关注食品安全, 探讨食品技术 汇聚行业英才, 推动行业发展 GB4789 食品微生物学检验标准汇编 2015 年 1 月 1 日更新 此标准汇编由食品伙伴网整理完成 ( 会员 jasonishere), 欢迎下载 本汇编为 pdf 格式, pdf 书签可以方便查看每个标准, 共计 440 页 现行有效的 4789 系列食品微生物学检验标准共计 38 个, 其中 1 个为 2002 版,12 个为 2003 版,3 个为 2008 版,10 个为 2010 版,4 个为 2012 版,5 个为 2013 版,3 个为 2014 版 其中 2014 版标准生效日期为 2015 年 5 月 1 日 免责声明 : 本汇编中收集的所有标准均来源于互联网, 仅供食品同行交流学习, 请勿作他用, 本站不承担任何技术及版权问题 食品伙伴网 http://www.foodmate.net 2015 年 1 月 1 日更新
现行有效的食品微生物学检验标准标准目录 GB 4789.1-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验总则 GB 4789.2-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 GB 4789.3-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数 GB 4789.4-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 GB 4789.5-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验 GB/T 4789.6-2003 食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 GB 4789.7-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验 GB/T 4789.8-2008 食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验 GB 4789.9-2014 食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲菌检验 GB 4789.10-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验 GB 4789.11-2014 食品安全国家标准食品微生物学检验溶血性链球菌检验 GB/T 4789.12-2003 食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验 GB 4789.13-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验 GB 4789.14-2014 食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验 GB 4789.15-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数 GB/T 4789.16-2003 食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定 GB/T 4789.17-2003 食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验 GB 4789.18-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验乳与乳制品检验 GB/T 4789.19-2003 食品卫生微生物学检验蛋与蛋制品检验 GB/T 4789.20-2003 食品卫生微生物学检验水产食品检验 GB/T 4789.21-2003 食品卫生微生物学检验冷冻饮品 饮料检验 GB/T 4789.22-2003 食品卫生微生物学检验调味品检验 GB/T 4789.23-2003 食品卫生微生物学检验冷食菜 豆制品检验 GB/T 4789.24-2003 食品卫生微生物学检验糖果 糕点 蜜饯检验 GB/T 4789.25-2003 食品卫生微生物学检验酒类检验 GB 4789.26-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验 GB/T 4789.27-2008 食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验 GB 4789.28-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 GB/T 4789.29-2003 食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验 GB 4789.30-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB/T 4789.31-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌 志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬体检验方法 GB/T 4789.32-2002 食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测 GB 4789.34-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定 GB 4789.35-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验 GB/T 4789.36-2008 食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌 O157:H7/NM 检验 GB 4789.38-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数 GB/T 4789.39-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数 GB 4789.40-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验
中华人民共和国国家标准 GB 4789.1 2010 食品安全国家标准食品微生物学检验总则 National food safety standard Food microbiological examination: General guidelines 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 中华人民共和国卫生部 发布
GB 4789.1 2010 前 言 本标准代替 GB/T 4789.1-2008 食品卫生微生物学检验总则 本标准与 GB/T 4789.1-2008 相比, 主要修改如下 : 修改了标准的中英文名称 ; 修改了检验方法的选择 本标准所代替标准的历年版本发布情况为 : GB 4789.1-1984 GB 4789.1-1994 GB/T 4789. 1-2003 GB/T 4789. 1-2008 I
GB 4789.1 2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验总则 1 范围 本标准规定了食品微生物学检验基本原则和要求 本标准适用于食品微生物学检验 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本标准 凡是不注日期的引用文件, 其最新版本 ( 包括所有的修改单 ) 适用于本标准 3 实验室基本要求 3.1 环境 3.1.1 实验室环境不应影响检验结果的准确性 3.1.2 实验室的工作区域应与办公室区域明显分开 3.1.3 实验室工作面积和总体布局应能满足从事检验工作的需要, 实验室布局应采用单方向工作流程, 避免交叉污染 3.1.4 实验室内环境的温度 湿度 照度 噪声和洁净度等应符合工作要求 3.1.5 一般样品检验应在洁净区域 [ 包括超净工作台或洁净实验室 ] 进行, 洁净区域应有明显的标示 3.1.6 病原微生物分离鉴定工作应在二级生物安全实验室 (Biosafety level 2, BSL-2) 进行 3.2 人员 3.2.1 检验人员应具有相应的教育 微生物专业培训经历, 具备相应的资质, 能够理解并正确实施检验 3.2.2 检验人员应掌握实验室生物检验安全操作知识和消毒知识 3.2.3 检验人员应在检验过程中保持个人整洁与卫生, 防止人为污染样品 3.2.4 检验人员应在检验过程中遵守相关预防措施的规定, 保证自身安全 3.2.5 有颜色视觉障碍的人员不能执行涉及到辨色的实验 3.3 设备 3.3.1 实验设备应满足检验工作的需要 3.3.2 实验设备应放置于适宜的环境条件下, 便于维护 清洁 消毒与校准, 并保持整洁与良好的工作状态 3.3.3 实验设备应定期进行检查 检定 ( 加贴标识 ) 维护和保养, 以确保工作性能和操作安全 3.3.4 实验设备应有日常性监控记录和使用记录 3.4 检验用品 1
GB 4789.1 2010 3.4.1 常规检验用品主要有接种环 ( 针 ) 酒精灯 镊子 剪刀 药匙 消毒棉球 硅胶( 棉 ) 塞 微量移液器 吸管 吸球 试管 平皿 微孔板 广口瓶 量筒 玻棒及 L 形玻棒等 3.4.2 检验用品在使用前应保持清洁和 / 或无菌 常用的灭菌方法包括湿热法 干热法 化学法等 3.4.3 需要灭菌的检验用品应放置在特定容器内或用合适的材料 ( 如专用包装纸 铝箔纸等 ) 包裹或加塞, 应保证灭菌效果 3.4.4 可选择适用于微生物检验的一次性用品来替代反复使用的物品与材料 ( 如培养皿 吸管 吸头 试管 接种环等 ) 3.4.5 检验用品的储存环境应保持干燥和清洁, 已灭菌与未灭菌的用品应分开存放并明确标识 3.4.6 灭菌检验用品应记录灭菌 / 消毒的温度与持续时间 3.5 培养基和试剂 3.5.1 培养基培养基的制备和质量控制按照 GB/T 4789.28 的规定执行 3.5.2 试剂检验试剂的质量及配制应适用于相关检验 对检验结果有重要影响的关键试剂应进行适用性验证 3.6 菌株 3.6.1 应使用微生物菌种保藏专门机构或同行认可机构保存的 可溯源的标准或参考菌株 3.6.2 应对从食品 环境或人体分离 纯化 鉴定的, 未在微生物菌种保藏专门机构登记注册的原始分离菌株 ( 野生菌株 ) 进行系统 完整的菌株信息记录, 包括分离时间 来源, 表型及分子鉴定的主要特征等 3.6.3 实验室应保存能满足实验需要的标准或参考菌株, 在购入和传代保藏过程中, 应进行验证试验, 并进行文件化管理 4 样品的采集 4.1 采样原则 4.1.1 根据检验目的 食品特点 批量 检验方法 微生物的危害程度等确定采样方案 4.1.2 应采用随机原则进行采样, 确保所采集的样品具有代表性 4.1.3 采样过程遵循无菌操作程序, 防止一切可能的外来污染 4.1.4 样品在保存和运输的过程中, 应采取必要的措施防止样品中原有微生物的数量变化, 保持样品的原有状态 4.2 采样方案 4.2.1 类型采样方案分为二级和三级采样方案 二级采样方案设有 n c 和 m 值, 三级采样方案设有 n c m 和 M 值 n: 同一批次产品应采集的样品件数 ; c: 最大可允许超出 m 值的样品数 ; m: 微生物指标可接受水平的限量值 ; M: 微生物指标的最高安全限量值 注 1: 按照二级采样方案设定的指标, 在 n 个样品中, 允许有 c 个样品其相应微生物指标检验值大于 m 值 2
GB 4789.1 2010 注 2: 按照三级采样方案设定的指标, 在 n 个样品中, 允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于 m 值 ; 允许有 c 个样品其相应微生物指标检验值在 m 值和 M 值之间 ; 不允许有样品相应微生物指标检验值大于 M 值 例如 :n=5,c=2,m=100 CFU/g,M=1 000 CFU/g 含义是从一批产品中采集 5 个样品, 若 5 个样品的检验结果均小于或等于 m 值 ( 100 CFU/g), 则这种情况是允许的 ; 若 2 个样品的结果 (X) 位于 m 值和 M 值之间 (100 CFU/g <X 1 000 CFU/g), 则这种情况也是允许的 ; 若有 3 个及以上样品的检验结果位于 m 值和 M 值之间, 则这种情况是不允许的 ; 若有任一样品的检验结果大于 M 值 (>1 000 CFU/g), 则这种情况也是不允许的 4.2.2 各类食品的采样方案按相应产品标准中的规定执行 4.2.3 食源性疾病及食品安全事件中食品样品的采集 4.2.3.1 由工业化批量生产加工的食品污染导致的食源性疾病或食品安全事件, 食品样品的采集和判定原则按 4.2.1 和 4.2.2 执行 同时, 确保采集现场剩余食品样品 4.2.3.2 由餐饮单位或家庭烹调加工的食品导致的食源性疾病或食品安全事件, 食品样品的采集按 GB 14938 中卫生学检验的要求, 以满足食源性疾病或食品安全事件病因判定和病原确证的要求 4.3 各类食品的采样方法采样应遵循无菌操作程序, 采样工具和容器应无菌 干燥 防漏, 形状及大小适宜 4.3.1 即食类预包装食品取相同批次的最小零售原包装, 检验前要保持包装的完整, 避免污染 4.3.2 非即食类预包装食品原包装小于 500 g 的固态食品或小于 500 ml 的液态食品, 取相同批次的最小零售原包装 ; 大于 500 ml 的液态食品, 应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体, 使其达到均质后分别从相同批次的 n 个容器中采集 5 倍或以上检验单位的样品 ; 大于 500 g 的固态食品, 应用无菌采样器从同一包装的几个不同部位分别采取适量样品, 放入同一个无菌采样容器内, 采样总量应满足微生物指标检验的要求 4.3.3 散装食品或现场制作食品根据不同食品的种类和状态及相应检验方法中规定的检验单位, 用无菌采样器现场采集 5 倍或以上检验单位的样品, 放入无菌采样容器内, 采样总量应满足微生物指标检验的要求 4.3.4 食源性疾病及食品安全事件的食品样品采样量应满足食源性疾病诊断和食品安全事件病因判定的检验要求 4.4 采集样品的标记应对采集的样品进行及时 准确的记录和标记, 采样人应清晰填写采样单 ( 包括采样人 采样地点 时间 样品名称 来源 批号 数量 保存条件等信息 ) 4.5 采集样品的贮存和运输采样后, 应将样品在接近原有贮存温度条件下尽快送往实验室检验 运输时应保持样品完整 如不能及时运送, 应在接近原有贮存温度条件下贮存 5 样品检验 5.1 样品处理 5.1.1 实验室接到送检样品后应认真核对登记, 确保样品的相关信息完整并符合检验要求 3
GB 4789.1 2010 5.1.2 实验室应按要求尽快检验 若不能及时检验, 应采取必要的措施保持样品的原有状态, 防止样品中目标微生物因客观条件的干扰而发生变化 5.1.3 冷冻食品应在 45 以下不超过 15 min, 或 2 ~5 不超过 18 h 解冻后进行检验 5.2 检验方法的选择 5.2.1 应选择现行有效的国家标准方法 5.2.2 食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定性检验方法时, 应以常规培养方法为基准方法 5.2.3 食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定量检验方法时, 应以平板计数法为基准方法 6 生物安全与质量控制 6.1 实验室生物安全要求应符合 GB 19489 的规定 6.2 质量控制 6.2.1 实验室应定期对实验用菌株 培养基 试剂等设置阳性对照 阴性对照和空白对照 6.2.2 实验室应对重要的检验设备 ( 特别是自动化检验仪器 ) 设置仪器比对 6.2.3 实验室应定期对实验人员进行技术考核和人员比对 7 记录与报告 7.1 记录检验过程中应即时 准确地记录观察到的现象 结果和数据等信息 7.2 报告实验室应按照检验方法中规定的要求, 准确 客观地报告每一项检验结果 8 检验后样品的处理 8.1 检验结果报告后, 被检样品方能处理 检出致病菌的样品要经过无害化处理 8.2 检验结果报告后, 剩余样品或同批样品不进行微生物项目的复检 4
