!" 期史楠等 % 牛血清白蛋白分子表面印迹材料的制备及其大分子识别特性研究!9<= 单体的选择范围! 又能提高印迹效果 4 本研究选择牛血清白蛋白 # U1&$ 为模型蛋白! 探索研究蛋白质分子印迹新技术 4 白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白! 具有储运内源性代谢产物和外源性药物分子等重要生

第!" 期 "#!$ 年!" 月 高 % 分 % 子 % 学 % 报 & (&)*+,-./0 &1020 & 24!" 54! "#!$ 牛血清白蛋白分子表面印迹材料的制备! 及其大分子识别特性研究 史 % 楠 % 高保娇!! % 陈 % 涛 # 中北大学化学工程系 % 太原 %#;##8!$ 摘 % 要 % 通过分子设计和过程策划! 制备了高性能的牛血清白蛋白 # U1&$ 分子表面印迹材料 4 首先以甲基丙烯酰氯为试剂! 使交联聚乙烯醇 # $ 微球表面的羟基发生酯化反应! 将大量可聚合双键引入到 微球表面 4 然后以含有可聚合双键的 微球为载体! 阳离子单体丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵 # 5& $ 为功能单体! "!"[: 亚甲基双丙烯酰胺 # -U&$ 为交联剂! 牛血清白蛋白 # U1&$ 为模板分子! 在水溶液体系中! 基于主 : 客体之间的强静电相互作用! 采用接枝聚合与印迹过程同步进行的方式! 制备了高性能 U1& 分子表面印迹微球 -04 采用红外光谱 # 0/$ 和扫描电子显微镜 # 1.-$ 对产物微球进行了表征 4 研究了印迹聚合物微球 -0 对 U1& 的大分子识别特性 4 研究结果表明! 微球 -0 对 U1& 具有优良的结合亲和性和特异的识别选择性! 结合容量高达!#Y >! 对牛血红蛋白 # U_]$ 却基本不结合 " 相对于 U_]! -0 对 U1& 的选择性系数高达 9#M"4 关键词 % 牛血清白蛋白! 丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵! 表面印迹! 接枝聚合! 大分子识别 %% 分子印迹聚合物 # -0)$ 是被精心裁制的 # B:H$ 一类功能聚合物材料! 其内部分布有大量模板分子的印迹空穴! 这些空穴在尺寸大小 ( 空间结构 ( 结合位点等方面与模板分子高度地相互匹配! 使得分子印迹聚合物可在分子水平上 &! 对模板分子进行特异性识别 X;! 具有类似于抗体 : 抗原之间识别与结合的专一性! 因此被人们称为人工抗体 # C]HE$ 或人工接受器 # R$ &$!8 4 目前! -0) 已被广泛用于各类小分子物质的分离 ( 纯化 ( 浓缩富集及监测分析等领域! 而在蛋白质等生物大分子的识别 ( 分离与纯化方面! 分子印迹技术也具有潜在的 ( 重要 &9 的应用前景 X=! 生物大分子分子印迹技术的发展! 对于促进蛋白质组学 ( 重组蛋白技术及免疫学等生命科学学科的发展都具有十分重要的科学意 &!# 义 X!" 4 但是! 由于蛋白质大分子结构复杂 ( 体积庞大及构象敏感脆弱! 目前关于蛋白质的印迹! 无论在理论上还是实践上尚存在诸多困难! 所报道的成功范例还比较少! 极大地限制了蛋白质分子印迹技术的发展 &$!!; 4 因此! 蛋白质分子印迹 &!$ 是一个极具挑战性的研究领域 X!9 4 目前在蛋白质印迹方面! 明显存在几个问 &!< 题 X!= %#!$ 传统的包埋印迹法不适合蛋白质的印迹 4 在高度交联的块状聚合物网络中! 蛋白质大分子移动性差! 导致低的印迹效率与差的结合性能! 且印迹分子不易洗脱 "#"$ 溶剂的选择受限制 4 在有机溶剂中! 虽然模板蛋白分子与单体之间的氢键相互作用 # 至今! 