吉林农业大学学报 2012,03 Journal of Jilin Agricultural University http://xuebao.jlau.edu.cn E-mail:jlndxb@vip.sina.com 海洋产几丁质酶菌株的筛选及发酵条件优化 张灿, 黄德智, 李丰硕, 王硕, 薛永常 大连工业大学生物工程学院, 大连 116034 摘要 : 通过透明圈法初筛 DNS 复筛, 从大连近海海域的海泥中分离出一株高产几丁质酶的菌株, 经初步鉴定为扩 展短杆菌 (Brevibacterium linens) 采用不同碳源 氮源 温度 ph 值等对培养条件进行了优化及正交试验 结果 表明 : 该菌产酶最适条件是在 28 Ph 7.0 蛋白胨 1 g/l 胶体几丁质 10 g/l 氯化钠 20 g/l 条件下, 几丁质酶活 力可达 0.508 U/mL, 比优化前其产酶活力提高了 9 倍 关键词 : 几丁质 ; 几丁质酶 ; 菌株筛选 ; 优化 中图分类号 :Q93 文献标识码 :A 文章编号 :1000-5684(2012) DOI: 网络出版地址 : http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1100.s.20120312.1338.001.html Studies on the Screening of Chitinase Producing Strain from Ocean and Its Optimization on Fermentation ZHANG Can,HUANG De-zhi,LI Feng- shuo,wang Shuo,XUE Yong-chang School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034,China Abstract: A strain with high productivity of chitinase was screened through transparent circle method from sea mud of Dalian seaside and was identified as species Brevibacterium linens. After medium optimization and orthogonal experiments, which include carbon sources, nitrogen sources, temperature and ph, the chitinase activity was improved. The results showed that the optimized conditions for chitinase production were 1 g/l peptone, 10 g/l Colloidal chitin, the NaCl of 20 g/l,culture at 28 and ph 7.0. Under these conditions the chitinase activity can reach 0.508 U/mL,which was increased 9 folds compared with that of parent strain. Key words: chitin; chitinase; screening; optimization 几丁质 (Chitin) 又称甲壳素, 为世界上含量仅次于纤维素的第二大天然高分子化合物, 其基本组成单位是乙酰氨基葡萄糖 (GlcNAc), 主要来源是海洋甲壳类动物如虾 蟹等, 是海洋环境最重要的营养源和能源, 同时又是我国近海域主要的有机污染源之一 [1-4] 自然界中几丁质的降解主要是通过几丁质酶将几丁质降解成几丁质寡糖和单糖 几丁质及其衍生物是天然高分子聚合物, 具有抗菌 抗癌 抗病毒等药理作用, 被广泛应用于化工 纺织 食品 化妆品 生物医学 污水处理及功能高分子材料等领域 [5-8] 几丁质酶 (chitinase) 是能催化降解几丁质 β-1, 4 糖苷键的水解酶系 目前对几丁质酶的研究有 2 个方向, 一方面对产几丁质酶的理化特征及其生物活性的研究 [9-13] ; 另一方面研究的重点是运用基因工程手段, 通过对产几丁质酶的基因分析, 运用分子克隆方法克隆并高效表达所选菌株的几丁质酶基因, 以实现重组菌的几丁质酶的高效表达 [14-16] 几丁质酶降解几丁质条件温和, 无污染, 具高度特异性, 使其在几丁质高值化利用方面具有巨大的潜力, 但目前产几丁质酶菌株的产酶能力较低, 较难获得大量的专一性的几丁质酶, 使几丁质酶的生产成本过高, 真正应用于实际的并不多 [17] 因此, 开发有广泛应用前景的几丁质酶新酶源具有重要的应用价值 在海洋环境中有着大量几丁质且其降解主要通过微生物完成, 但是由于海洋环境的复杂性和不稳定性, 研究受到一定的局限, 现报道的海洋菌产几丁质酶的研究大多是海洋细菌和真菌 [18-20] 因此, 从海洋环境中筛选能够产生几丁质酶的微生物具有重要的现实意义 本研究从大连海域筛 基金项目 : 辽宁省高校创新团队支持计划项目 (2008T010) 作者简介 : 张灿, 女, 在读硕士, 研究方向 : 微生物技术 收稿日期 :2011-12-19 网络出版时间 : 2012-03-12 13:38 通讯作者
吉林农业大学学报 2012 年 3 月 选得到降解几丁质的菌株 Z-1, 以菌株 Z-1 为材料, 对 其进行生物学鉴定以及产酶条件优化, 旨为丰富产几丁质酶菌的资源, 为几丁质酶的工业化生产奠定初步基础 1. 材料与方法 1.1 试剂与仪器几丁质 ( 合肥博美生物技术有限公司 ), 胶体几丁质参照文献 [14] 自制, 其他均为国产分析纯试剂 高速冰冻离心机 Himac CR-21G( 日本日立公司 ), phs-3c ph 计 ( 上海雷磁泾仪器有限公司 ),722s 可见分光光度计 ( 上海菁华科技仪器有限公司 ), 电热恒温干燥箱 ( 上海跃进医疗器械厂 ),BS200S 电子天平 ( 北京赛多利斯天平有限公司 ) 1.2 泥样 2010-08~2010-11 采集于大连黑石礁海域潮间带不同站位的海泥 1.3 培养基分离培养基 : 胶体几丁质 1g/L,K 2 HPO 4 0.7g/L, KH 2 PO 4 0.3g/L,NaCl5g/L, 蛋白胨 10g/L,MgSO 4 7H 2 0 0.5g/L,FeSO 4 7H 2 O 0.01g/L,ZnSO 4 7H 2 O 0.01g/L, 琼脂 18g/L, 陈海水定容至 1L, 调整 ph 至 7.0,1 10 5 Pa 灭菌 20min ; 种子培养基 : 胶体几丁质 1g/L, K 2 HPO 4 0.7g/L,KH 2 PO 4 0.3g/L,NaCl5g/L, 蛋白胨 10g/L,MgSO 4 7H 2 0 0.5g/L,FeSO 4 7H 2 O 0.01g/L, ZnSO 4 7H 2 O 0.01g/L, 陈海水定容至 1L, 调整 ph 至 7.0,1 10 5 Pa 灭菌 20min; 发酵培养基 : 组成与种子培养基相同 ; 改良肉汤培养基 : 牛肉膏 3g/L, 蛋白 2 结果与分析 胨 10 g/l,nacl 5 g/l, 琼脂 20 g/l, 陈海水定容至 1 L,pH 7.0~7.2,121 灭菌 20 min 1.4 试验方法 1.4.1 菌种筛选和纯化取海洋泥样用平板稀释法 [21] 和透明圈法筛选出产几丁质酶菌株 [22] 1.4.2 菌株的鉴定参考伯杰细菌鉴定手册和常 [23] 见细菌系统鉴定手册, 对菌株进行形态观察与生理生化初步鉴定 1.4.3 培养方法菌种首先接种于液体种子培养基, 28 160r/min 振荡培养 24h; 2% 的接种量接种于发酵培养基, 在 28 160r/min 振荡培养 72h; 收集发酵液,4 8000r/min 离心 20min, 取上清液 ( 粗酶液 ), 用 DNS 法测定酶活力 [24] 1.4.4 几丁质酶活力测定取上清液 1mL 与 1mL 浓度为 10g/L 胶体几丁质混合, 再加入 1mL 磷酸缓冲溶液 (ph7.0 0.2mmol/L),50 下保温 30min, 用 DNS 法测定生成的还原糖的含量 ; 同时以灭活酶液经同样处理后作为空白对照 酶活力单位 (U) 定义 : 在 50, ph7.0 下每分钟产生 1μmol N- 乙酰 -D- 氨基葡萄糖量所需的酶量 1.4.5 发酵产酶条件优化试验在不同碳源 氮源 Na + 温度 ph 条件下, 分别对发酵培养基进行振荡培养一定时间, 测定其几丁质酶活性, 考察在单因素实验下, 不同培养条件对菌株 Z-1 发酵产酶的影响 在单因素优化试验的基础上, 以胶体几丁质 蛋白胨 NaCl 质量浓度为分析因素, 进行 L 9 (3 3 ) 正交试验, 具体因素水平分配如表 1 所示 表 1 正交试验中的因素和水平 Table.1 Factors and levels of orthogonal experiment 水平 Level A 碳源 /( g L -1 ) Carbon sources B 氮源 /(g L -1 ) Nitrogenous sources C 氯化钠 /( g L -1 ) NaCl concentration 1 5 1 5 2 10 2 10 3 15 3 20 2.1 产几丁质酶菌株的筛选与鉴定用胶体几丁质为唯一碳源的选择培养基和透明圈法筛选出产几丁质酶菌株, 选取透明圈直径与菌落直径之比大的菌落 从不同的海泥样品中分离到多株具有明显透明圈的产几丁质酶的细菌, 对其进行分离 纯化 其中 Z-1 菌株产几丁质酶的力最高 菌株在 28 改良肉汤培养基上培养 24h 后,Z-1 菌株呈淡黄色凸起的圆形菌落, 光滑, 湿润 ; 菌落由白变黄, 直径为 2.0~4.0mm 革兰氏阳性菌, 产芽孢 Z-1 菌株细胞呈不规则杆状,0.6~1.2μm 1.5~6.0μm; 不形成菌丝体, 无分支, 细胞表面光滑, 无鞭毛, 不 运动 细胞单个, 成链或不规则群状出现 长时间培养后有时细胞变短, 但没有明显的杆 - 球周期变化 ( 图 1) Z-1 生理生化特征见表 2 根据常见细菌杆菌属检索表初步鉴定认为该细菌为短杆菌属 (Brevibacterium) 的扩展短杆菌 (B.linens) 图 1 电镜下 Z-1 菌株的形态 (1000 ) Fig.1. Transmission electronic micrograph of strain Z-1(1000 ) Journal of Jilin Agricultural University 2012,March
检测试验 Inspection and Test 革兰氏染色 Gram 乙酰甲基甲醇试验 V-P 甲基红试验 M.R 葡萄糖发酵 Glucose oxidase fermentation 淀粉水解 Starch hydrolysis 表 2 Z-1 的生理生化特征 Table.2The biochemical-physiological features of Z-1 结果 Result 王灿等 : 海洋产几丁质酶菌株的筛选及发酵条件优化 检测试验 Inspection and Test + 运动性 _ Sports 接触酶 Catalase - 60 生长 产酸不产气 2.2 发酵条件研究 2.2.1 不同碳源对菌株 Z-1 产几丁质酶的影响分 别以 10g/L 的葡萄糖 蔗糖 可溶性淀粉 几丁质 胶体几丁质 胶体几丁质 +0.1% 葡萄糖, 作为碳源进 行液体发酵培养, 测定产几丁质酶活力, 以最高酶活为 100% 绘制图结果见图 2 60 growth 明胶液化 Gelatin liquefaction - 氧化酶 Oxidase 结果 Result 测定发酵液的酶活力, 以最高酶活为 100% 绘制图, 结果如图 4 所示 - + - + - 图 3 胶体几丁质的浓度对产酶的影响 Fig.3. Effects of different colloidal chitin concentrations on chitinase production 图 2 不同碳源对产酶的影响 Fig.2. Effects of different