 细胞增殖的影响 利用 PCR 方法亚克隆得到的 EGFL6 基因片 段及 EGFP 基因片段 用重叠 PCR 方法构建成 EGFP-EGFL6 融合基因片段 并分别将测序正确的 EGFP-EGFL6 融合基因片段及 EGFP 基因片段构建到真核表达载体 paav 中 表达载体质粒去内毒素纯化后 瞬时转染 HEK9T 细胞进行表达 荧光定位分析 和 Western blot 检测 EGFL6 的表达 CCK-8 试验分析含 EGFP-EGFL6 融合蛋白的 HEK9T 条件培养基对 A75 细胞和 SKOV 细 胞的增殖能力的影响 结果显示 酶切鉴定 paav-egfp-egfl6 和 paav-egfp 两个重组表达载体均构建成功 EGFP 荧光定位及 Western blot 结果均显示 EGFP-EGFL6 在 HEK9T 细胞中成功表达 增殖抑制试验结果显示 EGFL6 促进了 A75 和 SKOV 细胞的 增殖 对肿瘤细胞的促增殖率分别达到 7.79±4.05 % 和 0.5±6. % 成功地将 EGFP 应用于 EGFL6 真核表达载体的构 建与表达 结果表明人 EGFL6 促进了 A75 和 SKOV 细胞的增殖 关键词 EGFL6 瞬时表达 HEK9T 肿瘤细胞 Transient Expression of Human EGFL6 in HEK9 Cells Kang Zhongkui Zhang Jinxia Jiang Haowu Wang Hong Song Qifang Huang Jianfang Deng Ning Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering Jinan University Guangzhou 506 Abstract: To construct eukaryotic expression vector of EGFL6 and transient transform HEK9T cell to investigate EGFL6 effects on tumor cells with EGFL6 conditioned medium. EGFL6 gene fragments and enhanced green fluorescence protein EGFP gene fragments were sub-cloned by PCR and combined to construct EGFP-EGFL6 fusion protein gene fragment by overlapping PCR. The sequencing identified EGFP gene fragments and EGFP-EGFL6 gene fragments were inserted to eukaryotic expression vector paav to construct the expression vectors. Purified by endotoxin-free kit, the expression vector plasmids were transiently transformed into HEK9T cells. The expression of EGFL6 fusion protein was identified by fluorescence localization and Westernblot analysis. The effects of EGFL6 on tumor cell proliferation of A75 and SKOV were assayed by CCK-8 reagent using EGFL6 expression conditioned medium. The restriction enzyme assay showed that the expression vectors of paav-egfp and paav-egfp-egfl6 were constructed successfully. EGFP fluorescence localization and western blot assay results showed that EGFP-EGFL6 fusion