多数蛋白质分子印迹主要靠模板分子 : 功能单体之间的氢键相互作用 $ 不受干扰! 有利于印迹过程! 但大多数蛋白质在有机溶剂中稳定性和溶解性都比较差 " 若以水为溶剂! 虽然蛋白质溶于水! 但模板蛋白 : 单体之间的氢键相互作用会遭受水分子的竞争与破坏! 不利于印迹过程 "#;$ 单体单一! 选择范围小 4 如上所述! 氢键相互作用仍是目前蛋白质印迹的主要作用力基础! 故所使用的单体多局限于丙烯酰胺与丙烯酸类单体! 印迹效果受到影响 4 针对上述问题! 作者认为! 通过科学的分子设计与策划! 可发展有效的制备策略与途径 %#!$ 设法用表面印迹法代替包埋印迹法 "#"$ 除氢键相互作用外! 策划以模板蛋白 : 功能单体之间的静电相互作用为基础! 在水介质中实施蛋白质的印迹! 这样既能扩展!"#!$:#$:"= 收稿!"#!$:#8:;# 修稿 " 山西省青年科学基金 # 基金号 "#!;#"!##=:!$ 资助项目 4!! 通讯联系人!.:>%]OF!"94> H%!#M!!<<< O4C!###:;;#$M"#!$4!$!;=!9<Y

!" 期史楠等 % 牛血清白蛋白分子表面印迹材料的制备及其大分子识别特性研究!9<= 单体的选择范围! 又能提高印迹效果 4 本研究选择牛血清白蛋白 # U1&$ 为模型蛋白! 探索研究蛋白质分子印迹新技术 4 白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白! 具有储运内源性代谢产物和外源性药物分子等重要生理功能! 参与许多重要的生命过程 4U1& 的等电点 R0 $M<! 在中性水溶液中! 白蛋白为负离子! 每分子可以带有 "## 个以上负电荷 4 鉴于白蛋白的上述物理化学特性! 通过分子设计! 本课题组构思选用阳离子单体丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵 # 5& $ 为功能单体! 在充分研究水介质中主 : 客体之间的强静电相互作用的基础上 &"#! 采用表面印迹方法! 成功实施了 U1& 分子的表面印迹! 制备了 U1& 分子表面印迹材料! 相对于对比蛋白牛血红蛋白 # U_]$! 该表面印迹材料对 U1& 的选择性系数高达 9#M"4 本文的研究结果为发展蛋白质分子印迹技术提供了新的分子设计思路! 在蛋白质分离与纯化领域将具有积极的参考价值 4!" 实验部分!#!" 试剂与仪器聚乙烯醇 # )c&! 聚合度为 ""##! 山西三维化工有限公司 $! 试剂级 " 甲基丙烯酰氯 # -&! 山东淄博沃德化工科技有限公司 $! 分析纯 " 丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵 # 5&! 上海广创景进出口有限公司 $! 分析纯 " 过硫酸铵 # 天津市大茂化学试剂 $! 分析纯 ""!"s: 亚甲基双丙烯酰胺 # -U&! 上海源叶生物科技有限公司 $! 分析纯 " 牛血清白蛋白 # U1&! 分装试剂! 1> 公司 $ " 牛血红蛋白 # U_]! 分装试剂! 1> 公司 $ " 溶菌酶 # +i-! 分装试剂!1> 公司 $ " 其它所用试剂均为市售分析纯试剂 4!<## 型傅立叶红外光谱仪 # [(0/! 美国 )GC:.> 公司 $ "$;Y c) 型扫描电子显微镜 # 1.-! 英国 +.* 公司 $ "(_i:=" 气浴恒温振荡器 # 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 $ " ac: "9#" 型紫外 可见分光光度计 # 上海尤尼柯公司 $ "1(&$$= 型热重分析仪 # 德国耐驰公司 $! 空气气氛! 升温速度为!# f>c4!#$" 牛血清白蛋白分子表面印迹材料的制备与表征!M"M!