第六章 抗体制备技术 摘要 抗体是抗原诱导产生并能与之发生特异性结合的免疫球蛋白 实验室可以制备抗体并可用其检测相应的抗原物质, 尤其是病原微生物 抗体最早是作为药物用于传染性疾病的治疗 现代制备抗体的方法以及抗体的应用范围不断拓展, 按抗体制备方法可把其分为多克隆抗体 单克隆抗体和基因工程抗体 多克隆抗体是通过抗原免疫动物并从免疫动物的血清中获得 ; 单克隆抗体是采用细胞工程技术将分泌抗体的 B 淋巴细胞与瘤细胞融合, 通过筛选而获得单细胞克隆分泌的抗体 ; 基因工程抗体是通过基因工程技术改造鼠源抗体使之人源化或制备 Fab V H /V L 等一系列抗体片段, 并以基因表达产生的方式获得抗体与生物活性物质的融合物 采用抗体库技术可以直接从人抗体库中筛选获取人源抗体 多克隆抗体和单克隆抗体可以用于治疗, 但更多用于实验诊断 ; 基因工程抗体主要用于疾病治疗, 尤其是自身免疫病 肿瘤 移植排斥等重大疾病的治疗 抗体制备技术尤其是人源抗体制备技术中也还存在着一些技术问题 抗体是机体经抗原刺激后产生并能与抗原发生特异性反应的一种免疫球蛋白 抗原, 尤其是病原性抗原, 主要以自然感染的形式刺激机体产生抗体, 我们也可以通过人工免疫的方式用抗原刺激机体产生抗体 最早以人工免疫方式制备抗体的目的是以抗体作为生物药物用于治疗 预防传染性疾病, 现今制备抗体的目的不仅为了用于防治传染性疾病, 还为了用于诊断疾病, 更企望治疗一些通过常规方法难以治愈的疑难病症, 如自身免疫性疾病 肿瘤等 根据抗体不同的用途, 在实验室里可以制备不同性质的抗体, 包括多克隆抗体 单克隆抗体 基因工程抗体等, 这些抗体分别被称为第一代抗体 第二代抗体 第三代抗体 145
第二部分免疫学基本技术 第一节多克隆抗体制备技术 一 多克隆抗体制备的原理抗原按一定程序 一定剂量经皮肤 肌肉 淋巴结 血液循环等途径注入动物, 动物体内就会产生抗体, 这一过程称动物免疫 动物经免疫后所产生的抗体主要存在于血清中, 通过抽取免疫动物的血液 分离血清, 即可得到抗体 这是制备多克隆抗体的基本方法 用于免疫动物的抗原可以预先纯化, 但即使纯度达到只有一种抗原成分时, 其所产生的相应抗体也可能包含多种针对同一抗原不同抗原表位的一系列亲和力不同的混合抗体, 故称为多克隆抗体 (polyclonal antibodies,pcab), 简称多抗 因为抗体存在于血清之中, 也可称为抗血清 (antiserum) 欲制备高质量的多克隆抗体, 要求采用纯度高 免疫原性强的抗原, 选择健壮的动物, 以及采用一套行之有效的免疫方案 多克隆抗体的特点有 :1 制备方便, 操作简单, 可大量产生 ;2 容易发生沉淀反应, 出现沉淀线 ;3 异质性 : 抗体种类多样, 化学组成复杂, 含有较多的无关 Ig, 存在针对多种抗原或一种抗原不同表位一系列亲和力不同的抗体 ;4 重复性差, 批间差异很大 ; 5 免疫原需要纯化 ; 6 易出现交叉反应 二 多克隆抗体制备的基本条件抗血清制备的基本条件包括 : 免疫原的制备 免疫动物的选择 免疫动物的方法等 1 畅免疫原的制备根据抗血清的用途可选用不同类型的抗原 如果制备用于筛选细菌表达 cdn A 文库或免疫印迹的抗血清, 最好选用降解的蛋白质抗原 ; 