上海办事处中国上海市漕河泾高新技术开发区桂箐路 111 号立明大厦 3 楼邮编 : 200233 电话 : +86-21-3338-4338 传真 : +86-21-3338-4300 北京办事处中国北京市建国门外大街 1 号国贸大厦 1 座 2716 室邮编 : 100004 电话 : +86-10-6539-0888 传真 : +86-10-6505-5077 康宁生命科学 ( 吴江 ) 有限公司中国江苏吴江经济开发区庞金路 1801 号 T03/17 厂房邮编 : 215200 电话 : +86-512-6319-6555 传真 : +86-512-6319-6502 免疫细胞治疗研究及相关产品应用指导手册 热线电话 : 400-077-0082 技术邮箱 : CLSTECHASIA@corning.com www.corning.com/lifesciences/china/cn
免疫细胞治疗技术简介 免疫细胞治疗技术简介 免疫的概念机体可以通过识别 自己 和 非己, 启动免疫应答, 排除异物, 对抗感染或疾病 ; 同时, 机体还能介导自身免疫耐受避免过度应答, 维持自身动态平衡 人体免疫系统主要有以下功能 : 免疫防御 : 针对外来抗原对机体进行免疫保护, 在正常情况下保护机体不受病原体的感染 免疫自稳 : 清除体内出现的变性 衰老和死亡细胞, 维持体内环境相对稳定 免疫监视 : 识别 清除突变细胞和持续性感染细胞 机体免疫监视功能低下, 突变的细胞无法被清除, 体内的生理平衡被打破, 最终导致了肿瘤的发生 传统的肿瘤治疗手段包括手术 放疗和化疗, 这三种治疗手段虽然各有优势, 但也存在对机体损伤大 靶向性不强 毒副作用明显 耐药性发生 治疗不彻底等问题, 患者的生存质量低下 目前, 继手术 化疗 放疗之后, 免疫细胞治疗以其精准杀伤肿瘤 提高放化疗效果 增强患者免疫力和提高患者生存质量等优势, 已经成为第四大肿瘤治疗手段 免疫细胞治疗模式 免疫细胞治疗是一种将患者自体的免疫细胞在体外培养 活化 扩增, 再回输入患者体内, 利用患者自身免疫细胞杀伤肿瘤细胞进行治疗的生物治疗技术 采血 肿瘤患者 回输 分离 细胞因子及抗原 回输液制备 刺激体外培养收集 免疫细胞治疗主要类型 数突状细胞 (DC) 细胞因子诱导的杀伤细胞 () 自然杀伤细胞 (NK) 肿瘤侵润淋巴细胞 (TIL) 细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 嵌合抗原受体重组 T 细胞 (CAR-T) www.corning.com/lifesciences/china/cn 03
效评估免疫细胞治疗技术简介 免疫细胞治疗技术简介 免疫细胞治疗有多种类型, 目前国内最常用的有 DC NK 及 DC- 结合疗法 2011 年 8 月 10 日, 美国 生物转化医学 和 新英格兰医学期刊 杂志报道, 宾夕法尼亚大学基因治疗专家卡尔 朱恩利用患者自身基因工程改造的 T 细胞, 即 CAR-T 技术, 治愈了两位晚期慢性淋巴细胞白血病病人, 使该技术成为临床研究和治疗的热门 下面简要的介绍下各类细胞的特点, 并在后续以 DC- 免疫细胞治疗为例介绍免疫细胞培养的相关流程及注意事项 DC( 树突状细胞 ) 细胞治疗 DC 是已知体内功能最强 唯一能活化静息 T 细胞的专职抗原提呈细胞, 是启动 调控和维持免疫应答的中心环节 DC 细胞治疗采用的是肿瘤患者自身的单核细胞在体外增殖 培养 诱导生成 DC,DC 负载肿瘤抗原, 经活化成熟后, 回输到患者体内, 刺激 活化人体内的 T 淋巴细胞, 产生强烈的抗肿瘤免疫应答 注入体内的 DC 