% 改性微球 -&: 的制备采用反相悬浮体系制备交联聚乙烯醇微球 # $ &"! 4 将 " 交联微球浸泡于 $# >+ 的丙酮溶液中使之充分溶胀! 再加入 " >+ 的 -& 及少量缚酸剂碳酸钠!$# T 恒温反应 9 K! 制得改性微球 -&:! 采用溴化钾 : 溴酸钾法 检测微球表面的双键含量! 得其双键含量为!MY >>4!M"M"%U1& 分子表面印迹材料的制备 将 ;M! 模板分子 U1& 溶解于 =8 >+R_ <M$ 的磷酸盐缓冲液中! 加入 8 >+ 单体 5&! 使 它们相互作用一段时间后! 将溶液移入装有回流 冷凝管 ( 搅拌器与温度计的四口烧瓶中 " 加入! 改性微球 -&:! 浸泡!" K! 再加入 #M!9 交 联剂 -U&! 通氮气 ;# >C! 排除体系中的空气 " 将 体系升温至 ;8 T! 在氮气保护并在搅拌条件下 加入 #M#8Y 过硫酸铵和 #M#"= 亚硫酸氢钠! 使 表面接枝交联反应进行!" K" 反应结束后! 将微 球滤出! 用氯化钠溶液充分洗脱! 直至在洗脱液中 检测不到 U1& 分子为止! 然后用蒸馏水反复洗 涤! 真空干燥即得印迹微球 -04!M"M;%U1& 分子表面印迹材料的表征 采用 fu 压片法测定印迹微球 -0 的红外光谱! 证实其化学结构 " 使用扫描电 子显微镜 # 1.-$! 观察印迹前后 微球的形 貌变化 4!#." 考察印迹微球 +*%(% /M/%X 对 0: 的结合特性!M;M!% 测定等温结合性能分别采用静态与动态两种方法! 测定印迹微 球 -0 对模板分子 U1& 的结合性 能 4 首先测定 -0 对 U1& 的结合动力学行为! 确定结合达到平衡的时间为!# K! 在 此基础上测定结合性能 4 静态法是在! X;8!>>+ 范围内! 用磷酸 盐缓冲溶液 # R_ <M$$ 配制浓度系列变化的 U1& 溶液! 将 "# >+ 浓度不同的 U1& 溶液分别置于若 干个 8# >+ 的具塞锥形瓶中! 加入准确称取的质 量为 #M#; 的印迹微球 -0! 于 "8 T 恒温振荡!# K! 离心分离! 用紫外分光光度 计法 # + "Y# C>$ 测得上清液中 U1& 的浓度! 采 用 #!$ 式计算 U1& 的平衡结合量! 绘制等温结合 线 4 X G R# 0 # I0 % $ 4 U!### #!$ 式中! X #!>$ 为平衡结合量 " R# >+$ 为溶液 体积 " 0 # #!>+$ 为 U1& 溶液的初始浓度 " 0

!9Y# 高 %% 分 %% 子 %% 学 %% 报 "#!$ 年 #!>>+$ 为 U1& 的平衡浓度 "4# $ 为印迹微 球的质量 4 依同样的方法测定印迹微球对 +i- 和 U_] 对比蛋白的等温结合线! 对比蛋白的浓度也采用分光光度法测定 # U_]%+ $#8 C>$ 4 动态法是在室温条件下将!M#<!; 的印迹 微球 -0 装在内径为!# >> 的玻 璃管内! 使填充柱的床体积 # ]H ^I>! Uc$ 为 " >+4 将浓度为 ;"M#!>>+ 的 U1& 溶液以 8 UcK 的流速逆流通过填充柱! 以! Uc 的间隔收 集流出液! 测定流出液中 U1& 的浓度! 绘制动态结合曲线! 并利用流出液的浓度与床体积数! 计算 印迹微球对 U1& 的泄漏结合量与饱和结合量 4 采用同法! 测定印迹微球 -0 对 U_] 的动态结合曲线 4!M;M"% 结合竞争性实验用磷酸盐缓冲溶液 # R_ <M$ $ 配制浓度均 为!9M#!>>+U1& 和 U_] 的二元混合液! 取 "# >+ 混合溶液于具塞锥形瓶中! 加入准确称量 的质量约为 #M#; 的印迹微球! 在 "8 T 恒温振 荡器中振荡!# K 使结合达到平衡! 离心分离! 分 光光度法测定上清液中 U1& 和 U_] 的平衡浓度! 