用于筛选真核细胞转染系统表达的 cdn A 文库或免疫沉淀, 最好选用自然的蛋白质抗原 ; 若制备抗独特型抗体, 所用抗原可以是可溶性 Ig 分子, 也可以是完整的细胞, 如具有抗原特异性的 T 淋巴细胞 B 淋巴细胞 白血病细胞 还可以是通过基因工程表达的独特型表位 人工合成多肽以及抗原化抗体等作为免疫原 通常, 免疫用抗原应具有完整的免疫原性和较高的纯度 细菌 细胞等颗粒性的抗原属于完全抗原, 可以直接免疫动物 相对分子质量大于 30 10 3 的可溶性蛋白质也属于完全抗原 相对分子质量小于 10 10 3 的蛋白质以及人工合成的小分子肽抗原属于不完全抗原, 需要连接载体后才具有免疫原性, 可以用于免疫 大部分免疫用的抗原都要经过提取 纯化过程, 以期在免疫后能获得高特异性的抗体 (1) 完全抗原的提取如果抗原来源于人和动物的组织 细胞内部以及细胞膜上的生物活性物质时, 需将细胞破碎, 方可进一步纯化 1 细胞破碎法可以采用如下方法破碎细胞 : 冷热交替法 : 将组织材料置 90 水浴内加热, 数分钟后取出, 立即投入冰浴中迅速冷却 冷热循环可使大部分细胞破碎 反复冻融法 : 将待破碎的细胞置于 - 20 ~ - 15 冻结, 然后缓慢解冻, 反复数次, 可使大部分细胞及胞内的颗粒破碎 146
第六章抗体制备技术 第一节多克隆抗体制备技术 超声破碎法 : 根据不同组织采用不同频率的超声波, 间断处理 10 ~ 15 min, 可使大部分细胞破碎 玻璃匀浆法 : 在玻璃匀浆器中碾磨, 可以使柔软组织与细胞破碎 自溶法 : 在一定的 p H 和适宜的温度下, 利用组织细胞自身的蛋白酶系统使其组织细胞酶解, 释放出细胞内容物 动物细胞自溶温度常选用 0 ~ 4 自溶时可加入少量防腐剂, 如甲苯 氯仿等 酶处理法 : 如溶菌酶可专一性破坏细菌细胞壁, 适用于裂解多种革兰氏阳性细菌 ; 纤维素酶可用于消化细菌和组织细胞 2 抗原的提取蛋白质是由氨基酸组成的高分子物质 不同蛋白质由于其组成成分和结构的差异, 其溶解度各不相同 根据蛋白质的溶解特性, 可选择以下溶剂提取蛋白质 水溶液提取法 : 大部分蛋白质可溶于稀酸 稀碱或稀盐溶液 盐溶液可以较好地保持蛋白质的稳定性, 是提取蛋白质常用的试剂 一般多以 30 % ~ 50 % 硫酸铵分级提取蛋白质 提取时, 溶液的 ph 要处于蛋白质稳定的范围内, 通常在其等电点的附近 为防止蛋白质变性失活, 提取温度以 4 为宜 有机溶剂提取法 : 与脂类结合的蛋白质溶于乙醇 丙酮等有机溶剂, 可用 70 % ~ 80 % 乙醇提取脂蛋白 如用 60 % ~ 70 % 酸性乙醇提取胰岛素 ; 用丁醇提取一些与脂质结合较牢固的蛋白质或酶类 从微生物或组织细胞中提取的抗原, 其中常含有核酸成分, 采用氯化锰 硫酸鱼精蛋白 DN A 酶或 R N A 酶在 4 条件下作用 30 ~ 60 min, 可有效地除去分离物中的核酸成分 3 抗原的纯化对于从组织细胞中提取的生物大分子, 或体液 组织液中的蛋白质 多肽 酶类等必须进一步纯化才能获得抗原纯品 抗原纯化的常用方法有超滤 盐析 电泳 凝胶过滤 离子交换和亲和层析等方法, 甚至还可以采用高压液相法进行精细分离与纯化 抗原分离与纯化方法参见本节 抗体的分离和纯化技术 (2) 