可刺激体内的肿瘤杀伤性淋巴细胞活化和增殖, 从而发挥长期肿瘤监视作用和肿瘤杀伤作用, 达到消灭肿瘤的目的 CTL ( 细胞毒性 T 细胞 ) 细胞治疗 CTL 为一种特异的杀伤性 T 细胞, 可以通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤靶细胞, 或诱导靶细胞的凋亡 CTL 对某些病毒 肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用, 与 NK 构成机体抗病毒 抗肿瘤免疫的重要防线, 特异 高效地杀伤靶细胞, 在获得性细胞免疫中发挥重要功能 CTL 细胞疗法是从患者的外周血单个核细胞分选出 CTL 细胞, 体外通过肿瘤细胞抗原和细胞因子的诱导, 分化扩增, 形成杀伤能力强且具有肿瘤特异性的 CTL 细胞, 回输体内后达到杀伤肿瘤细胞的作用 CAR-T 细胞治疗嵌合抗原受体 T 细胞 (CAR-T 细胞 ) 是将识别某肿瘤抗原的单链抗体 (scfv) 和 T 的胞内段在体外进行基因重组, 在体外通过转染的方法将其导入患者的 T 细胞, 使其表达嵌合抗原受体 细胞被 重编码 后扩增, 生成大量肿瘤特异性的 CAR-T 细胞 ( 细胞因子诱导的杀伤细胞 ) 细胞治疗 细胞是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子 (IL-2 IFN-γ 或 IL-1a 等 ) 和 CD3 单克隆抗体共同培养一段时间后获得的一群异质性细胞群体 这种新型的免疫活性细胞增殖能力强, 细胞毒作用强, 具有一定的免疫特性 由于该细胞同时表达 CD3 和 CD56 两种膜蛋白分子, 故又称为 NK 细胞 ( 自然杀伤细胞 ) 样 T 淋巴细胞, 兼具 T 淋巴细胞强大的抗瘤活性, 和 NK 细胞的非 MHC 限制性杀瘤优点 因其增殖快 杀伤活性高 杀瘤谱广和毒副作用低等特点成为国内最为流行的过继性肿瘤细胞疗法 NK( 自然杀伤细胞 ) 细胞治疗 NK 细胞是机体中重要的免疫细胞, 不仅与抗肿瘤 抗病毒感染和免疫调节有关, 而在某些情况下,NK 细胞还与超敏反应和自身免疫病的发生有关 作为天然免疫的哨兵,NK 细胞可以快速响应并杀死病变细胞 NK 细胞治疗最常用的方法是从人外周血中获取单个核细胞, 在功能抗体和细胞因子刺激下, 使 NK 细胞在体外活化增殖, 细胞数目扩大数千倍甚至更高, 且细胞毒活性极大增强 增殖后的细胞回输到体内后发挥肿瘤杀伤作用 CAR-T 技术经历了三代演化 第一代 CAR-T 是将免疫球蛋白样 scfv 片段和 FcεRI 受体 (γ 链 ) 或 CD3 复合物 (ζ 链 ) 胞内结构域融合, 由于缺乏共刺激信号, 只能引起短暂的 T 细胞增殖和较低的细胞因子分泌, 不能提供长时间的 T 细胞扩增信号和持续的体内抗肿瘤效应 第二代 CAR-T 技术是抗体 v 区和 CD3-ζ 链之外引入协同刺激分子, 促进 IL-2 合成, 并使 T 细胞充分活化及免于凋亡, 以提高 T 细胞的细胞毒性 增殖活性, 维持 T 细胞应答, 延长 T 细胞存活时间等 由于第三代 CAR-T 持续的活化及细胞因子分泌导致细胞因子风暴等引起的副作用, 目前临床上应用最多的是第二代 CAR-T 因其抗原特异性 MHC 非限制性 靶向性更强 杀瘤范围广及杀伤更持久等优势被看成是最有前景的免疫细胞疗法 DC- 治疗流程介绍 DC- 细胞免疫治疗技术是利用树突状细胞 (DC) 和细胞因子诱导的杀伤细胞 ( 细胞 ) 两种细胞联合治疗肿瘤 将 DC 和 细胞结合起来, 培养双克隆免疫细胞, 具备更强大的抗肿瘤特性, 有效杀死癌细胞的肿瘤细胞免疫疗法, 