仍按公式 #!$ 计算它们的平衡结合量! 按公式 #"$ 计算 " 种蛋白的分配系数 4 $ H G X 0 #"$ 式中 $ H # >+$ 是某蛋白的分配系数 " 0 #!> +$ 是上清液中该蛋白的平衡浓度 " X #!>$ 是该蛋白的平衡结合量 4 由 " 种蛋白的分配系数数据! 按照公式 #;$! 计算印迹微球 -0 对 U1& 的选择 性系数 4 <G $ H # U1&$ $ H # U_]$ #;$ 式中 < 是相对于牛血红蛋白而言! 印迹微球 -0 对 U1& 的选择性系数!< 值的大小 标志着印迹微球对 U1& 的结合选择性 &""!"; "<[ 为 相对选择性系数! 可由公式 #$$ 确定! 它代表相对于非印迹材料而言! 印迹微球 -0 对 U1& 吸附选择性的提高程度 &";!"$ 4 <[G < >R < CC #$$ 式中 < >R 是印迹微球对 U1& 的选择性系数 " < CC 是非印迹微球对 U1& 的选择性系数 4!M;M;% 洗脱性能的考察将已饱和吸附 U1& 的印迹材料填充装柱! 在室温条件下! 用浓度为 " >+ 的氯化钠水溶液作为洗脱液! 以 8 UcK 的流速逆流通过填充柱! 进行解吸实验! 以! Uc 的间隔收集洗出液! 测定洗出液中 U1& 的浓度! 绘制解吸曲线! 考察洗脱的难易程度 4 $" 结果与讨论 $#!" 制备牛血清白蛋白分子表面印迹材料的化学过程以 微球为基质! 采用接枝聚合与分子表面印迹同步进行的新型表面印迹方法! 制备 U1& 分子表面印迹材料 %#!$ 微球表面含有大量的羟基! 通过 -& 与羟基之间快速的酯化反应! 将大量可聚合双键引入微球表面! 形成键合有大量甲基丙烯酸酯 # -&$ 基团的改性微球 -&: "#"$ 在 R_ <M$ 水溶液中! 凭借强烈的静电相互作用! 众多阳离子单体 5& 自动地结合 U1& 大分子 # 每个 U1& 大分子可以携带 "## 个以上的负电荷 $ 周围 "#;$ 溶液中的引发剂过硫酸盐分解产生自由基! 这些自由基使改性微球 -&: 表面的双键与包围在 U1& 周围的单体 5& 以及与交联剂 -U& 之间发生交联共聚合! 从而在聚合物微球形成接枝交联聚合物薄层! 同时!U1& 大分子被包埋于交联网络中! 即实现了 U1& 大分子的印迹 "#$$ 洗去模板后! 在聚合物微球表面的聚合物层中留下了大量 U1& 印迹空穴! 从而制得了 U1& 大分子表面印迹材料 -0 4 制备 U1& 表面印迹材料的化学过程如示意图! 所示 4 $#$"0: 表面印迹微球 +*%(% /M:2T $ 的表征 "M"M!% 红外光谱图! 给出了交联聚乙烯醇微球 ( 改性微球 -&: 及 U1& 分子表面印迹微球 -0 的红外光谱图 4 在微球 的红外光谱中! 可以看到交联聚乙烯醇的诸特征吸收峰 %;$$$ > j! 处的峰为醇羟基 # 氢键缔合状态 $ 的伸缩振动吸收 ""=8# 与 "=!# > j! 处的峰为主链亚甲基 - _ " - 的对称与不对称伸缩振动吸收 "!;Y= > j! 处的峰为主链上次甲基 ( _ 的弯曲振动吸收 "=$< > j! 处的峰则为聚乙烯醇骨架振动吸收 4 同时还可以发现

!" 期 史楠等%牛血清白蛋白分子表面印迹材料的制备及其大分子识别特性研究!9Y! 1 K >!%1 K > Q R C K > C R R R -0 交联成球过程中 缩 醛 成 醚 反 应 后 的 诸 特 征 吸 收% j!!!8# > 处 的 峰 为 醚 键 -*- 的 特 征 吸 收"!<!= >j! 处的峰为 残 留 醛 基 * 键 # 或 )c& 结构中 残 留 乙 酰 酯 $ 的 特 征 吸 收4在 改 性 微 球