中华人民共和国国家标准 GB 4789.2 2010 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 National food safety standard Food microbiological examination:aerobic plate count 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 中华人民共和国卫生部 发布
GB 4789.2 2010 前 言 本标准代替 GB/T 4789.2-2008 食品卫生微生物学检验菌落总数测定 本标准与 GB/T 4789.2-2008 相比, 主要修改如下 : 修改了标准的中英文名称 ; 修改了菌落总数计算公式中的解释 ; 修改了培养基和试剂 ; 删除了第二法菌落总数 Petrifilm TM 测试片法 本标准的附录 A 是规范性附录 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 : GB 4789.2-1984 GB 4789.2-1994 GB/T 4789.2-2003 GB/T 4789.2-2008 I
GB 4789.2 2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定 1 范围 本标准规定了食品中菌落总数 (Aerobic plate count) 的测定方法 本标准适用于食品中菌落总数的测定 2 术语和定义 2.1 菌落总数 aerobic plate count 食品检样经过处理, 在一定条件下 ( 如培养基 培养温度和培养时间等 ) 培养后, 所得每 g(ml) 检样中形成的微生物菌落总数 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下 : 3.1 恒温培养箱 :36 ±1,30 ±1 3.2 冰箱 :2 ~5 3.3 恒温水浴箱 :46 ±1 3.4 天平 : 感量为 0.1 g 3.5 均质器 3.6 振荡器 3.7 无菌吸管 :1 ml( 具 0.01 ml 刻度 ) 10 ml( 具 0.1 ml 刻度 ) 或微量移液器及吸头 3.8 无菌锥形瓶 : 容量 250 ml 500 ml 3.9 无菌培养皿 : 直径 90 mm 3.10 ph 计或 ph 比色管或精密 ph 试纸 3.11 放大镜或 / 和菌落计数器 4 培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基 : 见附录 A 中 A.1 4.2 磷酸盐缓冲液 : 见附录 A 中 A.2 1
GB 4789.2 2010 4.3 无菌生理盐水 : 见附录 A 中 A.3 5 检验程序 菌落总数的检验程序见图 1 检样 25 g(ml) 样品 +225 ml 稀释液, 均质 10 倍系列稀释 选择 2 个 ~3 个适宜稀释度的样品匀液, 各取 1 ml 分别加入无菌培养皿内 每皿中加入 15 ml~20 ml 平板计数琼脂培养基, 混匀 36 ±1 48 h±2 h 培养 计数各平板菌落数 计算菌落总数 报告图 1 菌落总数的检验程序 6 操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品 : 称取 25 g 样品置盛有 225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min, 或放入盛有 225 ml 稀释液的无菌均质袋中, 用拍击式均质器拍打 1 min~2 min, 制成 1:10 的样品匀液 6.1.2 液体样品 : 以无菌吸管吸取 25 ml 样品置盛有 225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 ( 瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠 ) 中, 充分混匀, 制成 1:10 的样品匀液 2
GB 4789.2 2010 6.1.3 用 1 ml 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 ml, 沿管壁缓慢注于盛有 9 ml 稀释液的 无菌试管中 ( 注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面 ), 振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混 合均匀, 制成 1:100 的样品匀液 6.1.4 按 6.1.3 操作程序, 制备 10 倍系列稀释样品匀液 每递增稀释一次, 换用 1 次 1 ml 无菌吸管 或吸头 6.1.5 根据对样品污染状况的估计, 选择 2 个 ~3 个适宜稀释度的样品匀液 ( 液体样品可包括原液 ), 在进行 10 倍递增稀释时, 吸取 1 ml 样品匀液于无菌平皿内, 每个稀释度做两个平皿 同时, 分别吸 取 1 ml 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照 6.1.6 及时将 15 ml~20 ml 冷却至 46 的平板计数琼脂培养基 ( 可放置于 46 ±1 恒温水浴箱中 保温 ) 倾注平皿, 并转动平皿使其混合均匀 6.2 培养 6.2.1 待琼脂凝固后, 将平板翻转,36 ±1 培养 48 h±2 h 水产品 30 ±1 培养 72 h±3 h 6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时, 可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基 ( 约 4 ml), 凝固后翻转平板, 按 6.2.1 条件进行培养 6.3 菌落计数 可用肉眼观察, 必要时用放大镜或菌落计数器, 记录稀释倍数和相应的菌落数量 菌落计数以菌落形成单位 (colony-forming units,cfu) 表示 6.3.1 选取菌落数在 30 CFU~300 CFU 之间 无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数 低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数, 大于 300 CFU 的可记录为多不可计 每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数 6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时, 则不宜采用, 而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数 ; 若片状菌落不到平板的一半, 而其余一半中菌落分布又很均匀, 即可计算半个平板后乘以 2, 代表一个平板菌落数 6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时, 则将每条单链作为一个菌落计数 7 结果与报告 7.1 菌落总数的计算方法 7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内, 计算两个平板菌落数的平均值, 再将平均值乘以相应稀释倍数, 作为每 g(ml) 样品中菌落总数结果 7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时, 按公式 (1) 计算 : C (1) N = n 0.1n ) d ( + 1 2 式中 : N 样品中菌落数 ; C 平板 ( 含适宜范围菌落数的平板 ) 菌落数之和 ; n 1 第一稀释度 ( 低稀释倍数 ) 平板个数 ; n 2 第二稀释度 ( 高稀释倍数 ) 平板个数 ; d 稀释因子 ( 第一稀释度 ) 3
GB 4789.2 2010 示例 : 稀释度 1:100( 第一稀释度 ) 1:1000( 第二稀释度 ) 菌落数 (CFU) 232,244 33,35 C N = ( n + 1 0.1n 2 ) d 232 + 244 + 33 + 35 544 = [2 + (0.1 2)] 10 0.022 = = 2 上述数据按 7.2.2 数字修约后, 表示为 25000 或 2.5 10 4 24727 7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU, 则对稀释度最高的平板进行计数, 其他平板可记录为多不可计, 结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算 7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU, 则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算 7.1.5 若所有稀释度 ( 包括液体样品原液 ) 平板均无菌落生长, 则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算 7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU~300 CFU 之间, 其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时, 则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算 7.2 菌落总数的报告 7.2.1 菌落数小于 100 CFU 时, 按 四舍五入 原则修约, 以整数报告 7.2.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时, 第 3 位数字采用 四舍五入 原则修约后, 取前 2 位数字, 后面用 0 代替位数 ; 也可用 10 的指数形式来表示, 按 四舍五入 原则修约后, 采用两位有效数字 7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数, 则报告菌落蔓延 7.2.4 若空白对照上有菌落生长, 则此次检测结果无效 7.2.5 称重取样以 CFU/g 为单位报告, 体积取样以 CFU/mL 为单位报告 4
GB 4789.2 2010 附录 A ( 规范性附录 ) 培养基和试剂 A.1 平板计数琼脂 (plate count agar,pca) 培养基 A.1.1 成分胰蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 2.5 g 葡萄糖 1.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000 ml ph 7.0±0.2 A.1.2 制法将上述成分加于蒸馏水中, 煮沸溶解, 调节 ph 分装试管或锥形瓶,121 高压灭菌 15 min A.2 磷酸盐缓冲液 A.2.1 成分磷酸二氢钾 (KH 2 PO 4 ) 34.0 g 蒸馏水 500 ml ph 7.2 A.2.2 制法贮存液 : 称取 34.0 g 的磷酸二氢钾溶于 500 ml 蒸馏水中, 用大约 175 ml 的 1 mol/l 氢氧化钠溶液调节 ph, 用蒸馏水稀释至 1 000 ml 后贮存于冰箱 稀释液 : 取贮存液 1.25 ml, 用蒸馏水稀释至 1 000 ml, 分装于适宜容器中,121 高压灭菌 15 min A.3 无菌生理盐水 A.3.1 成分氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 ml A.3.2 制法称取 8.5g 氯化钠溶于 1 000 ml 蒸馏水中,121 高压灭菌 15 min 5
中华人民共和国国家标准 GB 4789.3 2010 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数 National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of coliforms 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 中华人民共和国卫生部 发布
GB 4789.3 2010 前 言 本标准代替 GB/T 4789.3-2008 食品卫生微生物学检验大肠菌群计数 本标准与 GB/T 4789.3-2008 相比, 主要修改如下 : 修改了标准的中英文名称 ; 第二法大肠菌群平板计数法 的平板菌落数的选择范围修改为 15 CFU~150 CFU ; 删除了 第三法大肠菌群 Petrifilm TM 测试片法 本标准的附录 A 附录 B 为规范性附录 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 : GB 4789.3-1984 GB 4789.3-1994 GB /T 4789.3-2003 GB /T 4789.3-2008 I
GB 4789.3 2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠菌群计数 1 范围 本标准规定了食品中大肠菌群 (Coliforms) 计数的方法 本标准适用于食品中大肠菌群的计数 2 术语和定义 2.1 大肠菌群 coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖 产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌 2.2 最可能数 most probable number,mpn 基于泊松分布的一种间接计数方法 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下 : 3.1 恒温培养箱 :36 ±1 3.2 冰箱 :2 ~5 3.3 恒温水浴箱 :46 ±1 3.4 天平 : 感量 0.1 g 3.5 均质器 3.6 振荡器 3.7 无菌吸管 :1 ml( 具 0.01 ml 刻度 ) 10 ml( 具 0.1 ml 刻度 ) 或微量移液器及吸头 3.8 无菌锥形瓶 : 容量 500 ml 3.9 无菌培养皿 : 直径 90 mm 3.10 ph 计或 ph 比色管或精密 ph 试纸 3.11 菌落计数器 4 培养基和试剂 4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨 (Lauryl Sulfate Tryptose,LST) 肉汤 : 见附录 A 中 A.1 1
GB 4789.3 2010 4.2 煌绿乳糖胆盐 (Brilliant Green Lactose Bile,BGLB) 肉汤 : 见附录 A 中 A.2 4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂 (Violet Red Bile Agar,VRBA): 见附录 A 中 A.3 4.4 磷酸盐缓冲液 : 见附录 A 中 A.4 4.5 无菌生理盐水 : 见附录 A 中 A.5 4.6 无菌 1 mol/l NaOH: 见附录 A 中 A.6 4.7 无菌 1 mol/l HCl: 见附录 A 中 A.7 2
GB 4789.3 2010 第一法 大肠菌群 MPN 计数法 5 检验程序 大肠菌群 MPN 计数的检验程序见图 1 检样 25 g(ml) 样品 +225 ml 稀释液, 均质 10 倍系列稀释 选择适宜 3 个连续稀释度的样品匀液, 接种 LST 肉汤管 36 ±1 48h±2h 不产气 产气 BGLB 肉汤 36 ±1 48 h±2 h 不产气 产气 大肠菌群阴性 大肠菌群阳性 查 MPN 表 报告结果 图 1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序 6 操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品 : 称取 25 g 样品, 放入盛有 225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min, 或放入盛有 225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中, 用拍击式均质器拍打 1 min~2 min, 制成 1:10 的样品匀液 6.1.2 液体样品 : 以无菌吸管吸取 25 ml 样品置盛有 225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 ( 瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠 ) 中, 充分混匀, 制成 1:10 的样品匀液 6.1.3 样品匀液的 ph 值应在 6.5~7.5 之间, 必要时分别用 1 mol/l NaOH 或 1 mol/l HCl 调节 3