能清除体内不同部位的微小残留病灶, 防止肿瘤复发与转移 由于其安全性高 无毒副作用的优点, 更是被称为肿瘤学科的 绿色生物疗法 由于 NK 细胞的杀伤活性无 MHC 限制, 且不依赖抗体, 在首次遇到肿瘤就可杀伤, 且杀瘤谱 DC- 治疗流程 广 同时 NK 细胞弥补了细胞毒性 T 淋巴细胞在杀伤肿瘤细胞时必须识别 MHC-I 类分子, 而无 法杀伤此类分子阴性的肿瘤细胞的缺陷 1 单核细胞 2 DCs 诱导 未成熟 DC TIL( 肿瘤侵润的淋巴细胞 ) 细胞治疗 TIL 细胞是从患者的肿瘤组织中获得的已经特异性应答的细胞, 通过细胞因子的作用使其在体外培养扩增后回输患者体内达到杀伤肿瘤的目的 肿瘤组织需要在外科手术切除的情况下获得, 且细胞的数量非常有限, 且成本高昂, 因此目前的临床应用相对较少 单个核细胞分离疗淋巴细胞 2 3 细胞的诱导与扩增 细胞 抗原致敏3 6 临床应用 5 质量合格 4 细胞的质量检测 DC 疫苗的质量检测 4 负载抗原的成熟 DC 04 www.corning.com/lifesciences/china/cn www.corning.com/lifesciences/china/cn 05
免疫细胞治疗技术简介 免疫细胞治疗技术简介 DC 细胞和 细胞培养分离 DC 细胞培养及鉴定 分离悬浮细胞后的贴壁细胞 ( 主要是 CD14+ 的单核细胞 ) 悬浮细胞 血细胞分离机分离患者外周血 PBMC 淋巴细胞分离液获取 PBMC, 无血清洗涤 (PBS), 细胞数量达到 1-3X10 8 细胞浓度 2X10 6 /ml 37, 5%CO 2 培养箱中孵育 贴壁细胞 细胞共培养 1.5 h 贴壁细胞加入 GM-CSF (500-1,000 U/mL), IL-4 (500U/ml) 每3d 换液加入肿瘤抗原 (50-Ug/ml) 加入 TNF-α(500-U/ml) 1d 5d 6d 1d: 加入细胞因子, 诱导单核细胞向 DC 细胞分化 IL-4 可降低 CD14 表达水平,CD14 的降低是单核细胞分化为 DC 的重要标志 每 3d 半量换液一次, 并补足细胞因子 5d: 加入肿瘤抗原, 对 DC 进行抗原负载 ( 可选 ) 6d: 加入 TNF-a, 诱导 DC 成熟 7-8d: 收获 DC, 数量应达到 1X10 6 个以上 ( 约为最初贴壁单核细胞数量的 70-80%) DC 细胞质控 1d 加入 IFN-γ (1,000 U/ml) 加入 GM-CSF (500-1,000 细胞培养 U/mL), IL-4 (500U/mL) DC 细胞培养 (TC 表面 ) 回输天数细胞 7 DC 12 14 DC 16 18 细胞培养及鉴定 细胞培养 液1d 2d 14d 悬浮细胞 加入 IFN-γ (1,000 U/ml) 加入 CD3 激发型单抗 (50ng/ml) 和 IL-1(300/ml), ( 也可加入 IL-1α 100 U/ml) 每3d 换用无血清培养液调整细胞浓度至 1-2X10 6 /ml 1d: 加入人重组 IFN-r 培养 2d: 刺激 细胞的生长和增值 加入克隆号 OKT-3 的 CD3 单克隆抗体,IL-2 促进 T 细胞的增值和活化 ; 先加入 IFN-g,24h 后再加入 IL-2, 可明显提高 的细胞毒活性 ; 每 3d 半量换液或扩瓶一次, 并加重组人 IL-2 300U/ml : 数量达到 1X10 9 个以上 A: 联合培养 : 收获 细胞 (DC-) B: 单独培养 : 不收获继续培养 将培养 体积加倍, 并相应加入 IL-2, 转入多个培养瓶 或者培养袋培养 细胞质控 定期取样对细胞进行细胞形态 