protein was expressed successfully in HEK9T cells. The cell proliferation assay showed that EGFL6 enhanced tumor cell proliferation of A75 and SKOV and the cell proliferation rates reached about 7.79±4.05 % and 0.5±6. %. EGFL6 was expressed in HEK9T cells and the EGFL6 expression conditioned medium could promote tumor cell proliferation. Key words: EGFL6 Transient expression HEK9T Tumor cell Yeung 等 于 999 年首次用 DNA 分子杂交高 等 也发现了这个蛋白 命名为 MAEG MAM- and 通量筛选的方法 发现了一个新的 EGF 重复域超家 EGF-containing gene 定位于 Xp 染色体上 后续 族成员 并将其命名为表皮生长因子样结构域蛋白 的研究表明 它们分别属于同一基因的 个转录剪 6 EGF-like-domain multiple 6 EGFL6 Buchner 接体 分别编码 55 和 554 个氨基酸 故 MAEG 也 收稿日期 0-05-7 基金项目 国家 86 项目 009AA0Z 中央高校基本科研业务费专项资金项目 6 作者简介 亢中奎 男 硕士研究生 研究方向 分子免疫学 E-mail kangzhongkui@6.com 通讯作者 邓宁 男 博士 教授 研究方向 基因工程抗体 抗体药物研发及肿瘤多肽疫苗 E-mail tdengn@jnu.edu.cn

0 年第 9 期亢中奎等 : 重组人 EGFL6 在 HEK9 细胞中的瞬时表达 7 就是 EGFL6 [,] EGFL6 蛋白含有 个胞外基质蛋白结构域, 个 N 末端信号肽,5 个 EGF 重复结构域, 个整合素结合结构域 (RGD), 个 C 末端 MAM 结构域 EGFL6 同时含有 个 N 连接的糖基化位点, 个潜在的酪氨酸磷酸化位点 [,] 已有的文献表明,EGFL6 表达于早期发育的脂肪组织 [], 是 X 染色体隐性遗传病生长激素缺乏症的候选基因 [4], 并且在乳腺癌 肺癌 脑脊膜瘤 黑色素瘤和卵巢癌肿瘤组织中高表达 [5,6] EGFL6 可由脂肪细胞分泌并促进邻近血管内皮细胞的增殖 [7], 可由成骨样细胞分泌通过 ERK 信号通路促进内皮细胞迁移和血管生成 [8], 还是一种作为卵巢癌生物学标志的肿瘤血管蛋白 [5], 所以它可能会成为治疗毛发疾病 肥胖 骨疾病及癌症等疾病的新靶点, 具有广阔的研究前景 自 999 年发现以来, 关于 EGFL6 的研究报道不多, 对其结构与功能的认识还不充分, 有待人们进一步去研究发现 为了进一步开展 EGFL6 的相关研究, 本研究分别构建了 EGFL6 的表达载体 paav-egfp-egfl6 及 paav-egfp, 并实现其在 9T 细胞中的瞬时表达, 初步探讨其对人黑色素瘤 A75 细胞 (human melanoma A75 cell line) 和人卵巢癌 SKOV(human ovarian cancer cell line) 的影响, 旨在为进一步研究 EGFL6 与肿瘤的关系奠定基础 材料与方法. 材料.. 菌株 细胞和载体 E. coli 菌株 DH5α, HEK9T 细胞 A75 SKOV 细胞株,pEGFP-N 载体和表达载体 paav 均为本室保存, 克隆载体 pmd8-t simple Vector 购自 TaKaRa 公司.. 主要试剂 Blend Taq-plus DNA 聚合酶购自 TOYOBO 公司,DNA Marker T4 DNA Ligase 限制性内切酶购自 TaKaRa 公司, 质粒提取试剂盒 DNA 凝胶回收试剂盒购自 Axygen 公司, 去内毒素质粒抽提试剂盒购自 Omega 公司,Fugene HD 转染试剂购自 Roche 公司,DMEM 胎牛血清 FBS opti- MEM Ⅰ 低血清培养基 无血清培养基 (FreeStyle 9 Expression Medium,GIBCO) 购自 Invitrogen 公司, CCK-8 试剂盒购自日本株式会社, 抗 EGFL6 兔多克 隆抗体 (anti-egfl6 antibody) 氯喹和丙戊酸购自 Sigma 公司, 羊抗兔多克隆抗体购自广州鼎国生物技术公司, 动物细胞裂解液购自碧云天生物科技有限公司. 