"" 中 国 畜 牧 兽 医 卷 关于其在正常哺乳动物细胞中表达的研究并不多 见 冯丽丽等研究表明 在乳腺组织中 % 和其配体 在奶牛乳腺发育的不同时期表达部位及表达量均发生变化 且泌乳期表达量显著高于其他发育时期 提示 % 参与了成年奶牛乳腺泌乳功能的调控 但是 % 的表达与奶牛乳蛋白合成之间的关

中国畜牧兽医 " 7 型氨基酸转运载体 对奶牛乳腺中 酪蛋白表达的影响 邢伟楠 段晓宇 杨 洋 侯晓明 林 叶 东北农业大学生命科学学院 哈尔滨 " 摘 要 为研究 型氨基酸转运载体 3 (3 3% 对奶牛乳腺中 酪蛋白表达的作用 本试验采用 ' 技术体外扩增奶牛 ( 基因并构建 % 真核表达载体 采用脂质体转染技术将 % 真核表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞 并于转染 后采用 33 技术检测 % 过表达后乳腺上皮细胞中 % 和 酪蛋白的表达变化 荧光显微镜检测结果显示 % 真核表达载体成功转染奶牛乳腺上皮细胞 33 检测结果显示 % 过表达的奶牛乳腺上皮细胞中 % 极显著增加 酪蛋白的表达显著升高 " 表达变化不显著 " 这些结果提示 % 对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成具有促进作用 关键词 奶牛 乳腺上皮细胞 型氨基酸转运载体 酪蛋白中图分类号 * 文献标识码 % 文章编号 "" '& 7 % ' & ' %% & -; 4% %;4 ( - )* " * &'&-3 =33 3 <3<%(((3 < 3 ( < ( < '-+ ;'% =33 3 -+ ;'% =3 3 <3 3(((3<3 <%= <% 3333 <3 <3 <3 3 3 3 -+ ;'%3 <33(((3< <% 3( <3 <3 "% = 3 < 3<3 "3 3 3 3%(3 3 (3 ( 3 3 (((3 < +(((3% 哺乳动物细胞需经多种氨基酸转运载体介导来 摄取各种氨基酸 用于蛋白质的生物合成 型氨基酸转运载体 3 (3 3 % 是 型氨基酸转运载体家族的成员之一 是 D 非依赖性转运载体 可运输中性氨基酸 在体液环境中与亮氨酸 异亮氨酸 甲硫氨酸 缬氨酸 组氨酸 色氨酸和苯丙氨酸等具有较强的亲和 " 力 % 已被证实在多种癌细胞中高表达 但 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金 黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划 4'+ " 东北农业大学青年才俊基金资助项目 * 作者简介 邢伟楠 女 黑龙江哈尔滨人 硕士生 研究方向 泌乳生物学与乳腺功能调控 ( " ( 通信作者 林 叶 女 黑龙江大庆人 副教授 研究方向 泌乳生物学与乳腺功能调控 ( "(

"" 中 国 畜 牧 兽 医 卷 关于其在正常哺乳动物细胞中表达的研究并不多 见 冯丽丽等研究表明 在乳腺组织中 % 和其配体 在奶牛乳腺发育的不同时期表达部位及表达量均发生变化 且泌乳期表达量显著高于其他发育时期 提示 % 参与了成年奶牛乳腺泌乳功能的调控 但是 % 的表达与奶牛乳蛋白合成之间的关系尚不清楚 因此 本试验通过体外构建奶牛 % 真核表达载体 采用基因转染技术将 % 表达载体转染到泌乳期荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞中 研究 % 对奶牛乳腺上皮细胞中 酪蛋白表达的影响 旨在揭示 % 的表达与奶牛乳腺发育与泌乳功能之间的关系 为改善奶牛乳品质提供理论依据 材料与方法 - 材料 