第 7 卷 第 期 05 年 月 Journal 黑 of 龙 Heilongjiang 江八一 Bayi 农垦 Agricultural 大学学 University 报 7():6~68 Feb. 第 7 05 卷 doi:0.969/j.issn.00-090.05.0.05 超声波辅助提取分离菠菜色素的工艺研究 黄飞, 屈飞强, 任晓琼 ( 黄山学院化学化工学院, 黄山 50) 摘要 : 利用超声波辅助法提取菠菜中的色素, 通过单因素实验和正交试验探索了提取剂 料液比 提取温度 超声波时间和超声波功率对提取效果的影响, 得到了提取菠菜色素工艺的最优条件 实验结果表明, 以乙醇与丙酮混合液 ( 体积比为 ) 为提取剂, 料液比为 5(g ml - ), 提取温度为 50, 超声波时间为 0 min, 超声波功率为 80 W, 菠菜色素的产率为 0.87 mg g - 根据胡萝卜素 叶黄素 叶绿素极性不同, 用层析柱法分离菠菜色素, 既能达到很好的分离效果, 又能循环利用溶剂 关键词 : 菠菜色素 ; 超声波 ; 叶绿素 ;β- 胡萝卜素 ; 叶黄素中图分类号 :O69. 文献标识码 :A 文章编号 :00-090(05)0-006-05 Study Technology of Ultrasonic-assisted Extraction and Separation of the Spinach Pigment Huang Fei,Qu Feiqiang,Ren Xiaoqiong (College of Chemistry and Chemical Engineering,Huang Shan University,Huang Shan 50) Abstract:Pigment was extracted from the spinach leaves by the of ultrasonic-assisted method,and the effects of extracting reagent, the ratio of material to fluid,extraction temperature,ultrasonic time and power were studied by the single factor experiment and orthogonal test. The result showed that the best extraction conditions of spinach pigment was follows:ethanol and acetone(volume ratio of ) as the extracting reagent,the ratio of material to fluid 5 (g ml - ),extraction temperature 50,ultrasonic power 80 W and ultrasonic time 0 min,and the yield of spinach pigment was up to 0.87mg g -. According to the different polarities of the carotene,lutein and chlorophyll,spinach pigment was separated by chromatography column,which could achieve a good separation effect and the solvent was recycled. Key words:spinach pigment;ultrasonic wave;chlorophyll;β-carotene;lutein 菠菜又称为赤根菜 鹦鹉菜和波斯草, 含有丰富的蛋白质 碳水化合物 维生素 A B C 磷 铁和钙等 [] 营养素物质, 还含有叶绿素 胡萝卜素和叶黄素等 [] 多种天然色素, 对人体具有较好的生理学作用 叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂, 主要以叶绿素 a 和叶绿素 b 两种形式存在, 叶绿素及其钠盐具有杀菌 除臭 解热 止血等功能, 被广泛应用于 [] 食品 医药卫生和日用化学工业 胡萝卜素具有三种异构体, 其中 β- 胡萝卜素除具有维生素 A 的生理活性外, 还具有抗氧化作用, 清除体内自由基, 提高人体免疫力, 延缓细胞和机体的衰老, 广泛应用于食 [] 品 医药 化妆品及饲料添加剂等方面 叶黄素是一 种类胡萝卜素, 是天然的食品色素和食品营养剂, 具 [5] 有抗氧化 抗衰老和抗突变等生物活性 我国菠菜资源丰富, 营养价值高, 具有较大的开发利用价值 [6-] 采用超声波辅助提取方法对菠菜色素进行提取, 通过单因素实验和正交试验研究了提取剂 料液比 提取温度 超声波功率和超声波时间对提取效果的影响, 并利用柱层析法对菠菜色素进行分离 实验部分. 主要仪器 KQ-00KDE 型高功率数控超声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司 );UV-00 紫外可见分光光度 收稿日期 :0-06-0 基金项目 : 国家级大学生创新创业训练计划项目 (007500); 安徽省大学生创新创业训练计划项目 (AH007507) 作者简介 : 黄飞 (98-), 男, 助教, 安徽师范大学毕业, 现主要从事有机化学方面的教学与研究工作
第 期 黄飞等 : 超声波辅助提取分离菠菜色素的工艺研究 65 计 ( 北京瑞利分析仪器有限公司 );SHZ-D(Ⅲ) 循环水式真空泵 ( 巩义市予华仪器有限责任公司 ); 电子分析天平 ( 梅特勒 - 托利多仪器 ( 上海 ) 有限公司 ); RE-5AA 型旋转蒸发仪 ( 上海亚荣生化仪器厂 ); 层析柱 (0 cm). 原料和试剂市售菠菜 ;95% 乙醇, 无水乙醇, 丙酮, 氢氧化钠, 石油醚 (~90 ) 等均为分析纯 ; 柱层析使用 00~ 00 目柱层析硅胶 ( 青岛海洋化工厂生产 ) 实验方法准确称取一定量新鲜干净切碎的菠菜叶, 置入洁净干燥的锥形瓶中, 在锥形瓶中加入一定量和一定浓度的提取剂, 使之混合均匀后, 把锥形瓶置于超声波清洗器的浴槽中, 一定温度下进行超声波震荡提取一定时间 用循环水式真空泵将超声震荡后混合溶液进行固液分离, 收集提取液, 取 0.5 ml 提取液用提取剂稀释定容到 5 ml, 用紫外可见分光光度计测其 λ max =0 nm 处吸光度 A, 根据下列公式计算菠 [] 菜色素的产率 C(mg ml - )= 菠菜色素吸光度 A 0 / 吸收系数菠菜色素的产率 = [C (mg ml - ) 提取液总量 (ml)]/ 样品鲜重 (g) 将提取液用旋转蒸发仪进行浓缩, 根据胡萝卜素 叶黄素 叶绿素极性不同, 用柱层析法分离菠菜色素 向层析柱内加入高度为 ~ cm 体积比为 0 的石油醚 - 丙酮混合液作为洗脱剂, 打开玻璃阀让洗脱剂逐滴流出, 当第 个有色成分滴出时, 取一洁净锥形瓶收集, 得橙黄色溶液为 β- 胡萝卜素 将体积比为 5 的石油醚 - 丙酮混合液作为洗脱剂, 继续洗脱可得到第 个色带的棕黄色溶液为叶黄素 再将体积比为 的石油醚 - 丙酮混合液作为洗脱剂, 可以依次得到叶绿素 a( 蓝绿色 ) 和叶绿素 b( 黄绿色 ) [-5], 最终实现 β- 胡萝卜素 叶黄素 叶绿素 a 和叶绿素 b 的分离 结果与讨论. 单因素实验.. 提取剂对提取菠菜色素的影响称取.0 g 新鲜干净的菠菜叶分别置于 0 ml 的水 0.%NaOH 5%NaOH 丙酮 95% 乙醇 混合液 A( 乙醇 : 石油醚 =, 体积比 ) 混合液 B( 乙醇 : 丙酮 =, 体积比 ) 中, 在室温条件下, 用超声波清洗器处理 0 min 取 0.5 ml 提取液, 用 95% 乙醇稀释定容到 5 ml, 用紫外可见分光光度计测其 λ max =0 nm 处吸光度 A, 计算菠菜色素的产率, 实验结果如表 所示 表 不同提取剂对提取效果的影响 Table Effects of different extracting reagent on extraction result 提取剂 水 0.