方法.. 引物的设计及基因的克隆 PCR 引物序列见表 在 Primer 中含 Not Ⅰ 酶切位点和真核表达所需的 kozak 序列,Primer 和 中含组氨酸标签序列,Primer4 和 5 中含肠激酶切位点序列,Primer6 和 7 中含 Hind Ⅲ 酶切位点, 以上引物全部由上海生工合成 以 Plexm 载体为模板, 采用 Primer 和 扩增分泌信号肽序列 (signal peptide sequence,s); 以 pegfp-n 载体为模板, 采用 Primer 和 4 扩增增强型绿色荧光蛋白 (enhanced green fluorescent protein, EGFP) 基因 ; 以前期实验室构建的 EGFL6 载体为模板, 采用 Primer 5 和 6 扩增 EGFL6 基因 表 PCR 引物序列 引物名称 引物序列 (5'-') 酶切位点 Primer GCGGCCGCCACCATGGGGA- Not I TCCTTCCC Primer ATGATGATGATGATGGTGA- His-tag GCTACGCAACCCATCAG Primer CACCATCATCATCATCATG- His-tag TGAGCAAGGGCGAGGAG Primer 4 CTTGTCGTCGTCGTCCTTGT- 肠激酶酶切位点 ACAGCTCGTCCATGCC Primer 5 CAAGGACGACGACGACAAG- 肠激酶酶切位点 CCTCTGCCCTGGAGCCTTGC Primer 6 AAGCTTATCAGTCATCCAC- Hind III AGATAAAAGGC Primer 7 AAGCTTATTACTTGTACAG- CTCGTCC Hind III Primer -6 用于 paav-egfp-egfl6 载体 ;Primer,,,7 用于 paav- EG-FP 载体.. pmd8-t 载体克隆与测序 PCR 产物经回收后, 再用重叠 PCR 的方法分别连接成 S-EGFP-EGFL6 和 S-EGFP 片段, 然后分别将 S-EGFP-EGFL6 和 S-EGFP 片段与 pmd8-t 载体在 T4 DNA 连接酶作用下于 6 连接 将连接产物转化感受态菌 DH5α, 菌液涂布于含 00 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 平皿上筛选, 挑取单克隆, 按照质粒抽提试剂盒说明书小量提取质粒, 经 Not Ⅰ 与 Hind Ⅲ 双酶切鉴定, 将获得

生物技术通报 Biotechnology Bulletin 7 的阳性克隆质粒 命名为 pmd-8t-s-egfp-egfl6 0年第9期 EGFP 质粒 paav-egfp-egfl6 质粒转染 HEK9T 和 pmd-8t-s-egfp 分别简写为 pme 和 pmg 送 细胞 转染步骤同..4 转染后用 GBICO 无血清 上海英骏公司测序 用 NCBI 在线工具 Blast 对所克 培养基培养 4 h 后收集上清 荧光和 Western blot 隆 S-EGFP-EGFL6 和 S-EGFP 基 因 序 列 与 GenBank 鉴定 EGFL6 的表达 上清经离心去除细胞碎片后 中的序列进行同源性比较分析 0. μm 滤膜过滤 -80 保存 8 9.. 真核表达载体的构建及鉴定 将载体质粒 paav 和测序正确的质粒 pme 及 pmg 分别用内切 酶 Not Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切 琼脂糖凝胶电泳 回 收 载 体 质 粒 paav S-EGFP-EGFL6 及 S-EGFP 片..7 肿瘤细胞的增殖抑制试验 以 paav-egfp 质粒转染 HEK9T 细胞产生的条件培养基为对照 组 Control 条 件 培 养 基 以 paav-egfp-egfl6 质粒转染 HEK9T 细胞产生的条件培养基为试验 段 T4 DNA 连接酶连接过夜 连接产物转化大肠杆 