GB 4789.3 2010 6.1.4 用 1 ml 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 ml, 沿管壁缓缓注入 9 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中 ( 注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面 ), 振摇试管或换用 1 支 1 ml 无菌吸管反复吹打, 使其混合均匀, 制成 1:100 的样品匀液 6.1.5 根据对样品污染状况的估计, 按上述操作, 依次制成十倍递增系列稀释样品匀液 每递增稀释 1 次, 换用 1 支 1 ml 无菌吸管或吸头 从制备样品匀液至样品接种完毕, 全过程不得超过 15 min 6.2 初发酵试验每个样品, 选择 3 个适宜的连续稀释度的样品匀液 ( 液体样品可以选择原液 ), 每个稀释度接种 3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨 (LST) 肉汤, 每管接种 1mL( 如接种量超过 1 ml, 则用双料 LST 肉汤 ),36 ±1 培养 24 h±2 h, 观察倒管内是否有气泡产生,24 h±2 h 产气者进行复发酵试验, 如未产气则继续培养至 48 h±2 h, 产气者进行复发酵试验 未产气者为大肠菌群阴性 6.3 复发酵试验用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物 1 环, 移种于煌绿乳糖胆盐肉汤 (BGLB) 管中,36 ±1 培养 48 h±2 h, 观察产气情况 产气者, 计为大肠菌群阳性管 6.4 大肠菌群最可能数 (MPN) 的报告按 6.3 确证的大肠菌群 LST 阳性管数, 检索 MPN 表 ( 见附录 B), 报告每 g(ml) 样品中大肠菌群的 MPN 值 第二法大肠菌群平板计数法 7 检验程序大肠菌群平板计数法的检验程序见图 2 检样 25 g(ml) 样品 +225 ml 稀释液, 均质 10 倍系列稀释 选择 2 个 ~3 个适宜稀释度的样品匀液, 接种 VRBA 平板 36 ±1 18h~24h 计数典型和可疑菌落 BGLB 肉汤 36 ±1 24h~48h 报告结果 图 2 大肠菌群平板计数法检验程序 8 操作步骤 4
GB 4789.3 2010 8.1 样品的稀释 按 6.1 进行 8.2 平板计数 8.2.1 选取 2 个 ~3 个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种 2 个无菌平皿, 每皿 1 ml 同时取 1 ml 生理盐水加入无菌平皿作空白对照 8.2.2 及时将 15 ml~20 ml 冷至 46 的结晶紫中性红胆盐琼脂 (VRBA) 约倾注于每个平皿中 小心旋转平皿, 将培养基与样液充分混匀, 待琼脂凝固后, 再加 3 ml~4 mlvrba 覆盖平板表层 翻转平板, 置于 36 ±1 培养 18 h~24 h 8.3 平板菌落数的选择 选取菌落数在 15 CFU~150 CFU 之间的平板, 分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落 典型菌落为紫红色, 菌落周围有红色的胆盐沉淀环, 菌落直径为 0.5 mm 或更大 8.4 证实试验 从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落, 分别移种于 BGLB 肉汤管内,36 ±1 培养 24 h~48 h, 观察产气情况 凡 BGLB 肉汤管产气, 即可报告为大肠菌群阳性 8.5 大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以 8.3 中计数的平板菌落数, 再乘以稀释倍数, 即为每 g (ml) 样品中大肠菌群数 例 :10-4 样品稀释液 1 ml, 在 VRBA 平板上有 100 个典型和可疑菌落, 挑取其中 10 个接种 BGLB 肉汤管, 证实有 6 个阳性管, 则该样品的大肠菌群数为 :100 6/10 10 4 /g(ml)=6.0 10 5 CFU/g(mL) 5
GB 4789.3 2010 附录 A ( 规范性附录 ) 培养基和试剂 A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨 (LST) 肉汤 A.1.1 成分胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化钠 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氢二钾 (K 2 HPO 4 ) 2.75 g 磷酸二氢钾 (KH 2 PO 4 ) 2.75 g 月桂基硫酸钠 0.1 g 蒸馏水 1000 ml ph 6.8±0.2 A.1.2 制法将上述成分溶解于蒸馏水中, 调节 ph 分装到有玻璃小倒管的试管中, 每管 10 ml 121 高压灭菌 15 min A.2 煌绿乳糖胆盐 (BGLB) 肉汤 A.2.1 成分蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛胆粉 (oxgall 或 oxbile) 溶液 200 ml 0.1% 煌绿水溶液 13.3 ml 蒸馏水 800 ml ph 7.2±0.1 A.2.2 制法将蛋白胨 乳糖溶于约 500 ml 蒸馏水中, 加入牛胆粉溶液 200 ml( 将 20.0 g 脱水牛胆粉溶于 200 ml 蒸馏水中, 调节 ph 至 7.0~7.5), 用蒸馏水稀释到 975 ml, 调节 ph, 再加入 0.1% 煌绿水溶液 13.3 ml, 用蒸馏水补足到 1 000 ml, 用棉花过滤后, 分装到有玻璃小倒管的试管中, 每管 10 ml 121 高压灭菌 15 min A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂 (VRBA) A.3.1 成分蛋白胨酵母膏乳糖氯化钠胆盐或 3 号胆盐中性红结晶紫琼脂蒸馏水 ph 7.4±0.1 7.0 g 3.0 g 10.0 g 5.0 g 1.5 g 0.03 g 0.002 g 15 g~18 g 1000 ml 6
GB 4789.3 2010 A.3.2 制法将上述成分溶于蒸馏水中, 静置几分钟, 充分搅拌, 调节 ph 煮沸 2 min, 将培养基冷却至 45 ~ 50 倾注平板 使用前临时制备, 不得超过 3 h A.4 磷酸盐缓冲液 A.4.1 成分磷酸二氢钾 (KH 2 PO 4 ) 34.0 g 蒸馏水 500 ml ph 7.2 A.4.2 制法贮存液 : 称取 34.0 g 的磷酸二氢钾溶于 500 ml 蒸馏水中, 用大约 175 ml 的 1 mol/l 氢氧化钠溶液调节 ph, 用蒸馏水稀释至 1 000 ml 后贮存于冰箱 稀释液 : 取贮存液 1.25 ml, 用蒸馏水稀释至 1 000 ml, 分装于适宜容器中,121 高压灭菌 15 min A.5 无菌生理盐水 A.5.1 成分氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 ml A.5.2 制法称取 8.5g 氯化钠溶于 1 000 ml 蒸馏水中,121 高压灭菌 15 min A.6 1 mol/l NaOH A.6.1 成分 NaOH 40.0 g 蒸馏水 1000 ml A.6.2 制法称取 40 g 氢氧化钠溶于 1 000 ml 蒸馏水中,121 高压灭菌 15 min A.7 1 mol/l HCl A.7.1 成分 HCl 90 ml 蒸馏水 1000 ml A.7.2 制法移取浓盐酸 90 ml, 用蒸馏水稀释至 1 000 ml,121 高压灭菌 15 min 7
GB 4789.3 2010 附录 B ( 规范性附录 ) 大肠菌群最可能数 (MPN) 检索表 B.1 大肠菌群最可能数 (MPN) 检索表 每 g(ml) 检样中大肠菌群最可能数 (MPN) 的检索见表 B.1 表 B.1 大肠菌群最可能数 (MPN) 检索表 阳性管数 MPN 95% 可信限 阳性管数 MPN 95% 可信限 0.10 0.01 0.001 下限 上限 0.10 0.01 0.001 下限 上限 0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42 0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 -- 注 1: 本表采用 3 个稀释度 [0.1 g(ml) 0.01 g(ml) 和 0.001 g(ml)], 每个稀释度接种 3 管 注 2: 表内所列检样量如改用 l g (ml) 0.1 g(ml) 和 0.01 g(ml) 时, 表内数字应相应降低 10 倍 ; 如改用 0.01 g(ml) 0.001 g(ml) 0.0001 g(ml) 时, 则表内数字应相应增高 10 倍, 其余类推 8
中华人民共和国国家标准 GB 4789.4 2010 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 National food safety standard Food microbiological examination: Salmonella 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 中华人民共和国卫生部 发布
GB 4789.4 2010 前 言 本标准代替 GB/T 4789.4-2008 食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验 本标准与 GB/T 4789.4-2008 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中英文名称 ; 修改了标准的范围 ; 修改了培养基和试剂 ; 修改了设备和材料 ; 修改了附录 A 本标准的附录 A 附录 B 为规范性附录 本标准所代替的历次版本发布情况为 : GB 4789.4-84 GB 4789.4-1994 GB/T 4789.4-2003 GB/T 4789.4-2008 I
GB 4789.4 2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检验 1 范围 本标准规定了食品中沙门氏菌 (Salmonella) 的检验方法 本标准适用于食品中沙门氏菌的检验 2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下 : 2.1 冰箱 :2 ~5 2.2 恒温培养箱 :36 ±1,42 ±1 2.3 均质器 2.4 振荡器 2.5 电子天平 : 感量 0.1 g 2.6 无菌锥形瓶 : 容量 500 ml,250 ml 2.7 无菌吸管 :1 ml( 具 0.01 ml 刻度 ) 10 ml( 具 0.1 ml 刻度 ) 或微量移液器及吸头 2.8 无菌培养皿 : 直径 90 mm 2.9 无菌试管 :3 mm 50 mm 10 mm 75 mm 2.10 无菌毛细管 2.11 ph 计或 ph 比色管或精密 ph 试纸 2.12 全自动微生物生化鉴定系统 3 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水 (BPW): 见附录 A 中 A.1 3.2 四硫磺酸钠煌绿 (TTB) 增菌液 : 见附录 A 中 A.2 3.3 亚硒酸盐胱氨酸 (SC) 增菌液 : 见附录 A 中 A.3 3.4 亚硫酸铋 (BS) 琼脂 : 见附录 A 中 A.4 3.5 HE 琼脂 : 见附录 A 中 A.5 3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐 (XLD) 琼脂 : 见附录 A 中 A.6 1
GB 4789.4 2010 3.7 沙门氏菌属显色培养基 3.8 三糖铁 (TSI) 琼脂 : 见附录 A 中 A.7 3.9 蛋白胨水 靛基质试剂 : 见附录 A 中 A.8 3.10 尿素琼脂 (ph 7.2): 见附录 A 中 A.9 3.11 氰化钾 (KCN) 培养基 : 见附录 A 中 A.10 3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基 : 见附录 A 中 A.11 3.13 糖发酵管 : 见附录 A 中 A.12 3.14 邻硝基酚 β-d 半乳糖苷 (ONPG) 培养基 : 见附录 A 中 A.13 3.15 半固体琼脂 : 见附录 A 中 A.14 3.16 丙二酸钠培养基 : 见附录 A 中 A.15 3.17 沙门氏菌 O 和 H 诊断血清 3.18 生化鉴定试剂盒 2
GB 4789.4 2010 4 检验程序 沙门氏菌检验程序见图 1 检样 25 g(ml) 样品 +225 mlbpw 36 ±1,8 h~18 h 1 ml+ttb 10 ml 1 ml+sc 10 ml 42 ±1,18 h~24 h 36 ±1,18 h~24 h BS XLD( 或 HE 显色培养基 ) 36 ±1,40 h~48 h 36 ±1,18 h~24 h 挑取可疑菌落 TSI, 赖氨酸,NA, 靛基质, 尿素 (ph 7.2),KCN 生化鉴定试剂盒或全 H 2 S+ 靛基质 - H 2 S+ 靛基质 + H 2 S- 靛基质 - 尿 反应结果与左 自动微生物生化鉴定 尿素 -KCN- 尿素 - KCN- 素 -KCN- 侧描述不符 系统 + 赖氨酸 + 赖氨酸 + 赖氨酸 +/- 甘露醇 + 山梨醇 + ONPG- 沙门氏菌, 血清学试验 非沙门氏菌 报告 图 1 沙门氏菌检验程序 5 操作步骤 5.1 前增菌称取 25 g(ml) 样品放入盛有 225 ml BPW 的无菌均质杯中, 以 8 000 r/min~10 000 r/min 均质 1 min~2 min, 或置于盛有 225 ml BPW 的无菌均质袋中, 用拍击式均质器拍打 1 min~2 min 若样品为液态, 不需要均质, 振荡混匀 如需测定 ph 值, 用 1 mol/ml 无菌 NaOH 或 HCl 调 ph 至 6.8±0.2 3