%NaOH 5%NaOH 丙酮 95% 乙醇 混合液 A 混合液 B 产率 /mg g - 0.0 0.068 0. 0.9 0.97 0.8 0. 由表 可知, 不同的提取剂其提取效果差异较大, 混合液要比单一溶剂的提取效果好, 混合液从菠菜叶片中直接提取色素效率明显提高, 这是一种协 [6] 萃现象 根据实验结果, 选择混合液 B( 乙醇 : 丙酮 =, 体积比 ) 为提取剂时, 提取液的吸光度最大, 菠菜色素的产率最高, 因此选择混合液 B 为提取剂效果较好.. 料液比对提取菠菜色素的影响称取.0 g 新鲜干净的菠菜叶于锥形瓶中, 分别加入 9 5 8 ml 的混合液 B( 乙醇 : 丙酮 =, 体积比 ), 在室温条件下, 用超声波清洗器处理 0 min 取提取液 0.5 ml, 用混合液 B 稀释定容到 5 ml, 用紫外可见分光光度计测其 λ max =0 nm 处吸光度 A, 计算菠菜色素的产率, 实验结果如表 所示 表 液料比对提取效果的影响 Table Effects of the ratio of material to fluid on extraction result 液料比 / g ml - 5 6 7 产率 / mg g - 0.076 0.09 0.0 0.086 0.075 由表 可知, 不同的料液比对提取效果有明显 的影响 在提取过程中, 当包容固体的溶液的溶质浓
66 第 7 卷 [] 度和浸出液溶质浓度相等时, 提取达到平衡 当料液比较小时, 菠菜色素浸出液的吸光度较小, 产率较低, 当料液比为 5 时, 吸光度达到最大, 菠菜色素的产率最高 随料液比的增加, 菠菜色素的产率反而减小, 因此选择料液比为 5 时提取效果较好.. 提取温度对提取菠菜色素的影响称取.0 g 新鲜干净菠菜叶于锥形瓶中, 加入 5 ml 混合液 B( 乙醇 : 丙酮 =, 体积比 ), 保持料液比为 5(g ml - ), 分别在 0,0,50,, 70 下, 用超声波清洗器处理 0 min 后, 取提取液 0.5 ml, 用混合液 B 稀释定容到 5 ml, 用紫外可见分光光度计测其 λ max =0 nm 处吸光度 A, 计算菠菜色素的产率, 实验结果如表 所示 Table 提取温度 / 0 产率 / mg g - 0.05 表 提取温度对提取效果的影响 Effects of extraction temperature on extraction result 0 50 0.7 0. 0. 70 0.099 由表 可知, 不同的提取温度对提取效果有明显的影响 当提取温度较低时, 菠菜色素浸出液的吸光度较小, 产率较低, 当提取温度为 50 时, 吸光度达到最大, 菠菜色素产率最高 随提取温度的增加, 菠菜色素的产率反而减小 这是因为在提取过程中, 随着提取温度的增加, 菠菜色素分子扩散速度加快, 提取剂能更好地溶进其分子中, 使其提取效果更好, 菠菜色素浸出液的吸光度增加, 产率也增加 ; 当提取温度达到一定时, 提取剂在菠菜色素分子中达到饱和, 不能继续溶进其分子中, 菠菜色素浸出液吸光度 减小, 产率降低, 因此选择提取温度为 50 提取效果较好.. 超声波时间对提取菠菜色素的影响称取.0 g 新鲜干净菠菜叶于锥形瓶中, 加入 5 ml 混合液 B( 乙醇 : 丙酮 =, 体积比 ), 保持料液比为 5(g ml - ), 温度为 50, 用超声波清洗器分别处理 5 0 5 75 min 取提取液 0.5 ml, 用混合液 B 稀释定容到 5 ml, 用紫外可见分光光度计测其 λ max =0 nm 处吸光度 A, 计算菠菜色素的产率, 实验结果如表 所示 Table 提取时间 /min 5 产率 /mg g - 0.099 表 超声波时间对提取效果的影响 Effects of ultrasonic extraction time on extraction result 0 5 0. 