组 EGFL6 条件培养基 用 DMEM 完全培养基 菌 DH5α 经 00 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 平皿培养 RPMI640 完全培养基分别复苏的人黑色素瘤 A75 筛选克隆 提取质粒后 用 Not Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切 细胞和人卵巢癌 SKOV 细胞 细胞经传代至 代时 鉴定及 PCR 鉴定 鉴定正确的菌株于 7 扩增摇 分别以 4 000 个 / 孔 000 个 / 孔的数量铺于 96 孔 菌 00 ml 用 OMEGA 去内毒素质粒提取试剂盒提 板中 每孔 00 生长 4 h 用相应的基本培养基清 取重组表达载体质粒 paav-egfp-egfl6 及 paav- 洗 次 换上相应的基本培养基 饥饿 6 h 然后换 EGFP 测定其核酸浓度 备用 上倍比稀释的条件培养基 条件培养基浓度分别为..4 重组真核表达载体导入 HEK9T 细胞 接 00% 50% 5% 和.5% 培养 48 h 然后吸去 种 4 05 个 / 孔 的 HEK9T 细 胞 到 6 孔 板 中 在 培养基 加入 00 μl 的 CCK-8 与无血清培养基混合 含 0% 胎牛血清 FBS 的 DMEM 培养基 即完全 物 比例为 0 将培养板在 7 5% CO 的 培养基 中培养 于 7 5% CO 培养约 4 h 至 恒温培养箱中孵育 h 用酶标仪测 450 nm 处 OD 值 80% 汇合度 转染前将培养基换为含有 00 μmol/l 氯喹的 ml DMEM 基本培养基 取去内毒素纯化 的表达载体质粒 μg 加入到 00 μl opti-mem Ⅰ低 血清培养基中 混匀后加入 8 μl 的转染试剂 Fugene HD 涡旋混匀后低速离心 室温静置 0 min 然后 以比较试验组 EGFL6 与对照组 Control 细胞 生长活性 0 增 殖 抑 制 率 % = OD450 EGFL6 -OD450 Control /OD450 Control 00% OD450 Control 为对照组的平均 OD450 值 逐滴加入到 6 孔板中 轻轻混匀后 7 培养 6 h..8 DMEM 基 本 培 养 基 洗 涤 细 胞 两 次 后 加 入 含 有 4 数据以平均数 ± 标准差 x±s 表示 多组间 mmol/l 丙戊酸的完全培养基 7 5% CO 培养 48 h 后在荧光显微镜下观察转染情况 并用 photoshop CS4 图形叠加并结合细胞计数估测转染效率..5 Western blot 检 测 EGFP-EGFL6 融 合 蛋 白 的 表达 转染 HEK9T 60 h 后 收集细胞上清 用 统计学处理 增殖抑制试验重复 次 试验 - 比较用单因素 ANOVA 分析 P<0.05 表示差异有统 计学意义 统计分析采用 PASW Statistics 8 软件. 结果 基因的克隆及测序 预冷的 PBS 洗涤细胞 次 按照细胞经裂解液说明 PCR 亚克隆得到了信号肽序列 S EGFP 片段 书的方法裂解处理细胞后 同时将细胞上清和细胞 图 和 EGFL6 片段 图 通过重叠 PCR 获得 裂解上清与上样缓冲液混匀 进行 SDS-PAGE 转 了 S-EGFP 片段 图 和 S-EGFP-EGFL6 融合蛋白 PVDF 膜 5% 脱脂奶粉 7 封闭 h 一抗 兔 的 DNA 片段 图 分别成功地将 S-EGFP-EGFL6 抗 EGFL6 多克隆抗体 000 4 过夜 PBST 和 S-EGFP 连接到 pmd8-t 克隆载体上构建成了克 洗涤 二抗 羊抗兔多克隆抗体 4 000 7 隆载体 pte 及 ptg 所得扩增片段测序正确 孵育 h PBST 洗涤 用化学发光法显色...6 无血清条件培养基的准备 分 别 用 paav- 真核表达载体的构建 paav pte 及 ptg 载体分别经过双酶切 胶