!9Y" 高%%分%%子%%学%%报 "#!$ 年 [ 4!%[(0 / R K > RK -&: 的红 外 光 谱 中!!98; >j! 处 的 峰 为 甲 基丙烯酸酯基中双键 物使得微球表面变得较为粗糙4 的伸缩 振 动 吸 收 峰! j!!<"; > 处 出 现 了 酯 羰 基 的 吸 收 峰!!!9$ >j! 处出现了酯基中 -*键的伸缩 振动 吸 收 峰4红 外光谱表明!甲基 丙 烯 酰 氯 与 微 球 表 面 的 羟 基 已 发 生 酯 化 反 应! 生 成 了 改 性 微 球 -&: 4 的 红 外 光 谱 在 印 迹 微 球 -0 >j! 处双键 中!!98; 的伸缩振动吸收峰完 >j! 处出现了 " 个新峰! 全 消失!于!9<Y 与!8<9 >j! 处的峰 是 酰 胺 羰 基 的 伸 缩 振 动 吸 其中!9<Y >j! 处的峰是 酰胺 2-_ 收峰# 酰胺 0带$!!8<9 0带$!这两个 谱 键的面内弯曲振动吸收峰# 酰胺 0 带来自于交联共聚物中 -U&单元4另外!由于大 >j! 处 酯 羰 基 与!!9$ 量 5& 的接枝聚合!!<"; >j! 处酯基中 -*键的吸收峰都得以 增强4上 述谱峰 数 据 充 分 表 明!在 U1& 存 在 下!微 球 -&: [ 4"%1.- RK RK CG H > RK CH U1&: >R C H > RK -0 表面的甲基丙烯酸酯基(溶液中单体 5& ( $#." 印 迹 微 球 +* %( % /M /%X 对 牛 血 清 白 交联 剂 -U& 三 者 之 间 发 生 了 交 联 共 聚 合! 交 联 蛋白的结合特性 共聚物接枝 在 微 球 表 面! 即 实 现 了 5& 在 微 球 "M;M!%等温结合曲线 -&: 表面的接枝交联聚合与 U1&的印迹同 和 印 迹 使用 非 印 迹 材 料 2-0 步进行!形 成 了 U1& 大 分 子 表 面 印 迹 微 粒 -0! 采 用 静 态 法 # ] K 材 料 -0 4 > K H$!分别对在 R_ <M$ 缓冲溶 液 中的 U1&( "M"M"%扫描电镜照片 溶菌酶# +i- $ 及 U_] 进 行 了 等 温 吸 附 实 验4图 图 " 分别给出了 微球# $ 与印迹 微球 ; 给出了非 迹 材 料 对 不 同 蛋 白 质 的 等 温 吸 附 线! -0 # ]$ 的扫描电镜照片4交联 微球 图 $ 则给出了印迹材料对不同蛋白质的等温结合 球 形 度 较 好!粒 径 较 均 匀!表 面 光 滑" 印 迹 线4 的 形貌与 交联微 球 微球 -0 图 ; 显 示! 非 印 迹 微 粒 材 料 2-0 相似!球 形 度 依 然 良 好!但 是 表 面 显 得 较 为 粗 糙! 对 +i- 的吸附容量很小# 约为 #M#;!> 这是由于在微球 表面发生了 5& 和 -U& $!这是由微粒材 料 表 面 的 电 性 能 和 蛋 白 质 的 荷 的接枝交联共聚 合!所 形 成 的 接 枝 交 联 聚 合 物 层 表 面 电性质所 决 定 的4微 粒 2-0

!" 期 史楠等%牛血清白蛋白分子表面印迹材料的制备及其大分子识别特性研究!9Y; 降 到 量大为 减 小!最 高 吸 附 量 由 原!M!8 >> #M#!!> ##M9< > $!或者可以说!印 迹 材料 -0 对 对 比 蛋 白 分 子 U_] 基 本 不 识别与不结合"而 对 于 U1& 分 子! 不 但 保 持 了 原 来高的结合容量!而且还有所提高!最高吸附量由 升高至!M9;!> #!#Y > $! 原!M;<!> 对 U1& 具 有 特 异 充分表明 了 -0 的识别选择性与高度的结合亲和性4其根 本 原 因 表 面 的 聚 合 物 在于!印迹 材 料 -0 薄层内!分布有 大 量 U1& 的 印 迹 孔 穴!