carbon sources on chitinase production 从图 2 可以看出, 该菌以胶体几丁质为碳源时产酶活力最大 以几丁质和胶体几丁质为碳源时, 该菌株产几丁质酶量相当 其次为胶体几丁质 +0.1% 葡萄糖 蔗糖 淀粉 葡萄糖作为碳源均未测出酶活, 葡萄糖可能对几丁质酶的表达有抑制作用 从而表明该菌株所产几丁质酶是一种诱导酶, 产酶需要几丁质或者几丁质类似底物诱导作用下进行的, 进一步研究不同浓度的胶体几丁质对菌株产酶的影响, 结果如图 3 所示 碳源浓度对菌体的生长和产酶有一定的影响, 当碳源浓度为 15g/L 时相对酶活力最大, 当胶体几丁质的浓度 >15g/L, 发酵液的酶活降低 由于碳源浓度过高或过低均不利于微生物生长, 产酶活力也均相应下降, 可能是由于胶体几丁质的分解产物不利于菌株 Z-1 的发酵产酶 2.2.2 不同氮源对菌产酶的影响在发酵培养基中, 分别以 1 g/l 的硫酸铵 硝酸钾 硝酸铵 牛肉膏 酵母粉 蛋白胨 尿素作为氮源, 进行液体发酵培养, 图 4 不同氮源对产酶的影响 Fig.4. Effects of different nitrogenous sources on chitinase production 氮源是决定微生物生长好坏的直接因素, 是组成核酸和蛋白质的重要元素 由图 4 可见, 硫酸铵 硝酸钾 硝酸铵 牛肉膏 酵母粉 蛋白胨 尿素作为氮源对菌株 Z-1 产酶活力影响较大, 以 1g/L 的蛋白胨作为氮源时, 菌株 Z-1 产几丁质酶活力最高, 所以选择蛋白胨作为氮源 不同质量浓度的蛋白胨浓度对产酶的影响如图 5 所示, 当蛋白胨浓度为 2g/L 时酶活力最大, 增大或减少蛋白胨浓度, 酶活力都会下降 吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
吉林农业大学学报 2012 年 3 月 图 5 不同浓度蛋白胨对产酶的影响 Fig.5. Effects of different concentrations of peptone on chitinase production 2.2.3 NaCl 浓度对产酶的影响配制成 NaCl 浓度分 别为 0 5 10 20 30 40 50g/L 的发酵培养基, 进行液体发酵培养, 测定发酵液的酶活力, 以最高酶活为 100% 绘制图, 结果如图 6 所示 图 7 培养温度对产酶的影响 Fig.7. Effects of cultivation temperature on chitinase production 由图 7 可知, 不同培养温度下, 酶活力曲线起伏明显, 只有在适宜的温度下, 菌体才能较好的生长和产酶 在 16~28,Z-1 菌株产酶能力随温度升高而增加 ; 在 28~32, 发酵液酶活力较高,28 发酵液酶活力最高, 此温度有利于几丁质酶的产生和积累故出现酶活力的最大值, 当培养温度 >32 时酶活力下降明显 2.2.5 培养基起始 ph 值对产酶的影响将发酵液体培养基的 ph 分别调至 5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 后在最适温度下进行液体发酵培养, 测酶活, 以最高酶活为 100% 绘制相对酶活曲线 由图 8 可见 : 菌株 Z-1 发酵产酶的 ph 范围广, 在 ph5.5~8.0 都有较高的产酶能力, 在 ph7.0 时产几丁质酶活力最大 图 6 氯化钠质量浓度对产酶的影响 Fig.6. Effects of NaCl concentration on chitinase production 从菌株 Z-1 在不同 NaCl 浓度的培养基中产酶能力的变化情况来看, 其产酶能力受环境中 NaCl 浓度的影响较大, 验证了海洋微生物对 Na + 有依赖的特征 菌 Z-1 在无 Na + 的培养基中基本不生长, 在氯化钠浓度 <50g/L 环境下均能产酶 ; 菌株在 NaCl 浓度较低时随着浓度的增大产酶趋势逐渐增大, 当浓度为 20g/L 时产酶活力最大, 而随着浓度继续升高其产酶能力明显下降 因此, 