7 亢中奎等 重组人 EGFL6 在 HEK9 细胞中的瞬时表达 0年第9期 回收 连接 转化 DH5α 感受态细菌构建的重组质 粒再经 Not Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切 PCR 鉴定及 % 琼 脂糖凝胶电泳 获得大小分别为 509 和 84 000 片 段 与 预 期 的 S-EGFP-EGFL6 和 S-EGFP 片 段 大 000 小相符 图 4 表明两个真核表达载体均构建成 M M 4 5 6 000 500 000 功 鉴定正确的质粒命名为 paav-egfp-egfl6 及 paav-egfp 000 500 M 000 M kb DNA ladder paav-egfp 质粒双酶切 M TaKaRa kb ladder paav-egfp-egfl6 质 粒 paav-egfp-egfl6 质 粒 双 酶 切 4 paav-egfp-egfl6 质粒 PCR 产物 5 signal-egfp-egfl6 片段 PCR 产物 6 000 signal-egfp-egfl6 片段 图4 750 EGFL6 重组质粒的酶切鉴定和 PCR 鉴定 500 50 00. EGFP-EGFL6蛋白在HEK9T细胞中的表达 用去内毒素质粒抽提试剂盒提取转染级质粒 将质粒转染入 HEK9T 细胞 48 h 后在荧光显微 信号肽 S 的 PCR 扩增 EGFP 的 PCR 扩增 镜 下 观 察 EGFP 的 表 达 情 况 结 果 图 5 显 示 M TaKaRa DL000 marker paav-egfp 质 粒 和 paav-egfp-egfl6 质 粒 均 成 图 信号肽 S EGFP 的 PCR 扩增 000 M 功 转 染 入 HEK9T 细 胞 图 5-B 和 图 5-E 由 图 形叠加并结合细胞计数可知转染效率 50% 左右 图 5-C 和图 5-F 将 paav-egfp 空 载 体 及 paav-egfp-egfl6 000 750 500 50 00 A B C D E F M TaKaRa DL000 marker S-EGFP 的重叠 PCR 扩增 EGFL6 的 PCR 扩增 图 S-EGFP 的重叠 PCR 扩增和 EGFL6 的 PCR 扩增 M 000 000 000 A 白光的 9T 细胞 paav-egfp B 荧光下的 9T 细胞 paav-egfp C A 和 B 的叠加图 D 白光下的 9T 细胞 paav-egfp-egfl6 E M TaKaRa kb ladder S-EGFP-EGFL6 重叠 PCR 产物 图 S-EGFP-EGFL6 重叠 PCR 荧光下的 9T 细胞 paav-egfp-egfl6 F D 和 E 的叠加图 图5 转染的 9T 细胞的绿色荧光蛋白鉴定 00

生物技术通报 Biotechnology Bulletin 74 0年第9期 重组质粒转染 HEK9T 细胞 60 h 后 收集细胞 P<0.05 图 7-B 同 时 在 条 件 培 养 基 为 50% 和 上清和细胞 细胞经裂解液裂解处理后 用上清和 5% 浓度下 试验组 EGFL6 与对照组 Control 细 胞 裂 解 上 清 进 行 SDS-PAGE 用 抗 EGFL6 抗 体 有极显著性差异 P<0.0 图 7-B 进行 Western blot 检测 同时以未转染的 HEK9T A 细 胞 和 转 染 了 paav-egfp 空 载 体 的 HEK9T 细.4. OD450 胞 为 阴 性 对 照 由 图 6 可 见 转 染 了 质 粒 paavegfp-egfl6 的 HEK9T 细胞表达了相对分子质量 Control EGFL6.0 0.8 约为 9 kd 的 EGFP-EGFL6 蛋白 且细胞培养上清 0.6 中和细胞内都有 EGFP-EGFL6 的表达 图 6 泳道 5 0.4 和 6 而未转染的 HEK9T 细胞和转染了 paav- 0. EGFP 空载体的 HEK9T 细胞的两个阴性对照组与 0 00 抗 EGFL6 抗体反应后均未见到相应的条带 图 6 泳 B 4 5 6.8.6 kd 9 5.5..0 0.8 0.6 HEK9T 细胞上清 HEK9T 细胞裂解上清 HEK9T 0.4 细胞上清 paav-egfp 4 HEK9T 细胞裂解上清 paav-egfp 0. 