细胞活率 细胞表型 微生物生长情况及细胞杀伤能力进行检测 一般细胞培养体积大于 500ml 以上, 改用细胞培养袋等容器进行培养 DC- 细胞混合培养及鉴定 14d 获得 细胞 将获得的成熟 DC 细胞和 细胞共培养, 无血清培养液中添加重组人 IL-2(300U/ml) 每 3 天半量换液一次, 并补加 IL-2 10:1 混合培养每3d 换液,并IL-2(300U/m) 补加获得 DC- 细胞 混合培养第 收集细胞, 细胞数量应达到 1X10 10 个以上 获得成熟 DC 细胞 DC- 细胞质控台盼蓝染色, 活细胞大于 80% 流式细胞仪检测表面 CD3 CD8 CD56 等分子的表达,CD3+CD56+ 细胞的比例大于 20% 以上细胞杀伤实验及病原微生物检测 14d 06 www.corning.com/lifesciences/china/cn www.corning.com/lifesciences/china/cn 07
免疫细胞治疗解决方案 免疫细胞治疗解决方案 Corning 免疫细胞治疗解决方案 Corning 可为您提供免疫细胞治疗从上游到下游所需的一系列产品, 包括细胞分离 细胞培养 细胞质控和细胞冻存等所需耗材 试剂和设备 实验数据 KBM 551 培养基可用于激活和扩增人 LAK 细胞的培养体系, 获取大量的 LAK 细胞 对 T 细胞和 LAK 细胞进行增殖培养 14 天, KBM551 获取的细胞数量和竞争产品 B 相当, 高于其他产品 采用 KBM551 培养的 T 和 LAK 细胞表面蛋白的表达情况和竞争产品相当 康宁冻存液 康宁淋巴细胞分离液 康宁功能抗体 康宁冻存袋 管 康宁常规耗材康宁通用小设备 康宁细胞因子康宁无血清培养基 冻存 CD56+/CD3- KBM551 2.8% 竞争产品 A 0.9% 竞争产品 B 0.9% 竞争产品 C 2.0% 病人外周血 获得 PBMC 体外分化或扩增 质量控制 回输病人 CD56-/CD3+ CD56+/CD3+ 92.2% 3.3% 95.1% 3.8% 95.3% 3.5% 92.3% 5.5% 康宁培养袋康宁培养瓶 康宁通用设备 CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ 42.2% 51.3% 30.2% 65.9% 27.6% 63.5% 37.5% 54.0% 16000 试剂选择及配制 Corning 可以提供用于淋巴细胞培养的专用培养基,KBM502 KBM561 KBM551 和 KBM581, 同时可以根据客户的需求提供袋装培养基 ( 预装培养袋 ), 此外还可以提供在试剂配置阶段可用的小型仪器及试剂过滤装置 对比目前市面上的培养基, KBM 581 可获取更多数量的 细胞 对 细胞进行增殖培养 14 天, 采用 KBM581 获取的细胞数量高于采用 KBM551 和其他竞争产品的对照组 采用 KBM581 培养的 细胞, 其中 CD3+CD56+ 及 NK 细胞所占比例分别为 13.0% 和 2.3%, 高于其他培养基 The number of cells (x10 4 cells) 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 KBM581 KBM551 Competitor A Competitor B 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Culture time (days) KBM 500 系列 ( 人淋巴细胞专用培养基 ) KBM500 系列是免疫学和临床研究中常用的无血清培养基, 