菌种 Z-1 筛选至海洋环境, 必需考虑到 Na+ 浓度的改变对菌体生长的影响 2.2.4 培养温度对产酶的影响分别在 16,24,28, 30,32,37 的培养箱中液体发酵培养, 测定发酵液的酶活力, 以最高酶活为 100% 绘制相对酶活曲线, 如图 7 所示 表 3 正交试验结果与分析 Table3. Result of orthogonal experiment 图 8 ph 对产酶的影响 Fig.8.Effects of ph value on chitinase production 2.2.6 菌株 Z-1 产酶条件的优化考虑到菌株 Z-1 是海洋微生物以及上述各单因素实验, 设计了 L 9 (3 4 ) 正交实验 正交试验的结果和分析见表 3 和表 4 试验号 Test No. A B C D 酶活 /(U ml -1 ) Enzyme activity 1 1 1 1 1 0.07 2 1 2 2 2 0.139 3 1 3 3 3 0.105 4 2 1 2 3 0.437 Journal of Jilin Agricultural University 2012,March
王灿等 : 海洋产几丁质酶菌株的筛选及发酵条件优化 5 2 2 3 1 0.502 6 2 3 1 2 0.193 7 3 1 3 2 0.349 8 3 2 1 3 0.090 9 3 3 2 1 0.093 Ⅰ j 0.105 0.215 0.118 0.222 Ⅱ j 0.377 0.244 0.223 0.227 Ⅲ j 0.177 0.130 0.319 0.211 R 0.272 0.155 0.201 0.016 优水平 A2 B2 C3 Excellent level S j 0.118 0.038 0.061 0.001 由表 3 可见, 菌株 Z-1 培养基的最佳组合为 A 2 B2C 3, 即菌株 Z-1 的最佳培养基为 : 胶体几丁质 10g/L, 蛋白胨 2g/L,NaCl 20g/L 根据极差 R 值得出, 各因素对菌体浓度的影响大小为 : 胶体几丁质 >NaCl 浓度 > 蛋白胨含量 在此条件下酶活力为 0.508 U/mL, 比优化条件前的产酶活力 0.049 U/mL 提高了约 9 倍 3 讨论 本研究从大连近海资源中筛选高产几丁质酶的菌株, 并对其进行了生物学鉴定和发酵条件优化, 为丰富产几丁质酶菌的资源和几丁质的工业化生产提供一定理论基础 从获得纯培养的 30 多株海洋微生物菌株中筛选到 6 株产几丁质酶的菌株, 经复筛 酶活测定比较获得一株透明圈最大 较稳定的海洋细菌 Z-1 根据菌株和菌落的形态以及生理生化特征, 初步鉴定海洋细菌 Z-1 符合短杆菌属 (Brevibacterium) 扩展短杆菌种 (B.linens) 的一般特征 本次研究只对海洋细菌 Z-1 的分离筛选和特征做了初步研究, 对菌株从分子层面的鉴定研究和发酵生理及其开发应用等方面有待研究 在以往多数报道中细菌产几丁质酶的最适温度大都约为 30, 菌株 Z-1 最适产酶温度稍低 ; [17] 吴根福等分离到黏质沙雷氏菌, 产酶适宜温度为 [25] 37, 邱立友等分离到的链霉菌 A048, 产几丁质酶的最适温度为 30 通过单因子试验和正交试验优化, 各因素对产酶的影响大小依次为碳源 > 盐度 > 氮源, 同时菌株 Z-1 产几丁质酶能力得到了显著提高, 由于在以往的报道中几丁质酶活的定义不统一, 如果以在最适反应条件下每分钟产生 1μmol N- 乙酰 -D- 氨基葡萄糖量所需的酶量为 1 U, 则菌株 Z-1 发酵液的几丁质酶酶活最高为 [26] 0.508 U/mL 该数值高于尹璐等分离得到的 B-25 菌株的产几丁质酶活 (0.430 U/mL), 也高于孙菽蔚等 [20] 报道的 SS01 菌株假交替单胞菌产几丁质酶活 (0.032 U/mL) 吉林农业大学学报 参考文献 : Journal of Jilin Agricultural University [1] Rinaudo M.Chitin and chitosan:properties and applications[j].progress In Polymer Science,2006,31:603-632. [2] 蒋挺大. 