半抗原与载体的交联半抗原的相对分子质量较小 ( 常小于 4 10 3 ), 如多肽 甾体激素 核酸 化学药物等 这些物质因相对分子质量小而不具有免疫原性, 即不能刺激机体产生抗体, 但能与相应抗体发生特异性反应 在制备抗体时必须将这些半抗原以合适的方式连接一个大分子载体 (carrier), 形成免疫原后, 才能刺激机体产生相应的抗体 半抗原与大分子载体连接后组成的免疫原通常称为人工抗原 人工抗原制备涉及载体的选择与偶联, 偶联时要求预先对半抗原化学结构的了解 1 载体的选择载体分天然蛋白质类载体和合成类载体 常用的天然蛋白质载体有人血清白蛋白 (human serum albumin,h SA) 牛血清白蛋白 ( bovine serum albumin,bs A) 牛甲状腺球蛋白 (bovine thyroglobulin,b T G) 钥孔磩血蓝素 (keyhole limpet hemocyanin,k L H) 等 这些载体相对分子质量大 结构复杂 辅助半抗原产生免疫原性的作用较强, 且易获得, 缺点是在免疫中机体更易产生抗载体的抗体 合成类载体主要是指人工合成的多肽聚合物, 常用的有多聚赖氨酸 (poly lysine) 二软脂酰赖氨酸 (dipalmitoyl lysine) 三软脂酸 - S 甘油半胱氨酰 - 丝氨酰基丝氨酸 ( tripalmitoyl sglycerylcysternyl seryl serine) 多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等 这些多聚物相对分子质量大 结构简单, 一般不会引起对载体的特异性反应 其中所含有的 D - 丙氨酸与半抗原结合后, 不需要佐剂参与即可使免疫原在体内缓慢降解, 在此过程中可诱导动物产生针对半抗原的高效价 高亲和力和高特异性的抗体 2 半抗原与载体的偶联方法偶联时要求所采用的化学反应不会明显改变半抗原的抗原性, 也 147
第二部分免疫学基本技术 不会导致载体变性到不能容忍的程度 通常通过半抗原或其衍生物上的氨基 羧基 巯基等与蛋白质载体结合, 所以预先了解半抗原的化学结构性质有助于选择合适的偶联方法 常用的偶联方法有戊二醛法 羰二亚胺法 活泼酯法 亚胺酸酐法和卤代硝基苯法等 这些偶联方法使半抗原与载体在 - COO H - N H2 或 - SH 等基团部位发生结合 如前列腺素 血管紧张素等半抗原, 可选用这些方法进行偶联 对不具备 - N H2 - COOH 和 - SH 基团的半抗原, 如某些类固醇和药物, 则需要加以改造, 使其转变为带有氨基或羧基的衍生物以后方可与载体偶联 如重氮化对氨基苯甲酸法可将带有酚基的半抗原转变为带有羧基的半抗原衍生物 ; 琥珀酸酐法可将带有羟基的半抗原转变为带有羧基的半抗原 - 琥珀酸衍生物 ; 一氯醋酸钠法可将带有酚基的半抗原生成带有羧基的半抗原衍生物 ;O - ( 羧甲基 ) 羟胺法将带有酮基的半抗原转变为带有羧基的半抗原, 引入的羧基再经羰化二亚胺 (EDCI) 法或混合酸酐法与载体蛋白的氨基反应 半抗原与蛋白质载体偶联的策略见表 6-1 表 6-1 半抗原与蛋白质载体偶联策略 半抗原含有的基团 半抗原与载体的偶联方法 载体蛋白基团 半抗原含有游离的羧基 