这 些 空 穴 [ 4; % &H R C K > 2-0 在空间构型(作用位点及尺寸大 小方 面 与 U1&大 H CR C 分子 是 高 度 匹 配 的! 与 U_] 大 分 子 则 是 不 匹 ( >R I "8 T " R_ <M$ 配的4 U1&与 U_] " 种 蛋 白 质 大 分 子 虽 然 尺 寸 大 小相近 & "$!"8!且 在 中 性 溶 液 中! 两 者 均 带 有 的 负 电荷!但是!" 种 大 分 子 的 空 间 构 象 与 取 向 不 同! 多肽链的构 成 不 相 同%#! $ U1& 是 由! 条 多 肽 链 上 ; 个结构相 似 的 %: 螺旋结构域所形成的! 个 心形分子 & "9!"<!而 U_] 则是由 $ 条盘绕折叠的多 肽链形成 $ 个 亚 基!相 互 结 合 为 双 凹 面 形 的 椭 球 聚集体 & "Y!"= "# " $ " 种 蛋 白 多 肽 链 中 酸 性 氨 基 残 基的种 类( 数 量 及 位 置 分 布 是 不 相 同 的4因 此! U1&的印迹空穴几乎不 能 容 纳 和 接 受 U_]!只 能 特异 性 地 结 合 U1&! 这 就 决 定 了 印 迹 材 料 -0 [ 4 $ % U CH C K > -0 对 U1&会具有高度的识别选择性4 H CR C "M;M"%动态结合曲线 ( >R I "8 T " R_ <M$ 和 分别 使 用 非 印 迹 材 料 2-0 接枝有以阳离子单 体 单 元 5& 为 主 的 交 联 聚 合 填 充 装 柱!采 用 动 态 印迹材料 -0 物层!因 此 表 面 携 带 大 量 正 电 荷! 而 碱 性 蛋 白 I>C > K H$!分 别 对 U1& 和 U_] 进 行 了 法# +i-# R0!!M#$ 大分子在中性水溶液 中 携带 正电 吸附实验4图 8 给出了非迹材料对 " 种蛋白的 动 荷!相 互 间 的 强 静 电 排 斥 导 致 +i- 的 吸 附 容 量 态吸附曲线!图 9 则给 出了 印迹材料 对 " 种蛋白 很低4 的动态结合曲线4 但 是! 非 印 迹 微 粒 材 料 2-0 由图 8 可 知! 对 于 非 印 迹 材 料 填 充 柱! 当 对 U1&和 U_] 却均有 高 的 吸 附 容 量 # U1& 约 为 U1&溶液和 U_] 分 别 以 8 Uc K 的流速逆流通!M;<!>! U_] 约 为!M!8!> $ 4这 是 因 过时!U1& 溶 液 在!" Uc 开 始 泄 漏! 牛 血 红 蛋 白 为在中性水 溶 液 中!U1&# R0 $M< $ 和 U_] # R0 溶液在!# Uc开始泄 漏4显 然!二 者 的 泄 漏 体 积 9M8$" 种大分子都携带负电荷!在强 静电相互# 吸 相差不大!再次显 示 非 印 迹 材 料 填 充 柱 对 " 种 蛋 对 这 " 种 蛋 引$ 作用下!微粒 2-0 白质的吸附无任何选择性4 白质分子均会产 生 强 吸 附 作 用!均 有 高 的 吸 附 容 但是!从图 9 中 却 看 到! 对 于 印 迹 微 粒 -0 对 U1& 和 U_] 这 量4显 然!2-0 填 充 柱! U1& 溶 液 的 泄 露 曲 线 明 显 两种蛋白质大分子没有吸附选择性4 不同于 U_] 溶液 的 泄 露 曲 线4U_] 溶 液 的 泄 露 但 是! 图 $ 中 印 迹 微 粒 材 料 -0 体积大为降低!仅为 #M8 Uc!可以说!U_] 溶液一 对 U1& 和 U_] 的 等 温结合线 却 发生了根 旦上柱!U_] 随即 泄 露! 再 次 表 明 印 迹 微 粒 -0 对 U_] 的 结 合 容 本性的变化%-0 对 U1&是基 本 不 选 择 与 不 结 合 的"