0.7 0.86 75 0.8 由表 可知, 随着超声波时间的增加, 菠菜色素浸出液吸光度逐渐增加, 产率也逐渐升高, 当超声波时间为 min 时, 菠菜色素浸出液吸光度减小, 产率降低 其原因可能是在超声波辐射的过程中, 超声波能量直接传递到菠菜叶的内部, 使之瞬时加热, 温度急剧上升 超声辐射时间越长, 温度越高, 而菠菜色素对热的稳定性不好, 所以导致菠菜色素的吸光度 [] 减小, 产率降低 因此选择超声波时间为 min 提取效果较好..5 超声波功率对提取菠菜色素的影响称取.0 g 新鲜干净菠菜叶于锥形瓶中, 加入 5 ml 混合液 B( 乙醇 : 丙酮 =, 体积比 ), 保持料液比为 5(g ml - ), 温度为 50, 用超声波清洗器经过功率分别为 0 W W 00 W 0 W 80 W 的超声波处理 min 后, 取提取液 0.5 ml, 用混合液 B 稀释定容到 5 ml, 用紫外可见分光光度计测其 λ max =0 nm 处吸光度 A, 计算菠菜色素的产率, 实验结果如表 5 所示 表 5 超声波功率对提取效果的影响 Table 5 Effects of ultrasonic power on extraction result 超声波功率 /W 产率 /mg g - 0 0.088 0.9 00 0.56 0 0.59 80 0.57 由表 5 可知, 随着超声波功率的增加, 菠菜色素 浸出液吸光度不断增加, 产率逐渐升高 当超声波功
第 期 黄飞等 : 超声波辅助提取分离菠菜色素的工艺研究 67 率为 0 W 时, 菠菜色素浸出液吸光度达到最大, 菠菜色素的产率最高 随着超声波功率的继续增加, 吸光度反而减小, 产率降低 这是因为随着超声功率的增加, 超声的空化作用 机械剪切的搅拌作用随之加 [8] 强, 菠菜细胞充分破裂 当超声波功率过大时, 可能会引起局部溶液瞬时升温过热, 对菠菜色素的结构 [6] 产生影响, 使菠菜色素的构象发生改变, 从而影响菠菜色素的提取效果. 正交试验设计.. 正交试验影响因素的选择根据单因素实验结果, 提取剂 料液比 提取温度 超声波提取时间和超声波功率均会影响菠菜色素的提取, 因此选取这五个因素同时作为考察因素, 其实验的影响因素和水平见表 6 表 6 正交试验因素和水平表 Table 6 Factor-level of orthogonal experiment 水平 A 提取剂 B 料液比 /g ml - 实验因素 C 提取温度 / D 超声波时间 /min E 超声波功率 /W 丙酮 0 0 95% 乙醇 5 0 5 00 混合液 A 6 50 0 混合液 B 7 75 80.. 正交实验结果与讨论为了提高菠菜色素的产率, 考察各实验因素对 提取菠菜色素的影响, 进行了 5 因素 水平 L 6 ( 5 ) 正交试验 其正交试验设计及结果见表 7 表 7 L 6 ( 5 ) 正交试验表及结果 Table 7 Results of orthogonal experimen L 6 ( 5 ) 实验号 A B C D E 产率 /mg g - 0.086 0. 0.5 0.6 5 0.0 6 0.6 7 0.5 8 0. 9 0. 0 0.8 0.7 0. 0.6 0.87 5 0.5 6 0.8 K 0.66 0. 0.7 0. 0.90 K 0.66 0. 0.9 0. 0.96 K 0.0 0. 0.7 0.87 0.90 K 0.77 0. 0. 0. 0.50 k 0. 0. 0. 0.8 0.0 k 0. 0. 0. 0.7 0. k 0.0 0.8 0.9 0.9 0.0 k 0.59 0.7 0.8 0.8 0.50 R 0.07 0.0 0.0 0.009 0.00