GB 4789.4 2010 无菌操作将样品转至 500 ml 锥形瓶中, 如使用均质袋, 可直接进行培养, 于 36 ±1 培养 8 h~ 18h 如为冷冻产品, 应在 45 以下不超过 15 min, 或 2 ~5 不超过 18 h 解冻 5.2 增菌轻轻摇动培养过的样品混合物, 移取 1 ml, 转种于 10 ml TTB 内, 于 42 ±1 培养 18 h~24 h 同时, 另取 1 ml, 转种于 10 ml SC 内, 于 36 ±1 培养 18 h~24 h 5.3 分离分别用接种环取增菌液 1 环, 划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板 ( 或 HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板 ) 于 36 ±1 分别培养 18 h~24 h (XLD 琼脂平板 HE 琼脂平板 沙门氏菌属显色培养基平板 ) 或 40 h~48 h (BS 琼脂平板 ), 观察各个平板上生长的菌落, 各个平板上的菌落特征见表 1 表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌 BS 琼脂菌落为黑色有金属光泽 棕褐色或灰色, 菌落周围培养基可呈黑色或棕色 ; 有些菌株形成灰绿色的菌落, 周围培养基不变 HE 琼脂蓝绿色或蓝色, 多数菌落中心黑色或几乎全黑色 ; 有些菌株为黄色, 中心黑色或几乎全黑色 XLD 琼脂菌落呈粉红色, 带或不带黑色中心, 有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心, 或呈现全部黑色的菌落 ; 有些菌株为黄色菌落, 带或不带黑色中心 沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定 5.4 生化试验 5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落, 接种三糖铁琼脂, 先在斜面划线, 再于底层穿刺 ; 接种针不要灭菌, 直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板, 于 36 ±1 培养 18 h~24 h, 必要时可延长至 48 h 在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内, 沙门氏菌属的反应结果见表 2 表 2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂初步判断赖氨酸脱羧酶试验培养基斜面底层产气硫化氢 K A +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌属 K A +(-) +(-) - 可疑沙门氏菌属 A A +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌属 A A +/- +/- - 非沙门氏菌 K K +/- +/- +/- 非沙门氏菌注 :K: 产碱,A: 产酸 ;+: 阳性,-: 阴性 ;+(-): 多数阳性, 少数阴性 ;+/-: 阳性或阴性 5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时, 可直接接种蛋白胨水 ( 供做靛基质试验 ) 尿素琼脂 (ph7.2) 氰化钾 (KCN) 培养基, 也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种 于 36 ±1 培养 18 h~24 h, 必要时可延长至 48 h, 按表 3 判定结果 将已挑菌落的平板储存于 2 ~5 或室温至少保留 24 h, 以备必要时复查 4
GB 4789.4 2010 表 3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号 硫化氢靛基质 ph 7.2 尿素 氰化钾 赖氨酸脱羧酶 (H 2 S) (KCN) A1 + - - - + A2 + + - - + A3 - - - - +/- 注 :+ 阳性 ;- 阴性 ;+/- 阳性或阴性 5.4.2.1 反应序号 A1: 典型反应判定为沙门氏菌属 如尿素 KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1 项异常, 按表 4 可判定为沙门氏菌 如有 2 项异常为非沙门氏菌 表 4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 ph 7.2 尿素氰化钾 (KCN) 赖氨酸脱羧酶 判定结果 - - - 甲型副伤寒沙门氏菌 ( 要求血清学鉴定结果 ) - + + 沙门氏菌 Ⅳ 或 Ⅴ( 要求符合本群生化特性 ) + - + 沙门氏菌个别变体 ( 要求血清学鉴定结果 ) 注 :+ 表示阳性 ;+ 表示阴性 5.4.2.2 反应序号 A2: 补做甘露醇和山梨醇试验, 沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳 性, 但需要结合血清学鉴定结果进行判定 5.4.2.3 反应序号 A3: 补做 ONPG ONPG 阴性为沙门氏菌, 同时赖氨酸脱羧酶阳性, 甲型副伤寒 沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性 5.4.2.4 必要时按表 5 进行沙门氏菌生化群的鉴别 表 5 沙门氏菌属各生化群的鉴别 项目 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ 卫矛醇 + + - - + - 山梨醇 + + + + + - 水杨苷 - - - + - - ONPG - - + - + - 丙二酸盐 - + + - - - KCN - - - + + - 注 :+ 表示阳性 ; - 表示阴性 5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统, 可根据 5.4.1 的初步判断结果, 从营养琼脂平板上挑取可疑菌落, 用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液, 使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定 5.5 血清学鉴定 5.5.1 抗原的准备一般采用 1.2%~1.5% 琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原 O 血清不凝集时, 将菌株接种在琼脂量较高的 ( 如 2%~3%) 培养基上再检查 ; 如果是由于 Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时, 可挑取菌苔于 1 ml 生理盐水中做成浓菌液, 于酒精灯火焰 5
GB 4789.4 2010 上煮沸后再检查 H 抗原发育不良时, 将菌株接种在 0.55%~0.65% 半固体琼脂平板的中央, 俟菌落 蔓延生长时, 在其边缘部分取菌检查 ; 或将菌株通过装有 0.3%~0.4% 半固体琼脂的小玻管 1 次 ~2 次, 自远端取菌培养后再检查 5.5.2 多价菌体抗原 (O) 鉴定在玻片上划出 2 个约 1 cm 2 cm 的区域, 挑取 1 环待测菌, 各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部, 在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体 (O) 抗血清, 在另一区域下部加入 1 滴生理盐水, 作为对照 再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液 将玻片倾斜摇动混合 1 min, 并对着黑暗背景进行观察, 任何程度的凝集现象皆为阳性反应 5.5.3 多价鞭毛抗原 (H) 鉴定同 5.5.2 5.5.4 血清学分型 ( 选做项目 ) 5.5.4.1 O 抗原的鉴定用 A~F 多价 O 血清做玻片凝集试验, 同时用生理盐水做对照 在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株, 不能分型 被 A~F 多价 O 血清凝集者, 依次用 O4;O3 O10;O7;O8;O9;O2 和 O11 因子血清做凝集试验 根据试验结果, 判定 O 群 被 O3 O10 血清凝集的菌株, 再用 O10 O15 O34 O19 单因子血清做凝集试验, 判定 E1 E2 E3 E4 各亚群, 每一个 O 抗原成分的最后确定均应根据 O 单因子血清的检查结果, 没有 O 单因子血清的要用两个 O 复合因子血清进行核对 不被 A~F 多价 O 血清凝集者, 先用 9 种多价 O 血清检查, 如有其中一种血清凝集, 则用这种血清所包括的 O 群血清逐一检查, 以确定 O 群 每种多价 O 血清所包括的 O 因子如下 : O 多价 1 A,B,C,D,E,F, 群 ( 并包括 6,14 群 ) O 多价 2 13,16,17,18,21 群 O 多价 3 28,30,35,38,39 群 O 多价 4 40,41,42,43 群 O 多价 5 44,45,47,48 群 O 多价 6 50,51,52,53 群 O 多价 7 55,56,57,58 群 O 多价 8 59,60,61,62 群 O 多价 9 63,65,66,67 群 5.5.4.2 H 抗原的鉴定属于 A~F 各 O 群的常见菌型, 依次用表 6 所述 H 因子血清检查第 1 相和第 2 相的 H 抗原 表 6 A~F 群常见菌型 H 抗原表 O 群第 1 相第 2 相 A a 无 B g,f,s 无 B i,b,d 2 C1 k,v,r,c 5,z15 C2 b,d,r 2,5 D( 不产气的 ) d 无 D( 产气的 ) g,m,p,q 无 E1 h,v 6,w,x E4 g,s,t 无 E4 i 6
GB 4789.4 2010 不常见的菌型, 先用 8 种多价 H 血清检查, 如有其中一种或两种血清凝集, 则再用这一种或两种血清所包括的各种 H 因子血清逐一检查, 以第 1 相和第 2 项的 H 抗原 8 种多价 H 血清所包括的 H 因子如下 : H 多价 1 a,b,c,d,i H 多价 2 eh,enx,enz 15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz 51 H 多价 3 k,r,y,z,z 10,lv,lw,lz 13,lz 28,lz 40 H 多价 4 1,2;1,5;1,6;1,7;z 6 H 多价 5 z 4 z 23,z 4 z 24,z 4 z 32,z 29,z 35,z 36,z 38 H 多价 6 z 39,z 41,z 42,z 44 H 多价 7 z 52,z 53,z 54,z 55 H 多价 8 z 56,z 57,z 60,z 61,z 62 每一个 H 抗原成分的最后确定均应根据 H 单因子血清的检查结果, 没有 H 单因子血清的要用两个 H 复合因子血清进行核对 检出第 1 相 H 抗原而未检出第 2 相 H 抗原的或检出第 2 相 H 抗原而未检出第 1 相 H 抗原的, 可在琼脂斜面上移种 1~2 代后再检查 如仍只检出一个相的 H 抗原, 要用位相变异的方法检查其另一个相 单相菌不必做位相变异检查 位相变异试验方法如下 : 小玻管法 : 将半固体管 ( 每管约 1 ml~2 ml) 在酒精灯上溶化并冷至 50, 取已知相的 H 因子血清 0.05 ml~0.1 ml, 加入于溶化的半固体内, 混匀后, 用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内, 俟凝固后, 用接种针挑取待检菌, 接种于一端 将小玻管平放在平皿内, 并在其旁放一团湿棉花, 以防琼脂中水分蒸发而干缩, 每天检查结果, 待另一相细菌解离后, 可以从另一端挑取细菌进行检查 培养基内血清的浓度应有适当的比例, 过高时细菌不能生长, 过低时同一相细菌的动力不能抑制 一般按原血清 1:200~1:800 的量加入 小倒管法 : 将两端开口的小玻管 ( 下端开口要留一个缺口, 不要平齐 ) 放在半固体管内, 小玻管的上端应高出于培养基的表面, 灭菌后备用 临用时在酒精灯上加热溶化, 冷至 50, 挑取因子血清 1 环, 加入小套管中的半固体内, 略加搅动, 使其混匀, 俟凝固后, 将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内, 每天检查结果, 待另一相细菌解离后, 可从套管外的半固体表面取菌检查, 或转种 1% 软琼脂斜面, 于 37 培养后再做凝集试验 简易平板法 : 将 0.35%~0.4% 半固体琼脂平板烘干表面水分, 挑取因子血清 1 环, 滴在半固体平板表面, 放置片刻, 待血清吸收到琼脂内, 在血清部位的中央点种待检菌株, 培养后, 在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查 5.5.4.3 Vi 抗原的鉴定用 Vi 因子血清检查 已知具有 Vi 抗原的菌型有 : 伤寒沙门氏菌, 丙型副伤寒沙门氏菌, 都柏林沙门氏菌 5.5.4.4 菌型的判定根据血清学分型鉴定的结果, 按照附录 B 或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型 6 结果与报告 综合以上生化试验和血清学鉴定的结果, 报告 25 g(ml) 样品中检出或未检出沙门氏菌 7
GB 4789.4 2010 附录 A ( 规范性附录 ) 培养基和试剂 A.1 缓冲蛋白胨水 (BPW) A.1.1 成分蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠 ( 含 12 个结晶水 ) 9.0 g 磷酸二氢钾 1.5 g 蒸馏水 1 000 ml ph 7.2±0.2 A.1.2 制法将各成分加入蒸馏水中, 搅混均匀, 静置约 10 min, 煮沸溶解, 调节 ph, 高压灭菌 121,15 min A.2 四硫磺酸钠煌绿 (TTB) 增菌液 A.2.1 基础液蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 氯化钠 3.0 g 碳酸钙 45.0 g 蒸馏水 1 000 ml ph 7.0±0.2 除碳酸钙外, 将各成分加入蒸馏水中, 煮沸溶解, 再加入碳酸钙, 调节 ph, 高压灭菌 121, 20 min A.2.2 硫代硫酸钠溶液 硫代硫酸钠 ( 含 5 个结晶水 ) 蒸馏水高压灭菌 121,20 min 50.0 g 加至 100 ml A.2.3 碘溶液碘片 20.0 g 碘化钾 25.0 g 蒸馏水加至 100 ml 将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中, 再投入碘片, 振摇玻瓶至碘片全部溶解为止, 然后加蒸馏水至规定的总量, 贮存于棕色瓶内, 塞紧瓶盖备用 A.2.4 0.5% 煌绿水溶液煌绿 0.5 g 蒸馏水 100 ml 溶解后, 存放暗处, 不少于 1d, 使其自然灭菌 A.2.5 牛胆盐溶液牛胆盐 10.0 g 8
GB 4789.4 2010 蒸馏水 100 ml 加热煮沸至完全溶解, 高压灭菌 121,20 min A.2.6 制法基础液 900 ml 硫代硫酸钠溶液 100 ml 碘溶液 20.0 ml 煌绿水溶液 2.0 ml 牛胆盐溶液 50.0 ml 临用前, 按上列顺序, 以无菌操作依次加入基础液中, 每加入一种成分, 均应摇匀后再加入另一种成分 A.3 亚硒酸盐胱氨酸 (SC) 增菌液 A.3.1 成分蛋白胨 5.0 g 乳糖 4.0 g 磷酸氢二钠 10.0 g 亚硒酸氢钠 4.0 g L- 胱氨酸 0.01 g 蒸馏水 1 000 ml ph 7.0±0.2 A.3.2 制法除亚硒酸氢钠和 L- 胱氨酸外, 将各成分加入蒸馏水中, 煮沸溶解, 冷至 55 以下, 以无菌操作加入亚硒酸氢钠和 1 g/l L- 胱氨酸溶液 10 ml( 称取 0.1 g L- 胱氨酸, 加 1 mol/l 氢氧化钠溶液 15 ml, 使溶解, 再加无菌蒸馏水至 100 ml 即成, 如为 DL- 胱氨酸, 用量应加倍 ) 摇匀, 调节 ph A.4 亚硫酸铋 (BS) 琼脂 A.4.1 成分蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 葡萄糖 5.0 g 硫酸亚铁 0.3 g 磷酸氢二钠 4.0 g 煌绿 0.025 g 或 5.0g/L 水溶液 5.0mL 柠檬酸铋铵 2.0 g 亚硫酸钠 6.0 g 琼脂 18.0 g~20 g 蒸馏水 1 000 ml ph 7.5±0.2 A.4.2 制法将前三种成分加入 300 ml 蒸馏水 ( 制作基础液 ), 硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入 20 ml 和 30 ml 蒸馏水中, 柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一 20 ml 和 30 ml 蒸馏水中, 琼脂加入 600 ml 蒸馏水中 然后分别搅拌均匀, 煮沸溶解 冷至 80 左右时, 先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀, 倒入基础液中, 混匀 将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀, 倒入基础液中, 再混匀 调节 ph, 随即倾入琼脂液中, 混合均匀, 冷至 50 ~55 加入煌绿溶液, 充分混匀后立即倾注平皿 9