用于活化人 T 细胞和细胞免疫应答实验 KBM501 和 KBM502 用于活化淋巴细胞, 尤其是自然杀伤细胞 (NK) 和细胞毒性 T 淋巴细胞, 以及后续各自的增殖培养 CD3+/CD56+ CD3-/CD56+ KBM581 13.0% 2.3% KBM551 4.7% 1.3% Competitor A 8.8% 1.1% Competitor B 11.2% 1.9% KBM551 的配方和 KBM550 一样, 但不含有 IL-2, 使用前需要添加适量浓度的 IL-2 KBM561 用于 NK 和 CTL 活性的淋巴细胞的活化和增殖培养 不含有 IL-2, 使用前需添加适量浓度的 IL-2 CD3+/CD56- CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ 84.6% 25.8% 66.1% 94.1% 27.6% 67.0% 90.0% 24.4% 62.1% 86.9% 25.2% 70.6% KBM581 为 KBM551 最新升级配方, 专为 细胞培养开发, 培养 细胞无需添加血清 产品特点 单位 包装 所有 KBM 培养基由高品质的试剂和原材料加工而成除含有注射级别血清白蛋白和重组人胰岛素外不含有其它蛋白缓冲能力强,PH 稳定添加有抗生素 ( 硫酸卡那霉素 ) 有效期 12 个月 88-501-CV 88-502-CM 88-551-CM 88-561-CM 88-581-CM KBM501, NK 细胞无血清活化培养基, 高浓度 IL-2 KBM502, NK 细胞无血清扩增培养基, 低浓度 IL-2 KBM551, DC/ 细胞无血清培养基 ( 淋巴 cell DC) KBM561, DC/ 细胞无血清培养基 ( 淋巴 cell DC NK) KBM581, DC/ 细胞无血清培养基 瓶瓶瓶瓶瓶 500 毫升 生产工厂执行 ISO 9001 and ISO 13485 标准 08 www.corning.com/lifesciences/china/cn www.corning.com/lifesciences/china/cn 09
免疫细胞治疗解决方案 免疫细胞治疗解决方案 细胞分离 淋巴细胞分离液 (LSM) 设计用于在体外从稀释的全血中分离淋巴细胞, 是一种无菌等渗 的聚蔗糖和泛影葡胺溶液 LSM 为无菌过滤溶液, 含有 96.22 g/l 泛影酸和 61.36 g/l 聚蔗糖 400, 在 20 摄氏度条件下, 粘度低, 密度为 1.077-1.080 g/ml 溶液的渗透压为 290 ± 20 mosm, ph 为 7.5 ± 1.5 原理采用密度梯度离心法提取人外周血淋巴细胞 低速离心 30 分钟 根据密度的不同形成多层溶液 单核的细胞 ( 淋巴细胞和单核细胞 ) 和血小板处于血浆与 LSM 的间隔条带位置, 红细胞和粒细胞穿过 LSM 层, 聚集在试管的底部 吸去血浆层, 再回收淋巴细胞 多余的血小板,LSM 和血浆可以通过后续的细胞清洗去除 Plasma and LSM Mononuclear Cell Layer RBC S 细胞冻存一般细胞治疗类细胞培养后直接回输人体, 如果需要暂时储存或者留样, 可以考虑相应的储存方法 如果是少量的样品或者种子细胞的保存, 可以选取冻存管, 这种保存方式便于单管复苏和培养及检测 ; 如果是大量的细胞进行保存, 可以选取冻存袋 选择合适的冻存液可以保证更高的细胞复苏效率 康宁细胞冻存液 KM Banker 产品系列是即用型细胞冻存液, 专用于无血清培养条件下细胞的长时间低温保存 该系列产品在多种哺乳细胞上经过验证, 