ICS 67.100.10 C 中华人民共和国食品安全国家标准 GB 代替 GB/T 5413.9 1997 婴幼儿食品和乳品中维生素 A D E 的测定 Determination of vitamin A, D, E in foods for infant and young children, raw milk and dairy products ( 征求意见稿 ) - - 发布 - - 实施 中华人民共和国卫生部 发布
前 言 本标准代替 GB/T 5413.9 1997 婴幼儿配方食品和乳粉维生素 A D E 的测定 本标准与 GB/T 5413.9 1997 相比, 主要变化如下 : 抗氧化剂由原来的焦性没食子酸改为抗坏血酸 将处理方法中的加热回流改为恒温皂化操作 增加了标准溶液的校正 将原有的单点定量改为标准曲线法 增加了维生素 D 回收率的测定 将计算公式进行修改 本标准附录 A 为规范性附录, 附录 B 为资料性附录 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 : GB 5413 1985 GB/T 5413.9 1997 I
婴幼儿食品和乳品中维生素 A D E 的测定 1 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素 A D E 的测定方法 本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素 A D E 的测定 本标准检出限 : 维生素 A 为 10µg/Kg 维生素 E 为 100µg/Kg 维生素 D 为 2.0µg/Kg 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件, 其随后所有的 修改单 ( 不包括勘误的内容 ) 或修订版均不适用于本标准, 然而, 鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件, 其最新版本适用于本标准 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样皂化后, 经石油醚萃取, 维生素 A E 用反相色谱法分离, 外标法定量 ; 维生 D 用正相色谱法净化后, 反相色谱法分离, 外标法定量 4 试剂和材料 除非另有规定, 本方法所用试剂均为分析纯或以上规格, 水为 GB/T 6682 规定的三级水 4.1 α 淀粉酶 : 酶活力 1.5U/mg 4.2 无水硫酸钠 4.3 异丙醇 : 色谱纯 4.4 维生素 C 的乙醇溶液 :15g/L 4.5 氢氧化钾溶液 : 称取固体氢氧化钾 100g, 用 50mL 水溶解 4.6 石油醚 : 沸程 30~60 4.7 甲醇 : 色谱纯 4.8 正己烷 : 色谱纯 4.9 环己烷 : 色谱纯 4.10 乙醇 : 色谱纯 4.11 维生素 A D E 标准溶液 4.11.1 维生素 A 标准储备液 ( 以视黄醇计 ), 浓度为 100μg/mL 精确称取 10mg 的维生素 A 标准品, 用乙醇 (4.10) 溶解并定容于 100mL 棕色容量瓶中 4.11.2 维生素 E 标准储备液 ( 以 α- 生育酚计 ), 浓度为 500μg/mL 精确称取 50mg 的维生素 E 标准品, 用乙醇 (4.10) 溶解并定容于 100mL 棕色容量瓶中 4.11.3 维生素 D2 标准储备液, 浓度为 100μg/mL 精确称取 10mg 的维生素 D2 标准品, 用乙醇 (4.10) 溶解并定容于 100mL 棕色容量瓶中 4.11.4 维生素 D3 标准储备液, 浓度为 100μg/mL 精确称取 10mg 的维生素 D3 标准品, 用乙醇 (4.10) 溶解并定容于 100mL 棕色容量瓶中 注 : 维生素 A D E 标准储备液均须冷冻保存, 标准工作液现用现配 标准储备溶液用前需校正, 见附录 A 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪 5.2 旋转蒸发器 1
5.3 恒温磁力搅拌器 5.4 氮吹仪 5.5 离心机 : 6000r/min 5.6 电子天平 :±0.1mg 6 分析步骤 6.1 试样处理 : 6.1.1 含淀粉的试样 称取混合均匀的固体试样约 5g 或液体试样约 50g( 均精确到 0.1mg) 于 250mL 三角瓶中, 加入 lgα 淀粉酶 (4.1), 固体试样需用约 50mL 45~50 的蒸馏水使其溶解, 混合均匀后充氮, 盖上瓶塞, 置于 60 培养箱内培养 30min 6.1.2 不含淀粉的试样 称取混合均匀的固体试样约 10g 或液体试样约 50g( 均精确到 0.1mg) 于 250mL 三角瓶中, 固体试样需用约 50mL45~50 蒸馏水使其溶解, 混合均匀 6.2 测定维生素 D 的试样需要同时做回收率实验 6.3 待测液的制备 : 6.3.1 皂化 : 于上述处理的试样溶液中加入约 100mL 维生素 C 的乙醇溶液 (4.4), 充分混匀后加 25mL 氢氧化钾溶液 (4.5) 混匀, 放入磁力搅拌棒, 充氮排出空气, 盖上胶塞, 在 