5 HEK9T 细胞上清 paav-egfp-egfl6 6 HEK9T 细胞裂 0 解上清 paav-egfp-egfl6 图6 Control EGFL6.4 OD450 50 ᶑԦษ ส ᓖ % 道 -4 EGFP-EGFL6 蛋白的 Western blot 鉴定 00 50 5.5 ᶑԦษ ส ᓖ % A 用不同浓度的条件培养基处理 A75 细胞 B 用不同浓度的.4 条件培养基处理 SKOV 细胞 P<0.05 P<0.0 EGFL6条件培养基促进肿瘤细胞的增殖 图7 增殖抑制试验结果显示 与对照组 Control 即加入 paav-egfp 质粒转染 HEK9T 细胞产生的 条件培养基的组 相比 试验组 EGFL6 即加入 EGFL6 条件培养基促进肿瘤细胞的增殖 讨论 paav-egfp-egfl6 质粒转染 HEK9T 细胞产生的 在真核表达 EGFL6 的前期研究中 Oberauer 等 7 条件培养基的组 显著地促进了 A75 和 SKOV 细 用昆虫杆状病毒表达系统来表达 C 端含 6 His-tag 胞的增殖 当条件培养基浓度分别为 00% 50% 的 EGFL6 Chim 等 8 为 证 明 EGFL6 为 同 源 二 聚 5% 和.5% 时 试 验 组 EGFL6 对 A75 细 胞 体 蛋 白 构 建 了 真 核 表 达 载 体 phcmv-egfl6-ha 的相对促增殖率分别为 9.96±5.0 % 0.6± 和 pcdna.b-egfl6-c-myc 为 了 更 直 观 地 进 行.7 % 7.79±4.05 % 和 6.0±.05 % EGFL6 表达的定位与追踪 我们在 EGFL6 的 N 端 并且在条件培养基浓度为 50% 和 5% 时 相对于 加入了 EGFP 荧光标签 构建 EGFP 融合蛋白进行 对照组 Control 试验组 EGFL6 显著地促进了 荧光定位表达 A75 细胞的增殖 P<0.05 图 7-A 在瞬时转染试验中 首先提取了高质量的去内 当条件培养基浓度分别为 00% 50% 5% 和 毒素质粒 酶切分析和 PCR 鉴定验证了两个重组质.5% 时 试验组 EGFL6 对 SKOV 细胞的相对 粒 paav-egfp 和 paav-egfp-egfl6 的正确性 然 促增殖率分别为 0.9±6.7 % 6.06±5.5 % 后转染 HEK9T 细胞 用荧光和 Western blot 试验 0.5±6. % 和 8.40±5.79 % 并且在 4 个 分析了 EGFL6 的表达 在荧光试验分析中 我们将 条件培养基浓度下 相对于对照组 Control 试验 含 EGFP 基因的两个重组质粒转染入 HEK9T 表达 组 EGFL6 都显著地促进了 SKOV 细胞的增殖 后 通过在荧光显微镜下观察 EGFP EGFP-EGFL6

0 年第 9 期亢中奎等 : 重组人 EGFL6 在 HEK9 细胞中的瞬时表达 75 蛋白的表达情况, 并通过同一视野下白光和荧光的 图像叠加及细胞计数估测了转染效率, 转染效率在 都在 50% 左右 在 Western blot 试验中, 为了分析 EGFL6 在 HEK9T 细胞的表达情况, 设置了两组 对照, 一组是未转染的 HEK9T 细胞, 另一组转染 了对照质粒 (paav-egfp) 的 HEK9T 细胞, 只 有转染了 paav-egfp-egfl6 质粒的 HEK9T 细胞 表达了约 9 kd 的 EGFP-EGFL6 融合蛋白, 表明成 功地构建了 paav-egfp-egfl6 真核表达载体, 并 在 HEK9T 细胞中实现了 EGFP-EGFL6 融合蛋白的 表达 为了研究 EGFL6 对 A75 和 SKOV 的增殖影 响, 在制作条件培养基时, 相同条件下用转染了质 粒 paav-egfp 的 HEK9T 表达上清为对照用于后 [8] 续的试验 Chim 等也是通过制作 COS-7 细胞的 EGFL6 条件培养基来研究 EGFL6 功能的, 并得出了 EGFL6 能够显著地增强 SVEC 血管内皮细胞的转移 [] 的结论 Ge 等利用制备的含 U06 的条件培养 基来研究了其对人 A75 黑色素瘤的侵袭作用 因无血清条件培养基中还含有占总蛋白绝大多 数的 HEK9T 分泌性蛋白, 没有一个试验方法可 以测出 EGFL6 的含量 只能采用稀释条件培养基的 方法来实现本试验内部的 EGFL6 相对定量 我们 分别将 EGFP 条件培养基和 EGFP-EGFL6 条件培养 基用无血清培养基按一定比例稀释, 设置了 4 个梯 度, 条件培养基浓度分别为 00% 50% 5% 和.5% 在含 EGFL6 的条件培养基对 A75 的增殖抑制 试验中,50% 和 5% 条件培养基下, 相对于 