GB 4789.4 2010 注 : 本培养基不需要高压灭菌, 在制备过程中不宜过分加热, 避免降低其选择性, 贮于室温暗处, 超过 48 h 会降低其选择性, 本培养基宜于当天制备, 第二天使用 A.5 HE 琼脂 (Hektoen Enteric Agar) A.5.1 成分蛋白胨 12.0 g 牛肉膏 3.0 g 乳糖 12.0 g 蔗糖 12.0 g 水杨素 2.0 g 胆盐 20.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 18.0 g~20.0 g 蒸馏水 1 000 ml 0.4% 溴麝香草酚蓝溶液 16.0 ml Andrade 指示剂 20.0 ml 甲液 20.0 ml 乙液 20.0 ml ph 7.5±0.2 A.5.2 制法将前面七种成分溶解于 400 ml 蒸馏水内作为基础液 ; 将琼脂加入于 600 ml 蒸馏水内 然后分别搅拌均匀, 煮沸溶解 加入甲液和乙液于基础液内, 调节 ph 再加入指示剂, 并与琼脂液合并, 待冷至 50 ~55 倾注平皿 注 :1 本培养基不需要高压灭菌, 在制备过程中不宜过分加热, 避免降低其选择性 2 甲液的配制硫代硫酸钠 34.0 g 柠檬酸铁铵 4.0 g 蒸馏水 100 ml 3 乙液的配制去氧胆酸钠 10.0 g 蒸馏水 100 ml 4 Andrade 指示剂酸性复红 0.5 g 1mol/L 氢氧化钠溶液 16.0 ml 蒸馏水 100 ml 将复红溶解于蒸馏水中, 加入氢氧化钠溶液 数小时后如复红褪色不全, 再加氢氧化钠溶液 1 ml~2 ml A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐 (XLD) 琼脂 A.6.1 成分酵母膏 3.0 g L- 赖氨酸 5.0 g 木糖 3.75 g 乳糖 7.5 g 10
GB 4789.4 2010 蔗糖 7.5 g 去氧胆酸钠 2.5 g 柠檬酸铁铵 0.8 g 硫代硫酸钠 6.8 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g 酚红 0.08 g 蒸馏水 1 000 ml ph 7.4±0.2 A.6.2 制法除酚红和琼脂外, 将其他成分加入 400 ml 蒸馏水中, 煮沸溶解, 调节 ph 另将琼脂加入 600 ml 蒸馏水中, 煮沸溶解 将上述两溶液混合均匀后, 再加入指示剂, 待冷至 50 ~55 倾注平皿 注 : 本培养基不需要高压灭菌, 在制备过程中不宜过分加热, 避免降低其选择性, 贮于室温暗处 本培养基宜于当天制备, 第二天使用 A.7 三糖铁 (TSI) 琼脂 A.7.1 成分蛋白胨 20.0 g 牛肉膏 5.0 g 乳糖 10.0 g 蔗糖 10.0 g 葡萄糖 1.0 g 硫酸亚铁铵 ( 含 6 个结晶水 ) 0.2 g 酚红 0.025 g 或 5.0 g/l 溶液 5.0 ml 氯化钠 5.0 g 硫代硫酸钠 0.2 g 琼脂 12.0 g 蒸馏水 1 000 ml ph 7.4±0.2 A.7.2 制法除酚红和琼脂外, 将其他成分加入 400 ml 蒸馏水中, 煮沸溶解, 调节 ph 另将琼脂加入 600 ml 蒸馏水中, 煮沸溶解 将上述两溶液混合均匀后, 再加入指示剂, 混匀, 分装试管, 每管约 2 ml~4 ml, 高压灭菌 121 10 min 或 115 15 min, 灭菌后置成高层斜面, 呈桔红色 A.8 蛋白胨水 靛基质试剂 A.8.1 蛋白胨水蛋白胨 ( 或胰蛋白胨 ) 20.0 g 氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1 000 ml ph 7.4±0.2 将上述成分加入蒸馏水中, 煮沸溶解, 调节 ph, 分装小试管,121 高压灭菌 15 min A.8.2 靛基质试剂 11
GB 4789.4 2010 A.8.2.1 柯凡克试剂 : 将 5 g 对二甲氨基甲醛溶解于 75 ml 戊醇中, 然后缓慢加入浓盐酸 25 ml A.8.2.2 欧 - 波试剂 : 将 1 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 ml95% 乙醇内 然后缓慢加入浓盐酸 20 ml A.8.3 试验方法挑取小量培养物接种, 在 36 ±1 培养 1 d~2 d, 必要时可培养 4 d~5 d 加入柯凡克试剂约 0.5 ml, 轻摇试管, 阳性者于试剂层呈深红色 ; 或加入欧 - 波试剂约 0.5 ml, 沿管壁流下, 覆盖于培养液表面, 阳性者于液面接触处呈玫瑰红色 注 : 蛋白胨中应含有丰富的色氯酸 每批蛋白胨买来后, 应先用已知菌种鉴定后方可使用 A.9 尿素琼脂 (ph 7.2) A.9.1 成分蛋白胨 1.0 g 氯化钠 5.0 g 葡萄糖 1.0 g 磷酸二氢钾 2.0 g 0.4% 酚红 3.0 ml 琼脂 20.0 g 蒸馏水 1 000 ml 20% 尿素溶液 100 ml ph7.2±0.2 A.9.2 制法除尿素 琼脂和酚红外, 将其他成分加入 400 ml 蒸馏水中, 煮沸溶解, 调节 ph 另将琼脂加入 600 ml 蒸馏水中, 煮沸溶解 将上述两溶液混合均匀后, 再加入指示剂后分装,121 高压灭菌 15 min 冷至 50 ~55, 加入经除菌过滤的尿素溶液 尿素的最终浓度为 2% 分装于无菌试管内, 放成斜面备用 A.9.3 试验方法挑取琼脂培养物接种, 在 36 ±1 培养 24 h, 观察结果 尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色 A.10 氰化钾 (KCN) 培养基 A.10.1 成分蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸二氢钾 0.225 g 磷酸氢二钠 5.64 g 蒸馏水 1 000 ml 0.5% 氰化钾 20.0 ml A.10.2 制法将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中, 煮沸溶解, 分装后 121 高压灭菌 15 min 放在冰箱内使其充分冷却 每 100 ml 培养基加入 0.5% 氰化钾溶液 2.0 ml( 最后浓度为 1:10 000), 分装于无菌试管内, 每管约 4 ml, 立刻用无菌橡皮塞塞紧, 放在 4 冰箱内, 至少可保存两个月 同时, 将不加氰化钾的培养基作为对照培养基, 分装试管备用 A.10.3 试验方法将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液, 挑取 1 环接种于氰化钾 (KCN) 培养基 并另 12
GB 4789.4 2010 挑取 1 环接种于对照培养基 在 36 ±1 培养 1 d~2 d, 观察结果 如有细菌生长即为阳性 ( 不抑制 ), 经 2 d 细菌不生长为阴性 ( 抑制 ) 注 : 氰化钾是剧毒药, 使用时应小心, 切勿沾染, 以免中毒 夏天分装培养基应在冰箱内进行 试验失败的主要原因是封口不严, 氰化钾逐渐分解, 产生氢氰酸气体逸出, 以致药物浓度降低, 细菌生长, 因而造成假阳性反应 试验时对每一环节都要特别注意 A.11 赖氨酸脱羧酶试验培养基 A.11.1 成分蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 蒸馏水 1 000 ml 1.6% 溴甲酚紫 - 乙醇溶液 1.0 ml L- 赖氨酸或 DL- 赖氨酸 0.5 g/100 ml 或 1.0 g/100 ml ph 6.8±0.2 A.11.2 制法除赖氨酸以外的成分加热溶解后, 分装每瓶 100 ml, 分别加入赖氨酸 L- 赖氨酸按 0.5% 加入, DL- 赖氨酸按 1% 加入 调节 ph 对照培养基不加赖氨酸 分装于无菌的小试管内, 每管 0.5 ml, 上面滴加一层液体石蜡,115 高压灭菌 10 min A.11.3 试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种, 于 36 ±1 培养 18 h~24 h, 观察结果 氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱, 培养基应呈紫色 阴性者无碱性产物, 但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色 对照管应为黄色 A.12 糖发酵管 A.12.1 成分牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 3.0 g 磷酸氢二钠 ( 含 12 个结晶水 ) 2.0 g 0.2% 溴麝香草酚蓝溶液 12.0 ml 蒸馏水 1 000 ml ph 7.4±0.2 A.12.2 制法 A.12.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后, 调节 ph 按 0.5% 加入葡萄糖, 分装于有一个倒置小管的小试管内,121 高压灭菌 15 min A.12.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后, 分装每瓶 100 ml,121 高压灭菌 15 min 另将各种糖类分别配好 10% 溶液, 同时高压灭菌 将 5 ml 糖溶液加入于 100 ml 培养基内, 以无菌操作分装小试管 注 : 蔗糖不纯, 加热后会自行水解者, 应采用过滤法除菌 A.12.3 试验方法 : 从琼脂斜面上挑取小量培养物接种, 于 36 ±1 培养, 一般 2 d~3 d 迟缓反应需观察 14 d~30 d A.13 ONPG 培养基 13
GB 4789.4 2010 A.13.1 成分邻硝基酚 β-d 半乳糖苷 (ONPG) 60.0 mg (O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) 0.01mol/L 磷酸钠缓冲液 (ph7.5) 10.0 ml 1% 蛋白胨水 (ph7.5) 30.0 ml A.13.2 制法将 ONPG 溶于缓冲液内, 加入蛋白胨水, 以过滤法除菌, 分装于无菌的小试管内, 每管 0.5 ml, 用橡皮塞塞紧 A.13.3 试验方法自琼脂斜面上挑取培养物 1 满环接种于 36 ±1 培养 1 h~3 h 和 24 h 观察结果 如果 β- 半乳糖苷酶产生, 则于 1 h~3 h 变黄色, 如无此酶则 24 h 不变色 A.14 半固体琼脂 A.14.1 成分牛肉膏 0.3 g 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 0.5 g 琼脂 0.35g~0.4 g 蒸馏水 100 ml ph 7.4±0.2 A.14.2 制法按以上成分配好, 煮沸溶解, 调节 ph 分装小试管 121 高压灭菌 15 min 直立凝固备用 注 : 供动力观察 菌种保存 H 抗原位相变异试验等用 A.15 丙二酸钠培养基 A.15.1 成分酵母浸膏 1.0 g 硫酸铵 2.0 g 磷酸氢二钾 0.6 g 磷酸二氢钾 0.4 g 氯化钠 2.0 g 丙二酸钠 3.0 g 0.2% 溴麝香草酚蓝溶液 12.0 ml 蒸馏水 1 000 ml ph 6.8±0.2 A.15.2 制法除指示剂以外的成分溶解于水, 调节 ph, 再加入指示剂, 分装试管,121 高压灭菌 15 min A.15.3 试验方法用新鲜的琼脂培养物接种, 于 36 ±1 培养 48 h, 观察结果 阳性者由绿色变为蓝色 14
GB 4789.4 2010 附录 B ( 规范性附录 ) 常见沙门氏菌抗原 B.1 常见沙门氏菌抗原 常见沙门氏菌抗原见表 B.1 表 B.1 常见沙门氏菌抗原表 H 抗原 菌名拉丁菌名 O 抗原第 1 相第 2 相 A 群 甲型副伤寒沙门氏菌 S. paratyphi A 1,2,12 a [1,5] B 群 基桑加尼沙门氏菌 S.kisangani 1,4,[5],12 a 1,2 阿雷查瓦莱塔沙门氏菌 S. arechavaleta 4,[5],12 a 1,7 马流产沙门氏菌 S. abortusequi 4,12 - e,n,x, 乙型副伤寒沙门氏菌 S. paratyphi B 1,4,[5],12 b 1,2 利密特沙门氏菌 S. limete 1,4,12,[27] b 1,5 阿邦尼沙门氏菌 S. abony 1,4,[5],12,27 b e,n,x 维也钠沙门氏菌 S. wien 1,4,12,[27] b l,w 伯里沙门氏菌 S.bury 4,12,[27] c z6 斯坦利沙门氏菌 S. stanley 1,4,[5],12,[27] d 1,2 圣保罗沙门氏菌 S. saintpaul 1,4,[5],12 e,h 1,2 里定沙门氏菌 S.reading 1,4,[5],12 e,h 1,5 彻斯特沙门氏菌 S. chester 1,4,[5],12 e,h e,n,x 德尔卑沙门氏菌 S. derby 1,4,[5],12 f,g [1,2] 阿贡纳沙门氏菌 S. agona 1,4,[5],12 f,g,s [1,2] 埃森沙门氏菌 S. essen 4,12 g,m - 加利福尼亚沙门氏菌 S. california 4,12 g,m,t [z 67 ] 金斯敦沙门氏菌 S. kingston 1,4,[5],12,[27] g,s,t [1,2] 布达佩斯沙门氏菌 S. budapest 1,4,12,[27] g,t - 鼠伤寒沙门氏菌 S. typhimurium 1,4,[5],12 i 1,2 15
GB 4789.4 2010 拉古什沙门氏菌 S. Lagos 1,4,[5],12 i 1,5 布雷登尼沙门氏菌 S.bredeney 1,4,12,[27] l,v 1,7 基尔瓦沙门氏菌 Ⅱ S.kilwa Ⅱ 4,12 l,w e,n,x 海德尔堡沙门氏菌 S.heidelberg 1,4,[15],12 r 1,2 印地安纳沙门氏菌 S.indiana 1,4,12 z 1,7 斯坦利维尔沙门氏菌 S.stanleyville 1,4,[5],12.[27] z 4,z 23 [1,2] 伊图里沙门氏菌 S.ituri 1,4,12 z 10 1,5 C1 群 奥斯陆沙门氏菌 S.oslo 6,7,14 a e,n,x 爱丁保沙门氏菌 S.edinburg 6,7, 14 b 1,5 布隆方丹沙门氏菌 Ⅱ S.bloemfonteinⅡ 6,7 b [e,n,x]:z 42 丙型副伤寒沙门氏菌 S.paratyphi C 6,7,[Vi] c 1,5 猪霍乱沙门氏菌 S.choleraesuis 6,7 c 1,5 猪伤寒沙门氏菌 S.typhisuis 6,7 c 1,5 罗米他沙门氏菌 S.lomita 6,7 e,h 1,5 布伦登卢普沙门氏菌 S.braenderup 6,7, 14 e,h e,n,z 15 里森沙门氏菌 S.rissen 6,7, 14 f,g - 蒙得维的亚沙门氏菌 S.montevideo 6,7, 14 g,m,[p],s [1,2,7] 里吉尔沙门氏菌 S.riggil 6,7 g,[t] - 奥雷宁堡沙门氏菌 S.oranieburg 6,7, 14 m,t [2,5,7] 奥里塔蔓林沙门氏菌 S.oritamerin 6,7 i 1,5 汤卜逊沙门氏菌 S.thompson 6,7, 14 k 1,5 康科德沙门氏菌 S.concord 6,7 l,v 1,2 伊鲁木沙门氏菌 S.irumu 6,7 l,v 1,5 姆卡巴沙门氏菌 S.mkamba 6,7 l,v 1,6 波恩沙门氏菌 S.bonn 6,7 l,v e,n,x 波茨坦沙门氏菌 S.potsdam 6,7, 14 l,v e,n,z 15 格但斯克沙门氏菌 S.gdansk 6,7, 14 l,v z 6 维尔肖沙门氏菌 S.virchow 6,7, 14 r 1,2 16
GB 4789.4 2010 婴儿沙门氏菌 S.infantis 6,7, 14 r 1,5 巴布亚沙门氏菌 S.papuana 6,7 r e,n,z 15 巴累利沙门氏菌 S.bareilly 6,7, 14 y 1,5 哈特福德沙门氏菌 S.hartford 6,7 y e,n,x 三河岛沙门氏菌 S.mikawasima 6,7, 14 y e,n,z 15 姆班达卡沙门氏菌 S.mbandaka 6,7, 14 z 10 e,n,z 15 田纳西沙门氏菌 S.tennessee 6,7, 14 z 29 [1,2,7] 布伦登卢普沙门氏菌 S.braenderup 6,7, 14 e,h e,n,z 15 耶路撒冷沙门氏菌 S.jerusalem 6,7, 14 z 10 l,w C2 群 习志野沙门氏菌 S.narashino 6.8 a e,n,x 名古屋沙门氏菌 S.nagoya 6,8 b 1,5 加瓦尼沙门氏菌 S.gatuni 6,8 b e,n,x 慕尼黑沙门氏菌 S.muenchen 6,8 d 1,2 蔓哈顿沙门氏菌 S.manhattan 6,8 d 1,5 纽波特沙门氏菌 S.newport 6,8,20 e,h 1,2 科特布斯沙门氏菌 S.kottbus 6,8 e,h 1,5 茨昂威沙门氏菌 S.tshiongwe 6,8 e,h e,n,z 15 林登堡沙门氏菌 S.lindenburg 6,8 i 1,2 塔科拉迪沙门氏菌 S.takoradi 6,8 i 1,5 波那雷恩沙门氏菌 S.bonariensis 6,8 i e,n,x 利齐菲尔德沙门氏菌 S.litchfield 6,8 l,v 1,2 病牛沙门氏菌 S.bovismorbificans 6,8, 20 r,[i] 1,5 查理沙门氏菌 S.chailey 6,8 z 4,z 23 e,n,z 15 C3 群 巴尔多沙门氏菌 S.bardo 8 e,h 1,2 依麦克沙门氏菌 S.emek 8,20 g,m,s - 肯塔基沙门氏菌 S.kentucky 8, 20 i z 6 17