能够保持细胞活性并提高细胞复苏效率 KM Banker 系列含两个产品 : KM Banker I 特点化学成分明确, 不含血清, 不含蛋白 适用细胞 贴壁细胞系 : CHO, MDCK, Vero cells 原代细胞 : 成纤维细胞, 表皮角质形成细胞, 血管内皮细胞悬浮血细胞 :Daudi, Raji, K562, Molt-4F KM Banker II 含人血清白蛋白, 不含血清, 不含其它蛋白贴壁细胞系 : CHO, MDCK, Vero cells 原代细胞 : 成纤维细胞, 表皮角质形成细胞, 血管内皮细胞悬浮血细胞 :Daudi, Raji, K562, Molt-4F 人外周血淋巴细胞 图 1: 全血在 LSM 中离心后的各类细胞分布 在不同冻存液中在 - 80 保存一周的淋巴细胞生长曲线 在不同冻存液中在 - 80 保存一年的淋巴细胞复苏效率 KM Banker II KM Banker 25-072-CI 25-072-CV 淋巴细胞分离液 ( Lymphocyte Separation Medium) 淋巴细胞分离液 ( Lymphocyte Separation Medium) 单位 瓶瓶 包装 100ml 500ml C (Company N) B (Company L) KM Banker II C (Company N) B (Company L) KM Banker 细胞活化及扩增 在细胞活化及扩增阶段,Corning 可以提供多种配套产品 : 细胞因子 常规细胞培养瓶 多层细胞培养瓶 用于大量细胞培养的培养袋 移液管及配套移液器, 收集细胞的各种规 格的离心管, 节省空间高性价比的桌面离心机等 细胞培养袋 双面透气性良好 封闭体系培养, 不会暴露在空气中 比 T 培养瓶节省空间, 可在孵箱中培养更多样品 单位 包装 88-610-20 Culture bag 悬浮细胞培养袋 包 10 pieces/bag 354048 GM-CSF 集落刺激因子 管 1ug 354043 IL-2 人重组白介素 2 管 10000U 354068 IL-4 人重组白介素 4 管 5ug 354066 人重组 TNF-a 管 10ug 353143 3 层 TC 处理培养瓶,525cm 2 箱 12 个 / 箱 353144 5 层 TC 处理培养瓶,875cm 2 箱 8 个 / 箱 3313 5 层细胞工厂, 培养面积 3,180 cm 2,TC 表面, 无菌 箱 8 个 / 箱 单位 包装 88-701-CB 康宁细胞冻存液 KM Banker I, 化学成分限定 瓶 120ml 88-702-CB 康宁细胞冻存液 KM Banker II, 尤其适用于淋巴细胞 瓶 120ml 康宁细胞冻存袋 低温存储袋用于储藏 保存并转移细胞 MNC 和 CD34+ 细胞复苏效率 >80% 独特的膜材料在超低温 (-196 C) 下依然保持柔韧性 聚烯烃膜 ( 专利 EVA 混合膜 ) 专利膜接口设计使壁更薄, 冻存时保持高度柔韧性 ; 附着盖降低膜的暴露程度 工业标准标签袋设计让标记和查找更方便 单位 包装 91-200-88 细胞冻存袋 50ml 容量, 灌注体积 10-20ml 91-200-89 细胞冻存袋 250ml 容量, 灌注体积 30-70ml 91-200-88 细胞冻存袋 500ml 容量, 灌注体积 55-100ml 91-200-88 细胞冻存袋 750ml 容量, 灌注体积 80-190ml 10 www.corning.com/lifesciences/china/cn www.corning.com/lifesciences/china/cn 11