68 第 7 卷 表 7 中的 R 为各因素的极差值, 极差值的大小反映了实验因素对提取菠菜色素产率的影响 由极差分析结果可以看出, 以提取菠菜色素产率为考察指标,5 种因素对提取菠菜色素产率的影响程度大小顺序依次为 : 提取剂 (A)> 料液比 (B)> 提取温度 (C)> 超声波功率 (E)> 超声波时间 (D); 因此菠菜色素的最佳提取条件为 :A B C E D, 即以乙醇与丙酮混合液 ( 体积比为 ) 为提取剂, 料液比为 5(g ml - ), 提取温度为 50, 超声波时间为 0 min, 超声波功率为 80 W, 菠菜色素的提取效果最好, 其产率为 0.87 mg g - 结论 () 利用超声波辅助法提取菠菜中的色素, 通过单因素实验和正交试验考察了提取剂 料液比 提取温度 超声波时间和超声波功率对提取效果的影响, 得到了提取菠菜色素工艺的最优条件 实验结果表明, 以乙醇与丙酮混合液 ( 体积比为 ) 为提取剂, 料液比为 5(g ml - ), 提取温度为 50, 超声波时间为 0 min, 超声波功率为 80 W, 菠菜色素的提取效果最好, 其产率为 0.87 mg g - 超声波辅助提取法具有提取速度快 产率高 节约能源 绿色环保等优点, 在天然色素的提取中具有广阔的应用前景 () 根据胡萝卜素 叶黄素 叶绿素极性不同, 以不同体积比的石油醚 - 丙酮混合液作为洗脱剂, 用层析柱法分离了菠菜色素, 既能达到很好的分离效果, 又能循环利用溶剂 参考文献 : [] 舒友琴, 梁丽琴, 扶庆权, 等. 菠菜叶蛋白的提取研究 [J]. 食品科学,005,6(0):-7. [] 翟虎, 陈小全, 孙兆国, 等. 菠菜色素提取方法的改进及稳定性研究 [J]. 食品与发酵工业,008,():57-59. [] 陈正, 刘常坤. 超声波萃取菠菜叶中叶绿素的研究 [J]. 化学与生物工程,00(6):7-8. [] 朱秀灵, 车振明, 徐伟, 等.β- 胡萝卜素生理功能及提取技术的研究进展 [J]. 西华大学学报 : 自然科学版, 005,():7-76. [5] Wang M C,Rong T,Zhang S F,et al. Antioxidant activity, mutagenicity/ anti -mutagenicity,and clastogenicity/ anti - clastogenicity of lutein from marigold flowers [J]. Food Chem Toxicol,006,(9):5-59. [6] 谢宏, 尹梅, 刘镜, 等. 响应面法优化超声波辅助提取红米色素的工艺研究 [J]. 食品工业科技,0,5():7-7. [7] 刘亚敏, 刘玉民, 李琼, 等. 超声波辅助提取山银花绿原酸工艺及其抗氧化性研究 [J]. 食品工业科技,0,5(): 86-90. [8] 曹楠楠, 陈香荣, 吴艳. 苦豆子多糖的超声波提取工艺优化及理化性质研究 [J]. 现代食品科技,0,0():09-5. [9] 廖芙蓉, 阚建全, 熊丽娜. 响应面法优化超声波辅助提取籽粒苋花穗色素工艺 [J]. 食品科学,0,():9-98. [0] 孙海涛, 邵信儒. 响应面法优化超声波提取山核桃壳色素工艺 [J]. 东北林业大学学报,0,0():7-77. [] 孙天宇, 杨宏志. 超声波法提取沙棘叶总黄酮最佳工艺的研究 [J].,0,():5-50. [] 张志良, 翟伟晶. 植物生理学实验指导 [M]. 北京 : 北京高等教育出版社,00. [] 李东颖, 李晓霞, 赵喜芝. 绿色植物色素的提取及理化性质的研究 [J]. 化学工程师,005():6-6. [] 杜莉萍, 商金玲, 王大明, 等. 薄层色谱法分离菠菜色素及胡萝卜素含量测定 [J]. 分子科学学报,0,9(): 8-88. [5] 李玉明, 林琳, 陈坚刚, 等. 薄层色谱法在叶绿体色素分离实验中的有效应用 [J]. 生物学通报,005,0(): 5-5. [6] 洪法水, 魏正贵, 赵贵文. 菠菜叶绿素的浸提和协同萃取反应 [J]. 应用化学,00,8(7):5-55.