GB 4789.4 2010 D 群 仙台沙门氏菌 S.sendai 1,9,12 a 1,5 伤寒沙门氏菌 S.typhi 9,12,[Vi] d - 塔西沙门氏菌 S.tarshyne 9,12 d 1,6 伊斯特本沙门氏菌 S.eastbourne 1,9,12 e,h 1,5 以色列沙门氏菌 S.israel 9,12 e,h e,n,z 15 肠炎沙门氏菌 S.enteritidis 1,9,12 g,m [1,7] 布利丹沙门氏菌 S.blegdam 9,12 g,m,q - 沙门氏菌 Ⅱ Salmonella Ⅱ 1,9,12 g,m,[s],t [1,5,7] 都柏林沙门氏菌 S.dublin 1,9,12,[Vi] g,p - 芙蓉沙门氏菌 S.seremban 9,12 i 1,5 巴拿马沙门氏菌 S.panama 1,9,12 l,v 1,5 戈丁根沙门氏菌 S.goettingen 9,12 l,v e,n,z 15 爪哇安纳沙门氏菌 S.javiana 1,9,12 L,z 28 1,5 鸡 - 雏沙门氏菌 S.gallinarum-pullorum 1,9,12 - - E1 群 奥凯福科沙门氏菌 S.okefoko 3,10 c z 6 瓦伊勒沙门氏菌 S.vejle 3,{10},{15} e,h 1,2 明斯特沙门氏菌 S.muenster 3,{10}{15}{15,34} e,h 1,5 鸭沙门氏菌 S.anatum 3, {10}{15}{15,34} e,h 1,6 纽兰沙门氏菌 S.newlands 3,{10},{15,34} e,h e,n,x 火鸡沙门氏菌 S.meleagridis 3, {10}{15}{15,34} e,h l,w 雷根特沙门氏菌 S.regent 3,10 f,g,[s] [1,6] 西翰普顿沙门氏菌 S.westhampton 3,{10}{15}{15,34} g,s,t - 阿姆德尔尼斯沙门氏菌 S.amounderness 3,10 i 1,5 新罗歇尔沙门氏菌 S.new-rochelle 3,10 k l,w 恩昌加沙门氏菌 S.nchanga 3,{10}{15} l,v 1,2 新斯托夫沙门氏菌 S.sinstorf 3,10 l,v 1,5 18
GB 4789.4 2010 伦敦沙门氏菌 S.london 3,{10}{15} l,v 1,6 吉韦沙门氏菌 S.give 3,{10}{15}{15,34} l,v 1,7 鲁齐齐沙门氏菌 S.ruzizi 3,10 l,v e,n,z 15 乌干达沙门氏菌 S.uganda 3,{10}{15} l,z 13 1,5 乌盖利沙门氏菌 S.ughelli 3,10 r 1,5 韦太夫雷登沙门氏菌 S.weltevreden 3,{10}{15} r z 6 克勒肯威尔沙门氏菌 S.clerkenwell 3,10 z l,w 列克星敦沙门氏菌 S.lexington 3,{10}{15}{15,34} z 10 1,5 E4 群 萨奥沙门氏菌 S.sao 1,3,19 e,h e,n,z 15 卡拉巴尔沙门氏菌 S.calabar 1,3,19 e,h l,w 山夫登堡沙门氏菌 S.senftenberg 1,3,19 g,[s],t - 斯特拉特福沙门氏菌 S.stratford 1,3,19 i 1,2 塔克松尼沙门氏菌 S.taksony 1,3,19 i z 6 索恩保沙门氏菌 S.schoeneberg 1,3,19 z e,n,z 15 F 群 昌丹斯沙门氏菌 S.chandans 11 d [e,n,x] 阿柏丁沙门氏菌 S.aberdeen 11 i 1,2 布里赫姆沙门氏菌 S.brijbhumi 11 i 1,5 威尼斯沙门氏菌 S.veneziana 11 i e,n,x 阿巴特图巴沙门氏菌 S.abaetetuba 11 k 1,5 鲁比斯劳沙门氏菌 S.rubislaw 11 r e,n,x 其他群 浦那沙门氏菌 S.poona 1,13,22 z 1,6 里特沙门氏菌 S.ried 1,13,22 z 4,z 23 [e,n,z 15 ] 密西西比沙门氏菌 S.mississippi 1,13,23 b 1,5 古巴沙门氏菌 S.cubana 1,13,23 z 29 - 苏拉特沙门氏菌 S.surat [1],6,14,[25] r,[i] e,n,z 15 19
GB 4789.4 2010 松兹瓦尔沙门氏菌 S.sundsvall [1],6,14,[25] z e,n,x 非丁伏斯沙门氏菌 S.hvittingfoss 16 b e,n,x 威斯敦沙门氏菌 S.weston 16 e,h z 6 上海沙门氏菌 S.shanghai 16 l,v 1,6 自贡沙门氏菌 S.zigong 16 l,w 1,5 巴圭达沙门氏菌 S.baguida 21 z 4,z 23 - 迪尤波尔沙门氏菌 S.dieuoppeul 28 i 1,7 卢肯瓦尔德沙门氏菌 S.luckenwalde 28 z 10 e,n,z 15 拉马特根沙门氏菌 S.ramatgan 30 k 1,5 阿德莱沙门氏菌 S.adelaide 35 f,g - 旺兹沃思沙门氏菌 S.wandsworth 39 b 1,2 雷俄格伦德沙门氏菌 S.riogrande 40 b 1,5 莱瑟沙门氏菌 S.lethe Ⅱ 41 g,t - 达莱姆沙门氏菌 S.dahlem 48 k e,n,z 15 沙门氏菌 IIIb Salmonella Ⅲb 61 l,v 1,5,7 20
中华人民共和国国家标准 GB 4789.5 2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验志贺氏菌检验 2012-05-17 发布 2012-07-17 实施 中华人民共和国卫生部 发布
GB 4789.5-2012 前 言 本标准代替 GB/T 4789.5-2003 食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验 本标准与 GB/T 4789.5-2003 相比, 主要变化如下 : 修改了标准名称 ; 修改了培养基和试剂 ; 修改了操作步骤中增菌部分和生化试验及附加生化试验部分 ; 修改了表 2; 修改了表 4 I
GB 4789.5-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验志贺氏菌检验 1 范围 本标准规定了食品中志贺氏菌 (Shigella) 的检验方法 本标准适用于食品中志贺氏菌的检验 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下 : a) 恒温培养箱 :36 ±1 ; b) 冰箱 :2 ~5 ; c) 膜过滤系统 ; d) 厌氧培养装置 :41.5 1 ; e) 电子天平 : 感量 0.1 g; f) 显微镜 :10 ~100 ; g) 均质器 ; h) 振荡器 ; i) 无菌吸管 :1 ml( 具 0.01 ml 刻度 ) 10 ml( 具 0.1 ml 刻度 ) 或微量移液器及吸头 ; j) 无菌均质杯或无菌均质袋 : 容量 500 ml; k) 无菌培养皿 : 直径 90 mm; l) ph 计或 ph 比色管或精密 ph 试纸 ; m) 全自动微生物生化鉴定系统 3 培养基和试剂 3.1 志贺氏菌增菌肉汤 - 新生霉素 : 见附录 A 中 A.1 3.2 麦康凯 (MAC) 琼脂 : 见附录 A 中 A.2 3.3 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐 (XLD) 琼脂 : 见附录 A 中 A.3 3.4 志贺氏菌显色培养基 3.5 三糖铁 (TSI) 琼脂 : 见附录 A 中 A.4 3.6 营养琼脂斜面 : 见附录 A 中 A.5 3.7 半固体琼脂 : 见附录 A 中 A.6 3.8 葡萄糖铵培养基 : 见附录 A 中 A.7 3.9 尿素琼脂 : 见附录 A 中 A.8 2
3.10 β- 半乳糖苷酶培养基 : 见附录 A 中 A.9 GB 4789.5-2012 3.11 氨基酸脱羧酶试验培养基 : 见附录 A 中 A.10 3.12 糖发酵管 : 见附录 A 中 A.11 3.13 西蒙氏柠檬酸盐培养基 : 见附录 A 中 A.12 3.14 粘液酸盐培养基 : 见附录 A 中 A. 13 3.15 蛋白胨水 靛基质试剂 : 见附录 A 中 A.14 3.16 志贺氏菌属诊断血清 3.17 生化鉴定试剂盒 4 检验程序 志贺氏菌检验程序见图 1 3
GB 4789.5-2012 检样 25 g( 或 25 ml) 样品 + 志贺氏菌增菌肉汤 225 ml 41.5 ±1, 16 h~20 h 厌氧培养 XLD MAC 或志贺氏菌显色培养基 挑取可疑菌落 36 ±1,20 h~48 h TSI, 半固体, 营养琼脂斜面 血清学分型 生化鉴定 志贺氏菌属分群及分型结果 报告 图 1 志贺氏菌检验程序 5 操作步骤 5.1 增菌以无菌操作取检样 25 g(ml), 加入装有灭菌 225 ml 志贺氏菌增菌肉汤的均质杯, 用旋转刀片式均质器以 8 000 r/min~10 000 r/min 均质 ; 或加入装有 225 ml 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中, 用拍击式均质器连续均质 1 min~2 min, 液体样品振荡混匀即可 于 41.5 ±1, 厌氧培养 16 h~20 h 5.2 分离取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于 XLD 琼脂平板和 MAC 琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上, 于 36 1 培养 20 h~24 h, 观察各个平板上生长的菌落形态 宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌 若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察, 则继续培养至 48 h 再进行观察 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表 1 4
选择性琼脂平板 MAC 琼脂 XLD 琼脂志贺氏菌显色培养基 5.3 初步生化试验 表 1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征志贺氏菌的菌落特征无色至浅粉红色, 半透明 光滑 湿润 圆形 边缘整齐或不齐粉红色至无色, 半透明 光滑 湿润 圆形 边缘整齐或不齐按照显色培养基的说明进行判定 GB 4789.5-2012 5.3.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落, 分别接种 TSI 半固体和营养琼脂斜面各一 管, 置 36 1 培养 20 h~24 h, 分别观察结果 5.3.2 凡是三糖铁琼脂中斜面产碱 底层产酸 ( 发酵葡萄糖, 不发酵乳糖, 蔗糖 ) 不产气 ( 福氏志贺氏 菌 6 型可产生少量气体 ) 不产硫化氢 半固体管中无动力的菌株, 挑取其 5.3.1 中已培养的营养琼脂斜面 上生长的菌苔, 进行生化试验和血清学分型 5.4 生化试验及附加生化试验 5.4.1 生化试验 用 5.3.1 中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔, 进行生化试验, 即 β- 半乳糖苷酶 尿素 赖氨酸脱 羧酶 鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验 除宋内氏志贺氏菌 鲍氏志贺氏菌 13 型的鸟氨酸 阳性 ; 宋内氏菌和痢疾志贺氏菌 1 型, 鲍氏志贺氏菌 13 型的 β- 半乳糖苷酶为阳性以外, 其余生化试验志贺 氏菌属的培养物均为阴性结果 另外由于福氏志贺氏菌 6 型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相 似, 必要时还需加做靛基质 甘露醇 棉子糖 甘油试验, 也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验, 应为氧 化酶阴性的革兰氏阴性杆菌 生化反应不符合的菌株, 即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集, 仍不得 判定为志贺氏菌属 志贺氏菌属生化特性见表 2 表 2 志贺氏菌属四个群的生化特征 生化反应 A 群 : 痢疾志贺氏菌 B 群 : 福氏志贺氏菌 C 群 : 鲍氏志贺氏菌 D 群 : 宋内氏志贺氏菌 ß- 半乳糖苷酶 - a - - a + 尿素 - - - - 赖氨酸脱羧酶 - - - - 鸟氨酸脱羧酶 - - - b + 水杨苷 - - - - 七叶苷 - - - - 靛基质 -/+ (+) -/+ - 甘露醇 - + c + + 棉子糖 - + - + 甘油 (+) - (+) d 注 :+ 表示阳性 ;- 表示阴性 ;-/+ 表示多数阴性 ;+/- 表示多数阳性 ;(+) 表示迟缓阳性 ;d 表示有不同生化型 a 痢疾志贺 1 型和鲍氏 13 型为阳性 b 鲍氏 13 型为鸟氨酸阳性 c 福氏 4 型和 6 型常见甘露醇阴性变种 5.4.2 附加生化实验 由于某些不活泼的大肠埃希氏菌 (anaerogenic E.coli) A-D(Alkalescens-D isparbiotypes 碱性 - 异型 ) 菌的部分生化特征与志贺氏菌相似, 并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集 ; 因此前面生化实验符合志贺 氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺 西蒙氏柠檬酸盐 粘液酸盐试验 (36 培养 24 h~48 h) 志 贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌 A-D 菌的生化特性区别见表 3 5