甲壳素. 北京 : 化学工业出版社,2003.2-3. [3] 李丽, 杨雪松, 刘红全. 微生物几丁质酶的特性及其应用的研究进展 [J]. 广西民族大学学报 : 自然科学版,2011,17(1):92-96. [4] 薛惠琴, 孙国荣, 杭怡琼. 浅谈虾仁生产废弃物的开发利用 [J]. 上海畜牧兽医通讯, 2009(2):105. [5] Jayakumar R, Prabaharan M,Sudheesh Kumar P T, et al.biomaterials based on chitin and chitosan in wound dressing applications[j].biotechnology Advance,2011,29:322-337. [6] Kumar M N V R. A review of chitin and chitosan applications[j]. Reactive & Functional Polymers,2000,46:1 27. [7] 夏文水, 吴炎楠. 甲壳素 / 壳聚糖水解酶的研究进展 [J]. 中国海洋药物, 1997, 16(2): 31-35. [8] Jayakumar R, Prabaharan M, Sudheesh Kumar P T,et al. Biomaterials based on chitin and chitosan in wound dressing applications[j]. Biotechnology Advance,2011,29:322-337. [9] 王伟霞, 李福后. 海洋真菌 HZ-01 菌株产几丁质酶的研究 [J]. 安微农业科学,2008,36(4):1330-1331,1334. [10] 孙胜利, 喻子牛, 贾新成. 影响灰褐链霉菌 S100I 产碱性几丁质酶的因 [J]. 中国病毒学, 杀虫徽生物专刊,2000,15:258-260. [11] 李静, 刘建军, 赵祥颖. 一株产几丁质酶菌株的筛选及其产酶条件的研究进展 [J]. 工业微生物,2007,37(3):44-47. [12] 王治伟, 刘志敏. 微生物几丁质酶研究进展 [J]. 生物技术通讯,2006,3(17):439 442. [13] 肖湘, 周樱, 王风平. 高效几丁质降解菌 CB101 的分离 鉴定及其几丁质酶系的研究 [J]. 海洋学报,2003, 25:(1)138-142. [14] 陈红. 广谱抗病虫几丁质酶产生菌的筛选与几丁质酶分子生物学研究 [D]. 雅安 : 四川农业大学,2002:4-5. [15] 王治伟. 酿酒酵母几丁质酶在毕赤酵母中的克隆表达和活性鉴定 [D]. 北京 : 中国人民解放军军事医学科学院,2006. [16] Park J K, Taxashi O. Molecular cloning, nucleotide sequencing, and regulation of the chia gene encoding one of chitinases from Enterobacter sp. G-1[J]. Fermentation and Bioengineering, 1997, 84(6): 493-501. [17] 吴根福, 杨志坚. 几丁质降解酶产生菌的分离及其产酶条件的初步研究 [J]. 浙江大学学报 : 农业与生命科学版,2002,28(6):641-645. [18] 杨承勇, 周世宁, 周毅频, 等. 海洋细 11211 的生长条件及其几丁质酶研究 [J]. 中山大学学报 : 自然科学版,2000,39(6):91-94. [19] 苏广宇, 李从发, 高阳, 等. 产几丁质酶海洋细菌的筛选及发酵条件的优化 [J]. 中国新药杂志,2008 17(17):1503-1506.
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