EGFP 对照组,EGFL6 试验组都显著促进了 A75 细胞的 增殖 (P<0.05) 虽然,EGFL6 的完全条件培养基 也促进了 A75 的增殖, 但差异性不显著 原因可 能是完全条件培养基已经培养了细胞 4 h, 其营养 消耗过多,HEK9T 代谢物浓度太高, 可能抑制了 EGFL6 发挥作用, 从而也可能造成结果没有显著性 差异 当条件培养基比例为.5% 时, 由于 EGFL6 浓度低而造成试验组与对照之间没有显著性差异 在含 EGFL6 的条件培养基对 SKOV 的增殖抑 制试验中, 与 EGFP 对照组相比, 每个条件培养基 稀释比例的 EGFL6 试验组都显著促进了 SKOV 的 增殖 (P<0.05), 并且在 50% 和 5% 条件培养基时, 有极显著差异 (P<0.0), 我们推测其它两个组没有极显著差异的原因与 A75 细胞类似 在前人的研究中, 人脂肪组织产生的 EGFL6 可促进脂肪来源的血管内皮细胞的增殖 [7], 鼠的 EGFL6 可促进猪血管内皮细胞 (SVEC) 的迁移 [8] 而在本研究表达了人的 EGFL6, 作用于肿瘤细胞株 A75 和 SKOV 细胞时发现, 人的 EGFL6 对 A75 和 SKOV 细胞有显著的促进增殖作用 但人 EGFL6 对这两株肿瘤细胞株的增殖作用的机制如何, 还有待于进一步的验证和研究 后续的试验可通过划痕修复试验和 Transwell [8] 试验继续研究 EGFL6 条件培养基对这两株肿瘤细胞的迁移作用, 也可研究 EGFL6 条件培养基对肿瘤细胞内各信号通路蛋白的影响来进一步揭示其对肿瘤细胞增殖作用的机制 4 结论成功构建了真核表达载体 paav-egfp-egfl6, 并将其转染入 HEK9T 细胞中, 成功实现了 EGFP- EGFL6 融合蛋白的瞬时表达 首次开展了人 EGFL6 对肿瘤细胞株 A75 和 SKOV 的增殖试验, 发现人 EGFL6 促进了 A75 和 SKOV 的增殖 参考文献 [] Yeung G, Mulero JJ, Berntsen RP, et al. Cloning of a novel epidermal growth factor repeat containing gene EGFL6 :Expressed in tumor and fetal tissues[j]. Genomics, 999, 6():04-07. [] Buchner G, Orfanelli U, Quaderi N, et al. Identification of a new EGF-repeat-containing gene from human xp :A candidate for developmental disorders[j]. Genomics, 000, 65():6-. [] Buchner G, Broccoli V, Bulfone A, et al. Maeg, an EGF-repeat containing gene, is a new marker associated with dermatome specification and morphogenesis of its derivatives[j]. Mech Dev, 000, 98(-):79-8. [4] 王春林. X 染色体隐性遗传性生长激素缺乏症家系候选基因定位研究 [D]. 杭州 : 浙江大学, 0. [5] Buckanovich RJ, Sasaroli D, O' Brien-Jenkins A, et al. Tumor vascular proteins as biomarkers in ovarian cancer[j]. J Clin Oncol, 007, 5(7):85-86. [6] Wang X, Gong Y, Wang D, et al. Analysis of gene expression