混合酸酐法或碳二亚胺法 载体蛋白的氨基 半抗原含有脂肪族氨基 碳二亚胺法 载体蛋白的羧基 半抗原含有脂肪族氨基 戊二醛法 载体蛋白的氨基 半抗原含有芳香族胺 重偶氮化 载体的酪氨酸 半抗原含有连位羧基 过碘酸盐氧化法 载体蛋白的氨基 半抗原含有甾族化合物的羟基 半抗原含有苯酚类化合物 与琥珀酸酐形成半琥珀酸盐, 其羧基 混合酸酐法或羰二亚胺法 重偶氮化, 对氨基苯甲酸活化成对氨基苯盐, 其羧基 混合酸酐法或羰二亚胺法 载体蛋白的氨基 载体蛋白的氨基 半抗原含有巯基 倡 MBS 连接法 倡 MBS : 顺丁烯酰胺苯甲酸 - N - 琥珀酸酯 载体蛋白的氨基 戊二醛是最常用的同源双功能交联剂, 其含有的 2 个活性醛基, 能分别与载体蛋白和多肽半抗原侧链上的氨基交联 水溶性的碳二亚胺化合物如乙基二甲基氨丙基碳二亚胺是一种异源双功能交联剂, 主要用于连接载体蛋白氨基基团和多肽半抗原上的羧基基团, 形成异源交联物 重偶氮化连接法主要用于含有酚基的多肽 化学药物等与载体蛋白的偶联, 尤其用于化学药物与载体蛋白的偶联 3 偶联复合物的鉴定半抗原在偶联复合物中的数目太多或太少, 都不能有效诱导抗体产生 如用血清白蛋白作为载体, 则每个蛋白质分子上的半抗原分子以 10 ~ 20 个较为合适 所以在偶联后需要对偶联复合物进行鉴定, 测定偶联复合物中的半抗原分子数目, 并检测半抗原经偶联后是否有抗原性改变 一般而言, 半抗原的吸收光谱与载体蛋白不一样, 特别是偶氮衍生物的吸收光谱在可见光区, 载体蛋白在紫外区 这样就可以在一个合适波长处测定偶联物和半抗原的摩尔消光系数 通过它们的比值, 计算与蛋白质偶联的半抗原摩尔数 如果两者的吸收光谱有重叠, 则可先测定偶联物和载体蛋白的摩尔消光系数的差别, 然后比较与半抗原的摩尔消光系数的差别来推算与载体偶联的半抗原摩尔数 如果在偶联过程中掺入放射性半抗原, 则可通过测定结合部分的放射性量, 就可以直接计算偶联物中半抗原数量 148
第六章抗体制备技术 第一节多克隆抗体制备技术 放射性标记化合物掺入法计算载体与半抗原交联比例以前列腺素 (PGE) 与载体蛋白 (BSA) 结合为例,40 mg BSA 加 10 mg 3 H PGE(1 985 500 cpm) 进行交联, 反应终止透析后, 取出结合物总体积的 1/40, 放射量测定为 16 430 cpm, 计算如下 : PGE 的结合率 ( % ) = 16 430 40/1 985 500 = 33 畅 1 % ; BSA 相对分子质量为 68 000,40 mg 相当于 0 畅 55 μg 分子 ; PGE 相对分子质量为 350,10 mg 相当于 28 μg 分子 ; 28 33 畅 1 % /0 畅 55 = 15 ; 因此, 每个 BSA 分子上结合 15 个 PGE 分子 (3) 合成肽抗原合成肽往往是半抗原, 需与蛋白载体连接后才能有效地诱导机体产生免疫应答 通常用于半抗原与蛋白质连接的偶联剂及连接方法, 亦可用作合成肽与载体的连接 近年来合成肽在免疫学中的应用备受重视, 特别是在抗肽抗体的制备以及 T 细胞和 B 细胞表位分析等方面的应用 1 免疫原性肽的选择免疫原性肽的选择是关系到能否获得特异性抗体的关键 实际上, 可以从 cdn A 