!9Y$ "#!$ 年 高%%分%%子%%学%%报 <及相对选择性系数 <[ 4 E4C!" 5 ]I C C CH ^ E CH &H ] > $H # >+ $ 2-0 -0 U_] U1& U_] U1& ;#M$# $8M!9 #MY#Y# $YM99 <!M$Y8 < [ 9#M"" $#M8$ %%从表! 的数据可以发现%#!$ 相对于 U_]!非 对 U1&的选择性系 印 迹材料 2-0 数很低#!M$Y8$!接近于!! 这意 味着非 印 迹 材 料 [ 48%5E C > H R C I ^ 2-0 对两种蛋白质的 吸 附 能 力 很 相 近!没 有 吸 附 选 择 U1& CH U_] 性"#"$ 相 对 于 U_]! 印 迹 材 料 -0 +" [ B % 8 Uc K 0 C C C C% ;"M#!> Uc% " >+" ( >R I "# T " R_ <M$ 对 U1&的选择性系数高达 9#M""!表 明 其 对 U1& 具有很高的 识 别 选 择 性"# ; $ 印 迹 材 料 对 非 印 迹 材料的的相 对 选 择 性 系 数 为 $#M8$! 意 味 着 相 对 对 模 于非印迹 材 料! 印 迹 材 料 -0 板 分 子 U1& 的 识 别 选 择 性 得 到 极 大 的 提 高 & "<!"Y 4上述 竞 争 性 实 验 数 据 进 一 步 清 楚 地 揭 对 U1&具有特异 示!印迹材料 -0 的结合选择性4 $#1"印迹条件对印迹微球性能的影响 "M$M!%模板分子与单体物质量比值的影响 在 R_ <M$ 条件 下!固 定 U1&的 物 质 量!系 列改变单体 5& 加 入 量! 即 系 列 改 变 单 体 5& [ 49 % 5E C > ] CH C I ^ -0 与模板分 子 U1& 的 物 质 量 之 比 值! 实 施 U1& 的 U1& CH U_] 表面印迹!制备不 同 的 印 迹 微 球!对 U1& 和 U_] 0 C C C C% ;"M#!> +" [ B % 8 Uc K 进行 竞 争 吸 附! 图 < 给 出 不 同 印 迹 微 球 -0 Uc% " >+" ( >R I "# T " R_ <M$ 对 U1& 的 选 择 性 系 数 与 上 述 物 质 而 U1&溶液的泄露体积却升高到 "# Uc!再 次显 量比值之间的关系曲线4 对 U1& 具 有 特 异 示印迹微 粒 -0 的识 别 选 择 性 和 高 度 的 结 合 亲 和 性4经 计 算! U_] 的 泄 露 吸 附 量 与 饱 和 吸 附 量 仅 为 #M##" # #M!$ > $ 与 #M"!!> #!$M; >!> $! 而 U1& 的 泄 露 吸 附 量 与 饱 和 吸 附 量 则 高 达!M!=!> #88M8 > $ 与 "M#!> #!;" > $ 4上述 动 态 结 合 实 验 结 果 仍 来 自 于 印 迹 微 粒 -0 表 面 的 U1& 印 迹 孔 穴 与 模 板 蛋白是高度匹配的!与对比蛋白 U_] 则是根本不 匹配的4 "M;M; 选择性系数 U_] 的二 元 混 合 溶 液! 使 用 印 迹 配制 U1& [ 4<% C ^ E -0 IC C > 5& U1& "8 T" R_ <M$ 对 其 进 行 竞 争 吸 附 实 验4 微球 -0 表! 列出了 " 种物质的分配系数 $H (选择 性 系数 从图 < 可以看 到!随 着 单 体 5& 与 U1& 物