泌乳期奶牛购于黑龙江省畜牧业科技园区 奶牛屠宰后取乳腺组织 用于 % 提取的组织迅速用液氮冷冻 用于细胞培养的组织浸泡在 溶液中 带回实验室迅速进行细胞的分离培养 - 主要试剂 % 及角蛋白 抗体均购自 + 3 公司 酪蛋白抗体购自北京博奥森生物技术有限公司 超敏发光液购自上海天能公司 ' ( +% &% ' (&&B 试剂盒 限制性核酸内切酶 及 连接酶均购自 公司 脂质体 & & 均购自 < 公司 胎牛血清购自 /- 公司 /+% 和鼠尾胶原均购自 +( 公司 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 -; 兔抗山羊 -; 及山羊抗小鼠 -; 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司 - 方法 乳腺上皮细胞的离体培养及角蛋白 鉴定 取新鲜泌乳期奶牛乳腺组织 依次用氟康唑注射液 ") 乙醇及 溶液清洗后 转移至装有培养液的小烧杯中 用眼科手术剪刀剔除脂肪组织和结缔组织 将保留的乳腺组织剪成约 ((C ((C(( 的小块 将乳腺组织块用 溶液清洗 次后 接种于铺有鼠尾胶原的细胞培养瓶中 将细胞培养瓶置于 A") 培养箱中倒置培养 然后取出 缓慢加入 & & 培养液 继续培养 待细胞铺满培养瓶底壁的 ) ) 时 弃培养液 用 溶液清洗 次 加入 ") 胰蛋 白酶 A 消化成纤维细胞 待成纤维细胞脱离瓶壁 弃去消化液 培养瓶中保留的主要为乳腺上皮细胞 随后在细胞培养瓶中加入 ) % 和 ") 胰蛋白酶溶液 A 消化 " ( 镜下观察 当细胞逐渐漂浮时 加入含有 ) 胎牛血清的 & & 培养液终止消化 反复轻吹瓶壁 悬浮细胞 将乳腺上皮细胞接种于新瓶中 置于 A ") 培养箱中继续培养 并传代 " 次 即得到纯化的乳腺上皮细胞 将纯化后的奶牛乳腺上皮细胞制作细胞爬片 采用预冷甲醇固定 ( 用 '/+ 清洗细胞 次 每次 "( 采用含 ") /+% 的 /+ A 封闭 弃封闭液 用角蛋白 抗体 " 稀释 A 孵育过夜 /+ 清洗细胞后 采用 - 标记兔抗山羊 -; 稀释 A 孵育 /+ 清洗细胞后 在细胞爬片上滴加 ('- 溶液 室温作用 "( 后采用抗荧光淬灭剂封片 激光扫描共聚焦显微镜下观察 奶牛 % 真核表达载体构建 采用 法提取奶牛乳腺上皮细胞总 % 用 &&B 试剂盒反转录生成 % 以此 % 为模板 ' 扩增牛 ( 基因 + 区 引物序列为 "?;%;%;; ;;;%;; %%;? "?; ;;% ; ;;;; %%% ;;? 其中加下划线部分分别为 和 酶切位点 将扩增所获得的 ( 基因与 & 载体连接 转化后挑取单菌落 采用菌落 ' 的方法鉴定连接 ( 基因片段的克隆载体 鉴定所用引物为 "?;%; ;;%%% % % % % %;;? "? %; % ;% ;;;%;? 将构建成功的 % 克隆载体命名为 &% 送博仕生物公司进行测序 随后将 &% 和表达载体 -+ ;' 均采用 和 分别进行双酶切 &% 载体酶切后胶回收得到 ( 基因片段 表达载体双酶切后得到载体主体片段 将两者胶回收产物进行连接 连接产物转染大肠杆菌 ' 感受态细胞 挑取阳性菌落送公司测序 获得序列正确的 % 真核表达载体 命名为 -+ ;'% % 真核表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞 将培养的荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞以 C " 个 ( 的密度接种至 孔细胞培养板中 待细胞铺满培养板的 ) 时 采用脂质体 将 -+