50-60 水浴的恒温磁力搅拌器 (5.3) 上搅拌皂化 45 min 后取出立刻冷却到室温 6.3.2 提取 : 将皂化液全部转入 500mL 分液漏斗中, 加入 100mL 石油醚 (4.6), 轻轻摇动, 排气减压然后盖好瓶塞, 室温下震荡约 10 min 后静置分层, 将水相转入另一 500mL 分液漏斗中, 按上述方法进行第二次萃取, 合并醚液, 用蒸馏水洗至中性, 通过无水硫酸钠过滤脱水, 滤液收入 500mL 平底烧瓶中, 于旋转蒸发器上在 40 充氮条件下蒸至近干 ( 绝不允许蒸干 ), 用石油醚转移至 10mL 容量瓶中定容 6.3.3 从上述容量瓶中取 2mL 石油醚溶液放入试管 A 中, 再取 7mL 石油醚溶液放入另一试管 B 中, 置于 40 的氮吹仪中将试管 A 和 B 中的石油醚吹干, 向试管 A 中加 5mL 甲醇 (4.7) 溶解用来测定维生素 A E, 向试管 B 中加 2mL 正己烷 (4.8) 溶解用来测定维生素 D 再将试管 A 和试管 B 以 5000r/min 的速度离心 10min, 取出静置至室温后待测 6.4 测定 6.4.1 维生素 A E 的测定 6.4.1.1 参考色谱条件色谱柱 :C18 柱,250mm 4.6mm,5μ, 或具相近性能的色谱柱 流动相 : 甲醇 (4.7) 流速 :1.0mL/min 波长 : 维生素 A:325nm; 维生素 E:294nm 柱温 :35 进样体积 :20μL 6.4.1.2 维生素 A E 标准曲线的绘制分别吸取维生素 A 标准储备液 (4.11.1)0.50 1.00 1.50 2.00 2.50(mL) 于 50 ml 棕色容量瓶中, 用甲醇定容至刻度混匀 此标准系列工作液浓度分别为 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00(μg/mL) 分别吸取维生素 E 标准储备液 (4.11.2)1.0 2.0 3.0 4.00 5.0(mL) 于 50 ml 棕色容量瓶中, 用甲醇定容至刻度混匀 此标准系列工作液浓度分别为 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0(μg/mL) 分别将维生素 A E 标准工作液注入液相色谱仪中, 得到峰高 ( 或峰面积 ) 以峰高( 或峰面积 ) 为纵坐标, 以维生素 A E 标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素 A E 标准曲线 6.4.1.3 维生素 A E 试样的测定 2
将试液 (6.3.3 中 A 管 ) 注入液相色谱仪中, 得到峰高 ( 或峰面积 ), 查各自标准曲线得到试样溶液中 维生素 A E 的浓度 6.4.2 维生素 D 的测定 6.4.2.1 维生素 D 待测液的净化 a) 参考色谱条件 色谱柱 : 硅胶柱,150 mm 4.6mm, 或具相近性能的色谱柱 流动相 : 环己烷 (4.9) 与正己烷 (4.8) 按体积比 1:1 混合, 并按体积分数 0.8% 加入异丙醇 (4.3) 流速 :1mL/min 波长 :264nm 柱温 :35 进样体积 :500μL b) 将 50μL 标准维生素 D 溶液 ( 此标用正己烷溶解 ) 注入液相色谱仪中测定, 确定维生素 D 保留时间, 然 后将 500μL 试样溶液 (6.3.3 中 B 管 ) 注入液相色谱仪中, 根据维生素 D 标液保留时间收集待测液于试管 C 中 将试管 C 置于 40 条件下的氮吹仪中吹干, 取出准确加入 1.0mL 甲醇 (4.7) 溶解, 即为维生素 D 待 测液 6.4.2.2 维生素 D 待测液的测定 a) 参考色谱条件 色谱柱 :C18 柱,250mm 4.6mm,5μ, 或具相近性能的色谱柱 流动相 : 甲醇 (4.7) 流速 :1mL/min 柱温 :35 波长 :264nm 进样体积 :100μL b) 标准曲线的绘制 分别吸取维生素 D2( 或 D3) 标准储备液 (4.11.3 4.11.4)0.20 0.40 0.60 0.80 1.00(mL) 于 100 棕色容量瓶中, 用甲醇定容至刻度混匀 此标准系列工作液浓度分别为 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000(μg/mL) 分别将维生素 D2( 或 D3) 标准工作液注入液相色谱仪中, 得到峰高 ( 或峰面积 ) 以峰高( 或峰面积 ) 为纵坐标, 以维生素 D2( 或 D3) 标准工作液浓度为横坐标分别绘制标准曲线 c) 维生素 D 试样的测定吸取维生素 D 待测液 (6.4.2.1 中 C 管 )100μL 注入液相色谱仪中, 得到峰高 ( 或峰面积 ), 查标准曲线得到维生素 D 待测液中维生素 D2( 或 D3) 的浓度 维生素 D 回收率测定结果记为回收率系数 k 代入测定结果计算公式 (7.1.2 公式 (2)), 对维生素 D 含量测定结果进行校正 7 结果计算和表示 7.1 维生素 A 的计算 : 试样中维生素 A 的含量 X, 单位为国际单位每百克 (IU/100g), 按 (1) 计算 X cs 10 / 2 5 3.33 100 = (1) m 式中 : C s 从标准曲线得到的维生素 A 待测液的浓度, 单位为微克每毫升 (μg/ml); m 试样的质量, 单位为克 (g); 3