生化反应 表 3 志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌 A-D 菌的生化特性区别 A 群 : 痢疾 志贺氏菌 B 群 : 福氏 志贺氏菌 C 群 : 鲍氏 志贺氏菌 D 群 : 宋内氏 志贺氏菌 大肠埃希氏菌 GB 4789.5-2012 葡萄糖铵 - - - - + + 西蒙氏柠檬酸盐 - - - - d d 粘液酸盐 - - - d + d 注 1:+ 表示阳性 ;- 表示阴性 ;d 表示有不同生化型 A-D 菌 注 2: 在葡萄糖铵 西蒙氏柠檬酸盐 粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性, 而不活泼的大肠埃希氏菌 A-D( 碱 性 - 异型 ) 菌至少有一项反应为阳性 5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统, 可根据 5.3.2 的初步判断结果, 用 5.3.1 中已培 养的营养琼脂斜面上生长的菌苔, 使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定 5.5 血清学鉴定 5.5.1 抗原的准备 志贺氏菌属没有动力, 所以没有鞭毛抗原 志贺氏菌属主要有菌体 (O) 抗原 菌体 O 抗原又可分为 型和群的特异性抗原 一般采用 1.2%~1.5% 琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原 注 1: 一些志贺氏菌如果因为 K 抗原的存在而不出现凝集反应时, 可挑取菌苔于 1 ml 生理盐水做成浓菌液,100 煮 沸 15 min~60 min 去除 K 抗原后再检查 注 2:D 群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株, 与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应 与肠杆菌科不 同, 宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝 宋内氏志贺氏菌没有 K 抗原 5.5.2 凝集反应 在玻片上划出 2 个约 1cm 2cm 的区域, 挑取一环待测菌, 各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部, 在其 中一个区域下部加 1 滴抗血清, 在另一区域下部加入 1 滴生理盐水, 作为对照 再用无菌的接种环或针分 别将两个区域内的菌落研成乳状液 将玻片倾斜摇动混合 1 min, 并对着黑色背景进行观察, 如果抗血清 中出现凝结成块的颗粒, 而且生理盐水中没有发生自凝现象, 那么凝集反应为阳性 如果生理盐水中出现 凝集, 视作为自凝 这时, 应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验 如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征, 而其血清学试验为阴性的话, 则按 5.5.1 注 1 进行 试验 5.5.3 血清学分型 ( 选做项目 ) 先用四种志贺氏菌多价血清检查, 如果呈现凝集, 则再用相应各群多价血清分别试验 先用 B 群福氏 志贺氏菌多价血清进行实验, 如呈现凝集, 再用其群和型因子血清分别检查 如果 B 群多价血清不凝集, 则用 D 群宋内氏志贺氏菌血清进行实验, 如呈现凝集, 则用其 Ⅰ 相和 Ⅱ 相血清检查 ; 如果 B D 群多价血 清都不凝集, 则用 A 群痢疾志贺氏菌多价血清及 1~12 各型因子血清检查, 如果上述三种多价血清都不凝 集, 可用 C 群鲍氏志贺氏菌多价检查, 并进一步用 1~18 各型因子血清检查 福氏志贺氏菌各型和亚型的 型抗原和群抗原鉴别见表 4 表 4 福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原的鉴别表 型和亚型型抗原群抗原 在群因子血清中的凝集 3,4 6 7,8 1a Ⅰ 4 + - - 1b Ⅰ (4), 6 (+) + - 2a Ⅱ 3,4 + - - 2b Ⅱ 7,8 - - + 6
GB 4789.5-2012 表 4( 续 ) 福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原的鉴别表 在群因子血清中的凝集 型和亚型 型抗原 群抗原 3,4 6 7,8 3a Ⅲ (3,4),6,7,8 (+) + + 3b Ⅲ (3,4),6 (+) + - 4a Ⅳ 3,4 + - - 4b Ⅳ 6 - + - 4c Ⅳ 7,8 - - + 5a Ⅴ (3,4) (+) - - 5b Ⅴ 7,8 - - + 6 Ⅵ 4 + - - X - 7,8 - - + Y - 3,4 + - - 注 :+ 表示凝集 ;- 表示不凝集 ;() 表示有或无 5.6 结果报告 综合以上生化试验和血清学鉴定的结果, 报告 25 g(ml) 样品中检出或未检出志贺氏菌 7
GB 4789.5-2012 附录 A 培养基和试剂 A.1 志贺氏菌增菌肉汤 - 新生霉素 (Shigella broth) A.1.1 志贺氏菌增菌肉汤 A.1.1.1 成分胰蛋白胨 20.0 g 葡萄糖 1.0 g 磷酸氢二钾 2.0 g 磷酸二氢钾 2.0 g 氯化钠 5.0 g 吐温 80(Tween 80) 1.5 ml 蒸馏水 1 000.0 ml A.1.1.2 制法将以上成分混合加热溶解, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.0 0.2, 分装适当的容器,121 灭菌 15 min 取出后冷却至 50 ~55, 加入除菌过滤的新生霉素溶液 (0.5 μg/ml), 分装 225 ml 备用 注 : 如不立即使用, 在 2 ~8 条件下可储存一个月 A.1.2 新生霉素溶液 A.1.2.1 成分新生霉素 25.0 mg 蒸馏水 1 000.0 ml A.1.2.2 制法将新生霉素溶解于蒸馏水中, 用 0.22 µm 过滤膜除菌, 如不立即使用, 在 2 ~8 条件下可储存一个月 A.1.3 临用时每 225 ml 志贺氏菌增菌肉汤 (A.1.1) 加入 5 ml 新生霉素溶液 (A.1.2), 混匀 A.2 麦康凯 (MAC) 琼脂 A.2.1 成分蛋白胨 20.0 g 乳糖 10.0 g 3 号胆盐 1.5 g 氯化钠 5.0 g 中性红 0.03 g 结晶紫 0.001 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000.0 ml A.2.2 制法将以上成分混合加热溶解, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.2±0.2, 分装,121 高压灭菌 15 min 冷却至 45 ~50, 倾注平板 注 : 如不立即使用, 在 2 ~8 条件下可储存二周 A.3 木糖赖氨酸脱氧胆盐 (XLD) 琼脂 A.3.1 成分 8
GB 4789.5-2012 酵母膏 3.0 g L- 赖氨酸 5.0 g 木糖 3.75 g 乳糖 7.5 g 蔗糖 7.5 g 脱氧胆酸钠 1.0 g 氯化钠 5.0 g 硫代硫酸钠 6.8 g 柠檬酸铁铵 0.8 g 酚红 0.08 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000.0 ml A.3.2 制法除酚红和琼脂外, 将其他成分加入 400 ml 蒸馏水中, 煮沸溶解, 校正 ph 至 7.4 0.2 另将琼脂加入 600 ml 蒸馏水中, 煮沸溶解 将上述两溶液混合均匀后, 再加入指示剂, 待冷至 50 ~55 倾注平皿 注 : 本培养基不需要高压灭菌, 在制备过程中不宜过分加热, 避免降低其选择性, 贮于室温暗处 本培养基宜于当天制备, 第二天使用 使用前必须去除平板表面上的水珠, 在 37 ~55 温度下, 琼脂面向下 平板盖亦向下烘干 另外如配制好的培养基不立即使用, 在 2 ~8 条件下可储存二周 A.4 三糖铁 (TSI) 琼脂 A.4.1 成分蛋白胨 20.0 g 牛肉浸膏 5.0 g 乳糖 10.0 g 蔗糖 10.0 g 葡萄糖 1.0 g 硫酸亚铁铵 (NH 4 ) 2 Fe(SO 4 ) 2 6H 2 O 0.2 g 氯化钠 5.0 g 硫代硫酸钠 0.2 g 酚红 0.025 g 琼脂 12.0 g 蒸馏水 1 000.0 ml A.4.2 制法除酚红和琼脂外, 将其他成分加于 400 ml 蒸馏水中, 搅拌均匀, 静置约 10 min, 加热使完全溶化, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.4 0.2 另将琼脂加于 600 ml 蒸馏水中, 静置约 10 min, 加热使完全溶化 将两溶液混合均匀, 加入 5% 酚红水溶液 5 ml, 混匀, 分装小号试管, 每管约 3 ml 于 121 灭菌 15 min, 制成高层斜面 冷却后呈桔红色 如不立即使用, 在 2 ~8 条件下可储存一个月 A.5 营养琼脂斜面 A.5.1 成分 蛋白胨牛肉膏氯化钠琼脂 10.0 g 3.0 g 5.0 g 15.0 g 9
GB 4789.5-2012 蒸馏水 1 000.0 ml A.5.2 制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内, 加入 15% 氢氧化钠溶液约 2 ml, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.0 0.2 加入琼脂, 加热煮沸, 使琼脂溶化 分装小号试管, 每管约 3 ml 于 121 灭菌 15 min, 制成斜面 注 : 如不立即使用, 在 2 ~8 条件下可储存二周 A.6 半固体琼脂 A.6.1 成分蛋白胨 1.0 g 牛肉膏 0.3 g 氯化钠 0.5 g 琼脂 0.3g~0.7g 蒸馏水 100.0 ml A.6.2 制法按以上成分配好, 加热溶解, 并校正 ph 至 7.4 0.2, 分装小试管,121 灭菌 15 min, 直立凝固备用 A.7 葡萄糖铵培养基 A.7.1 成分氯化钠 5.0 g 硫酸镁 (MgSO4 7H 2 O) 0.2 g 磷酸二氢铵 1.0 g 磷酸氢二钾 1.0 g 葡萄糖 2.0 g 琼脂 20.0 g 0.2% 溴麝香草酚蓝水溶液 40.0 ml 蒸馏水 1 000.0 ml A.7.2 制法先将盐类和糖溶解于水内, 校正 ph 至 6.8 0.2, 再加琼脂加热溶解, 然后加入指示剂 混合均匀后分装试管,121 高压灭菌 15 min 制成斜面备用 A.7.3 试验方法用接种针轻轻触及培养物的表面, 在盐水管内做成极稀的悬液, 肉眼观察不到混浊, 以每一接种环内含菌数在 20~100 之间为宜 将接种环灭菌后挑取菌液接种, 同时再以同法接种普通斜面一支作为对照 于 36 1 培养 24 h 阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生长; 阴性者不生长, 但在对照培养基上生长良好 如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果 注 : 容器使用前应用清洁液浸泡 再用清水 蒸馏水冲洗干净, 并用新棉花做成棉塞, 干热灭菌后使用 如果操作时不注意, 有杂质污染时, 易造成假阳性的结果 A.8 尿素琼脂 A.8.1 成分 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 5.0 g 葡萄糖 1.0 g 磷酸二氢钾 2.0 g 0.4% 酚红溶液 3.0mL 10
GB 4789.5-2012 琼脂 20.0 g 20% 尿素溶液 100.0mL 蒸馏水 900.0 ml A.8.2 制法除酚红和尿素外的其他成分加热溶解, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.2 0.2, 加入酚红指示剂, 混匀, 于 121 灭菌 15 min 冷至约 55, 加入用 0.22 µm 过滤膜除菌后的 20% 尿素水溶液 100 ml, 混匀, 以无菌操作分装灭菌试管, 每管约 3 ml~4 ml, 制成斜面后放冰箱备用 A.8.3 试验方法挑取琼脂培养物接种, 在 36 1 培养 24 h, 观察结果 尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色 A.9 β- 半乳糖苷酶培养基 A.9.1 液体法 (ONPG 法 ) A.9.1.1 成分邻硝基苯 β-d- 半乳糖苷 (ONPG) 60.0 mg 0.01 mol/l 磷酸钠缓冲液 (ph7.5 0.2) 10.0 ml 1% 蛋白胨水 (ph7.5 0.2) 30.0 ml A.9.1.2 制法将 ONPG 溶于缓冲液内, 加入蛋白胨水, 以过滤法除菌, 分装于 10 mm 75 mm 试管内, 每管 0.5 ml, 用橡皮塞塞紧 A.9.1.3 试验方法自琼脂斜面挑取培养物一满环接种, 于 36 1 培养 1 h~3 h 和 24 h 观察结果 如果 β-d- 半乳糖苷酶产生, 则于 1 h~3 h 变黄色, 如无此酶则 24 h 不变色 A.9.2 平板法 (X-Gal 法 ) A.9.2.1 成分蛋白胨 20.0 g 氯化钠 3.0 g 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -β-d- 半乳糖苷 (X-Gal) 200.0 mg 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000.0 ml A.9.2.2 制法将各成分 (A.9.2.1) 加热煮沸于 1 L 水中, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.2 0.2,115 高压灭菌 10 min 倾注平板避光冷藏备用 A.9.2.3 试验方法挑取琼脂斜面培养物接种于平板, 划线和点种均可, 于 36 1 培养 18 h~24 h 观察结果 如果 β-d- 半乳糖苷酶产生, 则平板上培养物颜色变蓝色, 如无此酶则培养物为无色或不透明色, 培养 48 h~72 h 后有部分转为淡粉红色 A.10 氨基酸脱羧酶试验培养基 A.10.1 成分 蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 1.6% 溴甲酚紫 - 乙醇溶液 1.0 ml L 型或 DL 型赖氨酸和鸟氨酸 0.5 g/100 ml 或 1.0 g/100 ml 11
GB 4789.5-2012 蒸馏水 1 000.0 ml A.10.2 制法除氨基酸以外的成分加热溶解后, 分装每瓶 100 ml, 分别加入赖氨酸和鸟氨酸 L- 氨基酸按 0.5% 加入,DL- 氨基酸按 1% 加入, 再校正 ph 至 6.8±0.2 对照培养基不加氨基酸 分装于灭菌的小试管内, 每管 0.5 ml, 上面滴加一层石蜡油,115 高压灭菌 10 min A.10.3 试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种, 于 36 1 培养 18 h~24 h, 观察结果 氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱, 培养基应呈紫色 阴性者无碱性产物, 但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色 阴性对照管应为黄色, 空白对照管为紫色 A.11 糖发酵管 A.11.1 成分牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 3.0 g 磷酸氢二钠 (NA 2 HPO 4 12H 2 O) 2.0 g 0.2% 溴麝香草酚蓝溶液 12.0 ml 蒸馏水 1 000.0 ml A.11.2 制法 A.11.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后, 按 0.5% 加入葡萄糖,25 左右校正 ph 至 7.4±0.2, 分装于有一个倒置小管的小试管内,121 高压灭菌 15 min A.11.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后, 分装每瓶 100 ml,121 高压灭菌 15 min 另将各种糖类分别配好 10% 溶液, 同时高压灭菌 将 5 ml 糖溶液加入于 100 ml 培养基内, 以无菌操作分装小试管 注 : 蔗糖不纯, 加热后会自行水解者, 应采用过滤法除菌 A.11.3 试验方法从琼脂斜面上挑取小量培养物接种, 于 36 1 培养, 一般观察 2 d~3 d 迟缓反应需观察 14 d~30 d A.12 西蒙氏柠檬酸盐培养基 A.12.1 成分氯化钠 5.0 g 硫酸镁 (MgSO4 7H 2 O) 0.2 g 磷酸二氢铵 1.0 g 磷酸氢二钾 1.0 g 柠檬酸钠 5.0 g 琼脂 20 g 0.2% 溴麝香草酚蓝溶液 40.0 ml 蒸馏水 1 000.0 ml A.12.2 制法先将盐类溶解于水内, 调至 ph 6.8 0.2, 加入琼脂, 加热溶化 然后加入指示剂, 混合均匀后分装试管,121 灭菌 15 min 制成斜面备用 A.12.3 试验方法挑取少量琼脂培养物接种, 于 36 1 培养 4 d, 每天观察结果 阳性者斜面上有菌落生长, 培养基从绿色转为蓝色 A.13 粘液酸盐培养基 A.13.1 测试肉汤 12