%& 期 邢伟楠等 S 型氨基酸转运载体 % 对奶牛乳腺中 酪蛋白表达的影响 444 =Yb S7D% 真核表 达 载 体 转 染 至 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞'转染? E;=C =Yb 空载体的奶牛乳腺上皮细胞 Y?" @( & 进行多 重 比 较结 果 均 以 平 均 值 o 标准差表示以 & &4 作 为 差 异 显 著 性 判 断 为阴性对照'转染 )3 后提取细胞总蛋白' 标准' % * )[ - -V 检测 酪蛋白的表达 采用 %&A CC 7Y= 凝胶电 泳 分 离 乳 腺 上 皮 细 胞 总蛋白随后采用转 移 电 泳 的 方 法 将 蛋 白 从 凝 胶 上 结果与分析 转移到 < 膜上'将 < 膜 在 4A 的 GC7 中 */ e E 奶牛乳腺上皮细胞的培养 采用组织块法分离培养奶牛乳腺上皮细胞'经 封闭 % 4 后分 别 用 S7D% 抗 体 " %l&& 稀 释 ( 过传代培养不 断 对 细 胞 进 行 纯 化' 纯 化 后 的 乳 腺 )b抗体" %l4&& 稀释( 酪 蛋 白 抗 体" %l%&&& 稀释及 - 抗体" %l&& 稀 释) e 孵 育 过 夜' 上皮细胞形 态 见 图 %' 由 图 % 可 知乳 腺 上 皮 细 胞 次日将 < 膜 经 DGCD 漂 洗 后 用 相 应 的 E VYX; " %l&&& 稀释*/ e 孵育 %'< 膜经 DGCD 漂 洗 * 次后采用 =<S 方法曝光显影' 呈鹅卵石状均匀分布于培养瓶底' E 角蛋白 R 的鉴定 应用免疫荧光技术检测纯化后的乳腺上皮细胞 角蛋白 %3 的表达激 光 共 聚 焦 结 果 见 图 ' 由 图 E% 数据处理与分析 采用E@V J( & 软件对奶牛乳 腺上 皮 可知图中绿 色 荧 光 为 角 蛋 白 %3 在 细 胞 质 中 的 表 细 胞 中 S7D%( )b(酪 蛋 白 表 达 的 [ -V 条 带 的 光 密 度 进 行 扫 描组 间 数 据 采 用 上皮细胞角蛋白 %3 的表达呈阳性表明本试验成功 达红 色 荧 光 为 E染 色 的 细 胞 核纯 化 培 养 的 乳 腺 获得了奶牛乳腺上皮细胞' 图 奶牛乳腺上皮细胞的体外培养" &&g EP77-3 D* * ) 3 '" &&g < < 椭圆形为 E标记的细胞核&细胞核周围信号为 bed< 标记的角蛋白 %3 a & <^ -%3O J-" -J J "^bed< J JO "^E " 图 激光共聚焦检测奶牛乳腺上皮细胞角蛋白 R 的表达 " )&&g E*< W /R3 / / @ @ 3777-3 DB< / -7 " )&&g < <

44( 中国畜牧兽医 E&U;J 真核表达载体的构建 * % 奶牛 &@% 基因的扩增 采 用 D L 法 提 取 荷 斯 坦 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 总 ;7反 转 录 成 7 后以此为模 板 通 过 <; 技 术 扩 增 &@% 基 )* 卷 因的 <C 区'由图 * 可知获得的 &@% 基因片段 长度为 %4&?与 预 期 结 果 相 符可 以 进 行 后 续 试验' 图 & 奶牛 "4 基因的 A*F 扩增 E&A*F7 / "4 / 3 D < * S7D% 真 核 表 达 载 体 的 构 建 与 鉴 定 S7D% 克隆 载 体 凝 胶 电 泳 结 果 见 图 )' 由 图 ) 可 知所检测 样 本 在 %4&&? 