!" 期史楠等 % 牛血清白蛋白分子表面印迹材料的制备及其大分子识别特性研究!9Y8 质量比值的增大! 印迹材料 -0 对 U1& 选择性系数呈现先增大后平缓的变化趋势! 当 /# 5& $ V/ # U1&$ "8# V! 时! 选择性系数 < 具有最大值为 9#M""4 比值 "8#V! 可能与 U1& 多肽链上所携带的负电荷数量有关! 出现上述变化规律可能的原因如下 % 在开始阶段! 随着 5& 加入量的增多! 印迹微球表面聚合物层中的印迹空穴数目增多 # 此时可能一部分模板分子 U1& 周围形不成空穴 $! 故选择性系数 < 值增大 " 当 / # 5& $ V/# U1&$ "8# V! 时! 可能模板分子 U1& 所带的净负电荷数量与 5& 的数目相当! 相互之间的静电相互作用都得到了满足! 此时印迹空穴数目最多! 故选择性系数 G 值达最大值 " 此后再继续增多 5& 的加入量! 也不会再增加 U1& 印迹空穴的数量! 因此选择性系数不再改变! 趋于平缓 4 可见! 实施 U1& 印迹时!"8# V! 为单体 5& 与模板 U1& 适宜的物质量之比 4 "M$M"% 交联剂与单体物质量比值的影响在实施 U1& 的表面印迹时! 系列地改变单体与交联剂 -U& 的质量比! 制备不同的印迹微球! 对 U1& 和 U_] 进行竞争吸附! 图 Y 给出不同印迹微球 -0 对 U1& 的选择性系数与上述物质量比值之间的关系曲线 4 [4Y% C^E-0 IC>5& -U& "8 T" R_ <M$ %% 从图 Y 可以看出! 随着单体 5& 与交联剂 -U& 物质量比值的增大! 印迹材料 -0 对 U1& 选择性系数呈现先增大后减小的变化趋势! 当 /# 5& $ V/# -U&$ $# V! 时! 选择性系数 < 具有最大值 4 故进行 U1& 表面印迹时! 应取此比值为适宜的单体 5& 与交联剂 -U& 的投加比例 4 $#" 印迹微球材料 +*%(% /M/%X 的洗脱性能将饱和结合 U1& 的印迹微球 -0 填充装柱! 用氯化钠水溶液作为洗脱液! 逆流地通过填充柱! 进行了解吸洗脱实验 4 结果表明! 脱附曲线 # 略 $ 尖锐无拖尾!9# 个床体积内解吸率达到 =!M9<W!<# 个床体积内解吸率即可达到 =YM<$W4 表明被 U1& 大分子很容易被洗脱! 印迹材料 -0 具有良好的再生与循环使用性能 4." 结论 在水溶液中成功制备了高性能的 U1& 大分子表面印迹材料 -04 通过甲基丙烯酰氯与交联微球 表面羟基的反应! 将大量可聚合双键引入交联微球表面! 即形成改性微球 -&:! 为接枝聚合与表面印迹奠定了基础 4 在水介质中! 凭借强烈的静电相互作用! 正离子单体 5& 自动地结合在模板 U1& 大分子周围! 在过硫酸盐的引发作用下! 改性微球 -&: 表面的甲基丙烯酸酯基与单体 5& 以及与交联剂 -U& 发生交联接枝聚合! 在交联微球 表面同步地实现了阳离子单体 5& 的接枝聚合与 U1& 的分子表面印迹 4 印迹微球材料 -0 对模板 U1& 具有特异的识别选择性和高度的结合亲和性! 相对于对比蛋白 U_]! 其对 U1& 的选择性系数竟然高达 9#M"! 本研究结果为大分子的高效印迹提供了有价值的思路与参考 4 8,9,8,)/,:!% h))!bce!bc+5!+,!ec e!1i [!(C,i! KC e)4)e>!"#!#!8!%8$!< X8$"; "% *GIII U! C14(C!"#!!!Y<%<$ X<= ;% &KG>CGI!a!f-!PO^:.K>CC 2!1K[b4UCUC!"##=!"8%Y" XY< $% ckec.!1k>ce)!bog - ^C!5>CQ- &!_CCCG b.!2i> [^C4U>!"#!!!;"%;##Y X;#"# 8% ff.!ugbg-!_irf4ucuc!"##=!"$%"9!y X"9"$ 9% -[(!5I/&[!2CKe)! ICK&+!1- P[4UCUC!"#!!!"Y%"$; X"8# <% UCC[!)GE1!(IC&)[!1RKC&!U&4UCUC!"##<!""%";"" X";"Y

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