3.33 微克转换成国际单位的系数 计算结果要求维生素 A 表示到小数点后一位 7.2 维生素 D 的计算 : 试样中维生素 D2( 或 D3) 的含量 X, 单位为国际单位每百克 (IU/100g), 按 (2) 计算 X c = s 10 / 7 2 2 40 100 m k (2) 式中 : C s 从标线得到的维生素 D2( 或 D3) 待测液的浓度, 单位为微克每毫升 (μg/ml); m 试样的质量, 单位为克 (g); k 回收率系数 ; 40 微克转换成国际单位的系数 注 : 试样中维生素 D 的含量以维生素 D2 和 D3 的含量总和计 计算结果要求维生素 D 表示到小数点后一位 7.3 维生素 E 的计算 : 试样中维生素 E 的含量 X, 单位为国际单位每百克 (IU/100g), 按 (3) 计算 X = c s 10 / 2 5 1.01 100 m 1000 (3) 式中 : C s 从标准曲线得到的维生素 E 待测液的浓度, 单位为微克每毫升 (μg/ml); m 试样的质量, 单位为克 (g); 1.01 毫克转换成国际单位的系数 计算结果要求维生素 E 表示到小数点后两位 8 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值, 维生素 A E 不得超过算术平均值的 5%, 维生素 D 不得超过算术平均值的 10% 4
附录 A ( 规范性附录 ) 标准溶液浓度校正方法 GB 维生素 A D E 标准储备液配制后需要进行校正, 具体操作如下 : 分别取维生素 A D E 标准储备液若干微升, 分别注入至含有 3.00ml 乙醇的比色皿中, 根据给定波长测定各维生素的吸光值, 按下表 1 给定的条件进行测定, 通过下列公式计算出该维生素的浓度 表 1 加入标准储备液的量标准品 (μl) 比吸光系数 1% E cm 波长 λ (nm) 视黄醇 (A) V 1835 325 α- 生育酚 (E) V 71 294 麦角钙化甾醇 (D2) V 485 264 胆钙化醇 (D3) V 462 264 浓度计算按下式 : A 1 3.00 C = E 3 100 V 10 式中 : C 维生素 A D E 浓度, 单位为克每毫升 (g/ml); A 维生素 A D E 的平均紫外吸光值 ; V 加入标准储备液的量, 单位为微升 (ul); E A D E 维生素 1% 比色光系数 ; 3.00 标准储备液稀释倍数 3 V 10 5
附录 B ( 资料性附录 ) 标准品及试样色谱图 GB 0.030 0.025 0.020 维生素 A - 5.158 0.015 0.010 0.005 0.000 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 图 B.1 维生素 A 标准品色谱图 0.040 0.035 0.030 0.025 维生素 A - 5.169 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 图 B.2 试样的维生素 A 色谱图 0.018 0.016 0.014 0.012 0.010 0.008 0.006 维生素 E - 14.059 0.004 0.002 0.000 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 图 B.3 维生素 E 标准品色谱图 6
0.030 0.025 0.020 0.015 维生素 E - 14.044 0.010 0.005 12.138 0.000 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 图 B.4 试样的维生素 E 色谱图 0.0018 0.0016 0.0014 0.0012 0.0010 0.0008 0.0006 0.0004 维生素 D3-11.486 0.0002 0.0000-0.0002-0.0004-0.0006-0.0008 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 图 B.5 维生素 D3 标准品色谱图 0.0032 0.0030 0.0028 0.0026 0.0024 0.0022 0.0020 维生素 D2-10.384 0.0018 0.0016 0.0014 0.0012 0.0010 0.0008 0.0006 0.0004 0.0002 0.0000 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 图 B.6 维生素 D2 标准品色谱图 7
0.010 0.008 0.006 0.004 维生素 D3-11.527 0.002 12.568 0.000-0.002 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 图 B.7 试样的维生素 D 试样色谱图 8