GB 4789.5-2012 A.13.1.1 成分酪蛋白胨 10.0 g 溴麝香草酚蓝溶液 0.024 g 蒸馏水 1 000.0 ml 粘液酸 10.0 g A.13.1.2 制法慢慢加入 5 N 氢氧化钠以溶解粘液酸, 混匀 其余成分加热溶解, 加入上述粘液酸, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.4±0.2, 分装试管, 每管约 5 ml, 于 121 高压灭菌 10 min A.13.2 质控肉汤 A.13.2.1 成分酪蛋白胨 10.0 g 溴麝香草酚蓝溶液 0.024 g 蒸馏水 1 000.0 ml A.13.2.2 制法所有成分加热溶解, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.4±0.2, 分装试管, 每管约 5 ml, 于 121 高压灭菌 10 min A 13.3 试验方法将待测新鲜培养物接种测试肉汤 (A.13.1) 和质控肉汤 (A.13.2), 于 36 1 培养 48 h 观察结果, 肉汤颜色蓝色不变则为阴性结果, 黄色或稻草黄色为阳性结果 A.14 蛋白胨水 靛基质试剂 A.14.1 成分蛋白胨 ( 或胰蛋白胨 ) 20.0 g 氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1 000.0 ml ph7.4 A.14.2 制法按上述成分配制, 分装小试管,121 高压灭菌 15 min 注 : 此试剂在 2 ~8 条件下可储存一个月 A.14.3 靛基质试剂 A.14.3.1 柯凡克试剂 : 将 5 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 75 ml 戊醇中 然后缓慢加入浓盐酸 25 ml A.14.3.2 欧 - 波试剂 : 将 1 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 ml 95% 乙醇内 然后缓慢加入浓盐酸 20 ml A.14.4 试验方法挑取少量培养物接种, 在 36 ±1 培养 1 d~2 d, 必要时可培养 4 d~5 d 加入柯凡克试剂约 0.5 ml, 轻摇试管, 阳性者于试剂层呈深红色 ; 或加入欧 - 波试剂约 0.5 ml, 沿管壁流下, 覆盖于培养液表面, 阳性者于液面接触处呈玫瑰红色 注 : 蛋白胨中应含有丰富的色氨酸 每批蛋白胨买来后, 应先用已知菌种鉴定后方可使用, 此试剂在 2 ~8 条件下可储存一个月 13
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中华人民共和国国家标准 GB 4789.7 2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验副溶血性弧菌检验 2013-11-29 发布 2014-06-01 实施
GB 4789.7 2013 前 言 本标准代替 GB/T 4789.7-2008 食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验 本标准与 GB/T 4789.7-2008 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中文名称 ; 修改了范围 ; 修改了设备和材料 ; 修改了培养基和试剂 ; 修改了样品制备过程 ; 修改了检验程序 I
GB 4789.7 2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验副溶血性弧菌检验 1 范围 本标准规定了食品中副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 的检验方法 本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下 : a) 恒温培养箱 :36 ±1 ; b) 冰箱 :2 ~5 7 ~10 ; c) 恒温水浴箱 :36 ±1 ; d) 均质器或无菌乳钵 ; e) 天平 : 感量 0.1 g; f) 无菌试管 :18 mm 180 mm 15 mm 100 mm; g) 无菌吸管 :1 ml( 具 0.01 ml 刻度 ) 10 ml( 具 0.1 ml 刻度 ) 或微量移液器及吸头 ; h) 无菌锥形瓶 : 容量 250 ml 500 ml 1000 ml; i) 无菌培养皿 : 直径 90 mm; j) 全自动微生物生化鉴定系统 ; k) 无菌手术剪 镊子 3 培养基和试剂 3.1 3% 氯化钠碱性蛋白胨水 : 见附录 A 中 A.1 3.2 硫代硫酸盐 - 柠檬酸盐 - 胆盐 - 蔗糖 (TCBS) 琼脂 : 见附录 A 中 A.2 3.3 3% 氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂 : 见附录 A 中 A.3 3.4 3% 氯化钠三糖铁琼脂 : 见附录 A 中 A.4 3.5 嗜盐性试验培养基 : 见附录 A 中 A.5 3.6 3% 氯化钠甘露醇试验培养基 : 见附录 A 中 A.6 3.7 3% 氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基 : 见附录 A 中 A.7 3.8 3% 氯化钠 MR-VP 培养基 : 见附录 A 中 A.8 3.9 3% 氯化钠溶液 : 见附录 A 中 A.9 3.10 我妻氏血琼脂 : 见附录 A 中 A.10 3.11 氧化酶试剂 : 见附录 A 中 A.11 3.12 革兰氏染色液 : 见附录 A 中 A.12 3.13 ONPG 试剂 : 见附录 A 中 A.13 3.14 Voges-Proskauer(V-P) 试剂 : 见附录 A 中 A.14 3.15 弧菌显色培养基 1
GB 4789.7 2013 3.16 生化鉴定试剂盒 4 检验程序 副溶血性弧菌检验程序见图 1 样品 25 g(ml)+225 ml 3% 氯化钠碱性蛋白胨水 定性 定量 接种 3% 氯化钠碱性蛋白胨水 3 管,3 个适宜的连续稀释度 36 ±1,8 h~18 h 36 ±1,8 h~18 h TCBS 或弧菌显色培养基 36 ±1,18 h~24 h 挑取可疑菌落, 接种于 3% 氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂 36 ±1,18 h~24 h 筛选试验氧化酶试验, 革兰氏染色, 3% 氯化钠三糖铁琼脂, 嗜盐性试验 生化试验或选用生化鉴定试剂盒或全自动微生 物生化鉴定系统 血清学试验 神奈川试验 ( 选做项目 ) 结果与报告 图 1 副溶血性弧菌检验程序 5 操作步骤 5.1 样品制备 5.1.1 非冷冻样品采集后应立即置 7 ~10 冰箱保存, 尽可能及早检验 ; 冷冻样品应在 45 以下不超过 15 min 或在 2 ~5 不超过 18 h 解冻 5.1.2 鱼类和头足类动物取表面组织 肠或鳃 贝类取全部内容物, 包括贝肉和体液 ; 甲壳类取整个动物, 或者动物的中心部分, 包括肠和鳃 如为带壳贝类或甲壳类, 则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分, 然后以无菌操作打开外壳, 按上述要求取相应部分 2
GB 4789.7 2013 5.1.3 以无菌操作取样品 25 g(ml), 加入 3% 氯化钠碱性蛋白胨水 225 ml, 用旋转刀片式均质器以 8 000 r/min 均质 1 min, 或拍击式均质器拍击 2 min, 制备成 1:10 的样品匀液 如无均质器, 则将样品放入无菌乳钵, 自 225 ml 3% 氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵, 样品磨碎后放入 500 ml 无菌锥形瓶, 再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品 1~2 次, 洗液放入锥形瓶, 最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶, 充分振荡, 制备 1:10 的样品匀液 5.2 增菌 5.2.1 定性检测将 5.1.3 制备的 1:10 样品匀液于 36 ±1 培养 8 h~18 h 5.2.2 定量检测 5.2.2.1 用无菌吸管吸取 1:10 样品匀液 1 ml, 注入含有 9 ml 3% 氯化钠碱性蛋白胨水的试管内, 振摇试管混匀, 制备 1:100 的样品匀液 5.2.2.2 另取 1 ml 无菌吸管, 按 5.2.2.1 操作程序, 依次制备 10 倍系列稀释样品匀液, 每递增稀释一次, 换用一支 1 ml 无菌吸管 5.2.2.3 根据对检样污染情况的估计, 选择 3 个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种 3 支含有 9 ml 3% 氯化钠碱性蛋白胨水的试管, 每管接种 1 ml 置 36 ±1 恒温箱内, 培养 8 h~18 h 5.3 分离 5.3.1 对所有显示生长的增菌液, 用接种环在距离液面以下 1 cm 内沾取一环增菌液, 于 TCBS 平板或弧菌显色培养基平板上划线分离 一支试管划线一块平板 于 36 ±1 培养 18 h~24 h 5.3.2 典型的副溶血性弧菌在 TCBS 上呈圆形 半透明 表面光滑的绿色菌落, 用接种环轻触, 有类似口香糖的质感, 直径 2 mm~3 mm 从培养箱取出 TCBS 平板后, 应尽快 ( 不超过 1 h) 挑取菌落或标记要挑取的菌落 典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定 5.4 纯培养 h 挑取 3 个或以上可疑菌落, 划线接种 3% 氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板,36 ±1 培养 18 h~24 5.5 初步鉴定 5.5.1 氧化酶试验 : 挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验, 副溶血性弧菌为氧化酶阳性 5.5.2 涂片镜检 : 将可疑菌落涂片, 进行革兰氏染色, 镜检观察形态 副溶血性弧菌为革兰氏阴性, 呈棒状 弧状 卵圆状等多形态, 无芽胞, 有鞭毛 5.5.3 挑取纯培养的单个可疑菌落, 转种 3% 氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层,36 ±1 培养 24 h 观察结果 副溶血性弧菌在 3% 氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑, 无气泡, 斜面颜色不变或红色加深, 有动力 5.5.4 嗜盐性试验 : 挑取纯培养的单个可疑菌落, 分别接种 0% 6% 8% 和 10% 不同氯化钠浓度的胰胨水,36 ±1 培养 24 h, 观察液体混浊情况 副溶血性弧菌在无氯化钠和 10% 氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长, 在 6% 氯化钠和 8% 氯化钠的胰胨水中生长旺盛 5.6 确定鉴定 3
GB 4789.7 2013 取纯培养物分别接种含 3% 氯化钠的甘露醇试验培养基 赖氨酸脱羧酶试验培养基 MR-VP 培养基, 36 ±1 培养 24 h~48 h 后观察结果 ;3% 氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行 ONPG 试验 可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统 6 血清学分型 ( 选做项目 ) 6.1 制备接种两管 3% 氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂试管斜面,36 ±1 培养 18 h~24 h 用含 3% 氯化钠的 5% 甘油溶液冲洗 3% 氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养物, 获得浓厚的菌悬液 6.2 K 抗原的鉴定取一管 6.1 制备好的菌悬液, 首先用多价 K 抗血清进行检测, 出现凝集反应时再用单个的抗血清进行检测 用蜡笔在一张玻片上划出适当数量的间隔和一个对照间隔 在每个间隔内各滴加一滴菌悬液, 并对应加入一滴 K 抗血清 在对照间隔内加一滴 3% 氯化钠溶液 轻微倾斜玻片, 使各成分相混合, 再前后倾动玻片 1 min 阳性凝集反应可以立即观察到 6.3 O 抗原的鉴定将另外一管的菌悬液转移到离心管内,121 灭菌 1 h 灭菌后 4 000 r/min 离心 15 min, 弃去上层液体, 沉淀用生理盐水洗三次, 每次 4 000 r/min 离心 15 min, 最后一次离心后留少许上层液体, 混匀制成菌悬液 用蜡笔将玻片划分成相等的间隔 在每个间隔内加入一滴菌悬液, 将 O 群血清分别加一滴到间隔内, 最后一个间隔加一滴生理盐水作为自凝对照 轻微倾斜玻片, 使各成分相混合, 再前后倾动玻片 1 min 阳性凝集反应可以立即观察到 如果未见到与 O 群血清的凝集反应, 将菌悬液 121 再次高压 1 h 后, 重新检测 如果仍为阴性, 则培养物的 O 抗原属于未知 根据表 1 报告血清学分型结果 表 1 副溶血性弧菌的抗原 O 群 K 型 1 1,5,20,25,26,32,38,41,56,58,60,64,69 2 3,28 3 4,5,6,7,25,29,30,31,33,37,43,45,48,54,56,57,58,59,72,75 4 4,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63,67,68,73 5 15,17,30,47,60,61,68 6 18,46 7 19 8 20,21,22,39,41,70,74 9 23,44 10 24,71 11 19,36,40,46,50,51,61 12 19,52,61,66 13 65 7 神奈川试验 ( 选做项目 ) 神奈川试验是在我妻氏琼脂上测试是否存在特定溶血素 神奈川试验阳性结果与副溶血性弧菌分离 4
GB 4789.7 2013 株的致病性显著相关 用接种环将测试菌株的 3% 氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂 18 h 培养物点种于表面干燥的我妻氏血琼脂平板 每个平板上可以环状点种几个菌 36 ±1 培养不超过 24 h, 并立即观察 阳性结果为菌落周围呈半透明环的 β 溶血 8 结果与报告 根据检出的可疑菌落生化性状, 报告 25 g(ml) 样品中检出副溶血性弧菌 如果进行定量检测, 根 据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数, 查最可能数 (MPN) 检索表, 报告每 g(ml) 副溶血性弧菌的 MPN 值 副溶血性弧菌菌落生化性状和与其他弧菌的鉴别情况分别见表 2 和表 3 试验项目革兰氏染色镜检氧化酶动力蔗糖葡萄糖甘露醇分解葡萄糖产气乳糖硫化氢赖氨酸脱羧酶 V-P ONPG 注 :+ 表示阳性 ;- 表示阴性 表 2 副溶血性弧菌的生化性状 结果阴性, 无芽胞 + + - + + - - - + - - 5
GB 4789.7 2013 表 3 副溶血性弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别 名称 D 嗜盐性试验 D D 阿氯化钠含量氧赖精鸟 V 明脲 42 蔗纤乳拉 % 化氨氨氨 甘甘 ONPG 胶酶生长糖维糖伯酶酸酸酸 P 露露二糖 0 3 6 8 10 糖醇糖 副溶血性弧菌 V. + + - + + V - + - V - + + + - - + + + - parahaemolyticus 创伤弧菌 V. vulnificus + + - + + - - + - + + - + V + - + + - - 溶藻弧菌 V. alginolyticus + + - + + - + + + - - - + + - - + + + + 霍乱弧菌 V. cholerae + + - + + - V + + - - - + + + + + - - - 拟态弧菌 V. mimicus + + - + + - - + - - - - + + + + + - - - 河弧菌 V. fluvialis + - + - + - - V + + - + + + + - + + V - 弗氏弧菌 V. furnissii + - + - + - - - + - - + + + + - + + + - 梅氏弧菌 V. metschnikovii - + + - + - + V + - - - + + + - + + V - 霍利斯弧菌 V. hollisae + - - - - - - nd - - - + + - - - + + - - 注 :+ 表示阳性 ;- 表示阴性 ;nd 表示未试验 ;V 表示可变 6