左 右 的 位 置 均 出 现 条 带表明 <; 产物与克隆载体成功连接'将挑 取的 菌落进行测序将测序结果与 Y-G- 中提 供的牛 得 S7D% 克隆 载 体'将 克 隆 载 体 及? E;=C =Yb 载体的双酶切" <% ( <% 产 物 连 接(转 化' 得 到 ) 个单菌落进行测序测 序 结 果 与 Y-G- 中 牛 &@% 基因全序列进行比对序列 正确表明 成 功 构 建 S7D% 真核表达载体? E;=C =Yb S7D%' &@% 基因全序列进行比对序列正确表明 成功获 S&&&7 & %&4 S7D% 克隆载体 S&&&7 & % 4 S7D% -Va 图 % 奶牛 U;J 克隆载体菌落 A*F 鉴定 E%T 3 / / U;J / / B<A*F E%U;J 过 表 达 对 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 中 酪 蛋 白表达的影响 采用 脂 质 体 转 染 技 术 将 奶 牛? E;=C =Yb S7D% 载体转染进入 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞转 染 )3 后首先通过荧光显 微 镜 观 察检 测 转 染 效 率 结 果 见 图4'由图4 可知绿色为转染进入细胞的? E;=C =Yb S7D% 载体在 细 胞 中 表 达 发 出 的 荧 光转 染 效率约为 /&A '

%& 期 邢伟楠等 S 型氨基酸转运载体 % 对奶牛乳腺中 酪蛋白表达的影响 44/ 图 ' 荧光显微镜检测 TF =A U;J 过表达后的转染效率" &&g E ' / / / T F = A U ; J O /3 3B @ / 7 &&g J < < <" E'X /B / 检测 收集 转 染 后 的 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 总 蛋 白 - 为内参结 果 见 图 (( /'S7D% 过 表 达 后 奶 牛乳腺上皮细 胞 中 S7D% 极 显 著 增 加 " & &%( [ - -V 检测 S7D% 过 表 达 后 奶 牛 乳 腺 上 皮细胞中 S7D%( )b及 酪 蛋 白 的 表 达 变 化以 酪蛋白的表 达 显 著 增 加 " & &4而 )b 的 表达变化不显著" & &4' 图 表达载体转染后 U;J" %和 酪蛋白的表达 EO / U;J %/3 / / / 肩标不同小写字母表示差异显著" & &4&肩标不同 大 写 字 母 表 示 差 异 极 显 著 " & &%&肩 标 相 同 字 母 表 示 差 异不显著" & &4 f J O " @ J? @ - " - " & &4&[ "? J? V& &%&[ O @ J? @ -- @ -P @ " - "?? ^ V? V " - " & &4 图 )U;J 过表达后奶牛乳腺上皮细胞中 U;J" %和 酪蛋白的相对表达量 E)F O / U;J %/3 / U;J O /

"" 中 国 畜 牧 兽 医 卷 讨 论 牛乳蛋白中的必需氨基酸的含量与人类所需的 必需氨基酸含量接近 具有较高的营养价值 在泌乳乳腺中 乳蛋白合成所需的必需氨基酸需要从 血液中摄取 % 是细胞摄取支链氨基酸和芳香族氨基酸的主要载体蛋白 由 " 基因编 码 属于溶质载脂家族 的成员 % 作为一个轻链结构需要与 型糖基化的膜蛋白 重链通过二硫键结合 形成 % 二 聚体后才具有转运氨基酸的功能 在泌乳期的小鼠和奶牛乳腺组织中均发现有 % 及其配体 的表达 但是 % 对乳蛋白合成的 " 影响尚未见报道 等研究表明 在视网膜血管内皮细胞中 % 可以为细胞的生长和增殖提供必需氨基酸 进行蛋白质的生物合成 在人类滋养层细胞中 上调 % 的表达可以促进胎儿的 生长发育 在小鼠中 ''% 和 +' 转录因子可以共同调节 % 的表达 促进胎盘的形 成 这些结果均表明 % 的表达可以提高细胞对氨基酸的摄取 为蛋白质的生物合成提供原料 本研究结果也显示 在 % 过表达的奶牛乳腺上皮细胞中 酪蛋白的合成增加预示 % 很可能参与乳腺上皮细胞对必需氨基酸的摄取 进而提高乳蛋白的生物合成能力 ( 信号通路是调控蛋白质翻译的主要信号通路 有研究表明 在小鼠的肌细胞中 % 的表达与 ( 信号通路 的活性相关 在人的滋养层细胞中 抑制 ( 信号通路 % 和 的表达受到抑制 在肝脏细胞中 % 可以促进细胞对亮氨酸的摄取 进而激活细胞内 ( 复合物 调节蛋白质翻译 过程 这些结果表明 % 的表达与蛋白质的生物合成之间呈正相关 本实验室对泌乳的奶牛乳腺上皮细胞进行研究 也得到一致的结果 即 % 的表达与乳蛋白的合成呈正相关 本研究结果显示在奶牛乳腺上皮细胞中 % 过表达后 表达未发生明显变化 预示 % 是乳蛋白生物合成过程的主要调节基因 的表达变化趋势未受 % 表达的影响 可能是因为 除了作为 % 的配体之外 还与整合素等其他蛋白质结合参与多种蛋白质的生理功能的调节 结 论 本试验成功构建 % 真核表达载体并成功 转染奶牛乳腺上皮细胞 在 % 过表达的奶牛乳腺上皮细胞中 % 酪蛋白的表达分别极显著和显著升高 的表达变化不显著 这些结果提示 % 对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成具有促进作用 参考文献 & %% ( & '7/ 3 %/< 3 ' 3 33 ( 3 < ( ( ( 3 333 37 "" & 33 < %33 <3 ( (7" +3 // % 3% = ( 3 <33 (3 3 ( ( 3 3%3 ( 3 33 3 3 <<333 7 ' " 史良会 张才全 彭小壮 % 在胃癌组织中表达与临床病理特征的关系 7 中国临床药理学与治疗学 " 董 艳 武卫党 慈小燕 等 型氨基酸转运体 在肿瘤诊断和治疗中的研究进展 7 天津医药 " "" 7 3'3% 3 3 3< 3( < (( 33=3 ( 7 ' " 冯丽丽 林 叶 李庆章 奶牛不同发育时期乳腺组织 % 和 的表达 7 中国乳品工业 陆东林 张丹凤 刘新丽 等 牛奶中的氨基酸含量及其营养价值 7 新疆畜牧业 王俊锋 黄 静 梁国义 泌乳反刍动物乳蛋白合成机理及调控途径研究 7 中国乳业 " ( +3 & 3 =3=3 3 ( 3 3 3 3 3 < ( (3 <3( 7 " +(3 * 3< 3(33 ( 33 7 + 3 + &; & 3%

期 邢伟楠等 型氨基酸转运载体 对奶牛乳腺中 酪蛋白表达的影响 "" 33 3 (333<3% 3 ( (3 3 7 ' " " 林 叶 胡红柳 侯晓明 小鼠乳腺发育泌乳过程中 型氨基酸转运载体 的表达研究 7 中国畜牧兽医 % (;F % ; 3 ( %<(3 3 3((( 33 7 " """ " +'' 3 3 < 3(3 3 3=3 ((( 33<(7 " 马 婧 谭 毅 谭冬梅 等 氨基酸转运载体 % 对小鼠胎盘早期建立的影响 7 中国实验动物学报 "" ' 3''% 3( 3 <3 ( 33 3 ( 3=<''% 3 < 337/ """ 7( ; 3 3 <(3 33 < ( (( 3 37 " ' 3&3 - ( % 3 3 33<3 3 ( (3 3 +"< 333 3( 3( 7+ " ' 3&(( 33 <( ( 3(3 3 3 3 < (( 3 37 " " &3 ' %B 3%'& 3 3%3 33 ( (3(3=37 " " 3 ' G &+ + <(<(3 37 " " " 责任编辑 姚倩倩