76 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 0 年第 9 期 profiling in meningioma :Deregulated signaling pathways associated with meningioma and EGFL6 overexpression in benign meningioma tissue and serum[j]. PLoS One, 0, 7():e5707. [7] Oberauer R, Rist W, Lenter MC, et al. EGFL6 is increasingly expressed in human obesity and promotes proliferation of adipose tissue-derived stromal vascular cells[j]. Mol Cell Biochem, 00, 4(-):57-69. [8] Chim SM, Qin A, Tickner J, et al. EGFL6 promotes endothelial cell migration and angiogenesis through the activation of extracellular signal-regulated kinase[j]. J Biol Chem, 0, 86(5): 05-046. [9] 覃晓琳, 刘朝奇, 唐国慧, 等. 小鼠可溶性 PD 的克隆, 真核表达及生物学活性检测 [J]. 生物技术通报, 0():- 5. [0] De Yulia GJ, Cárcamo JM, Borquez-Ojeda O, et al. Hydrogen peroxide generated extracellularly by receptor-ligand interaction facilitates cell signaling[j]. Proc Natl Acad Sci USA, 005, 0 (4):5044-5049. [] 郝拉娣, 于化东. 标准差与标准误 [J]. 编辑学报, 005, 7 ():6-8. [] Ge X, Fu YM, Meadows GG. U06, a mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor, inhibits the invasion of human a75 melanoma cells[j]. Cancer Letters, 00, 79():-40. ( 责任编辑马鑫 ) 欢迎订阅 04 年 中国农业科学 中 英文版 中国农业科学 中 英文版由农业部主管 中国农业科学院主办 主要刊登农牧业基础科学和应用基础科学研究论文 综述 简报等 设有作物遗传育种 种质资源 分子遗传学 ; 耕作栽培 生理生化 农业信息技术 ; 植物保护 ; 土壤肥料 节水灌溉 农业生态环境 ; 园艺 ; 贮藏 保鲜 加工 ; 畜牧 资源昆虫 ; 兽医 ; 农业经济与管理等栏目 读者对象是国内外农业科研院 ( 所 ) 农业大专院校的科研 教学及管理人员 中国农业科学 中文版为半月刊, 影响因子 总被引频次连续多年居全国农业科技期刊最前列或前列位次 中国农业科学 中文版大 6 开, 每月 6 日出版, 国内外公开发行 每期 08 页, 定价 49.50 元, 全年定价 88.00 元 国内统一刊号 :CN-8/S, 国际标准刊号 : ISSN 0578-75, 邮发代号 :-8, 国外代号 :BM4 中国农业科学 英文版(Agricultural Sciences in China),00 年创刊, 月刊,0 年更名为 农业科学学报 (Journal of Integrative Agriculture,JIA) 006 年 月起与国际著名出版集团 Elsevier 合作, 全文数据在 ScienceDirect 平台面向世界发行 009 年被 SCI 收录,0 年 JCR 影响因子为 0.57 JIA 大 6 开, 每月 0 日出版, 国内外公开发行 每期 60 页, 国内订价 80.00 元, 全年 960.00 元 国内统一刊号 :CN 0-09/S, 国际标准刊号 :ISSN 095-9, 邮发代号 :-85, 国外代号 : 59M 中国农业科学 中 英文版均可通过全国各地邮局订阅, 也可向编辑部直接订购 地址 : 北京中关村南大街 号 中国农业科学 编辑部 ; 邮编 :0008 电话 :00-809808,80680,8068,8068 ; 传真 :00-80647 网址 :www.chinaagrisci.com ;E-mail :zgnykx@caas.cn 联系人 : 林鉴非