序列或 N 端氨基酸序列中选择 15 ~ 25 个残基的肽 其选择序列应尽量避免与所免疫动物的序列一致或具有高度同源性 计算机模拟试验推测, 蛋白质的亲水性 易曲折性以及二级结构与其多肽链有关 针对来源于蛋白质这些区域肽链的抗体可特异地与天然蛋白质反应 2 肽的合成与纯化合成肽主要是由专业实验室通过化学方法合成 合成肽的纯化常采用凝胶过滤 (gel filtration) 层析或反向高效液相色谱 ( reversed phase high performance liquid chromatography, RP H PLC) RP H PLC 也用于氨基酸组成的分析 2 畅免疫动物的选择免疫动物的选择原则取决于制备抗血清的目的 用途 需要量以及抗原的种属来源 实验室常选用家兔 小鼠 豚鼠 羊 马甚至禽类作为免疫用动物 马 羊常用于制备商品化的抗毒素血清 ; 在临床作为中毒急救药 ; 豚鼠适用于制备抗酶类抗体和供补体结合试验用的抗体 家兔多用于制备抗甾体激素的抗体 ; 对于难以获得的抗原, 且抗体需要量少时, 可采用纯系小鼠 免疫用动物应选青壮龄 健壮, 最好为雄性 由于动物个体间免疫应答能力有差异, 每批次宜同时免疫数只动物 禽类 ( 鸡和鸽子 ) 也可作为免疫动物, 主要用于制备针对哺乳动物中高度保守分子的抗体 免疫动物抗血清产量以及用途见表 6-2 表 6-2 实验室常用免疫动物的选择动物抗血清量 /ml 有否近交系用途备注羊 1 000 无用于制备多抗抗体的 K 值大家兔 50 无用于制备多抗小白鼠 1 有用于制备单抗遗传背景好大鼠 20 有制备单抗或多抗豚鼠 30 无制备多抗抗体与补体的结合功能强鸡 50 无制备抗高度保守分子的抗体 149
第二部分免疫学基本技术 3 畅佐剂的准备细菌 细胞等颗粒性抗原可以直接免疫动物 蛋白质 多肽等可溶性抗原免疫动物时, 需加入佐剂 (adjuvant), 以延长抗原对机体的刺激时间, 提高巨噬细胞对抗原的摄取效率 降低抗原的毒副作用 佐剂种类有弗氏佐剂 (Freund s adjuvant) 脂质体佐剂及氢氧化铝佐剂, 常用的为弗氏佐剂 弗氏佐剂又分为完全弗氏佐剂 (CF A) 和不完全弗氏佐剂 (IFA),IF A 的配方为 : 羊毛脂 10 g 与石蜡油 20 ~ 50 ml, 混合后高压灭菌 临用时于每毫升 IF A 中加入 1 ~ 5 mg 的灭活卡介苗即成为 CF A 也可以短棒杆菌替代卡介苗, 虽效果似不及卡介苗, 但在使用时比较安全 三 多克隆抗体制备的基本方法免疫途径 抗原免疫量 免疫日程以及抗体效价试测 采血 血清分离 抗血清的保存是制备抗血清中必须注意的各个环节 抗血清可以直接应用于诊断和治疗, 有时需要从血清中提取 纯化抗体, 再应用于检测和治疗 多克隆抗体的蛋白浓度 效价 特异性 亲和力等是考核抗体质量的主要指标 1 畅抗原剂量 免疫途径与免疫日程抗原的免疫原性强弱取决于其相对分子质量 化学活性基团 立体结构 物理性状和扩散速度等 抗原的免疫剂量按抗原的种类 免疫次数 免疫途径以及受体动物的种类 免疫周期及所要求的抗体特性等而不同 剂量过低则不能对机体形成足够强的免疫刺激, 有可能引起低带耐受 (low zone tolerance) ; 但剂量过高, 又有可能造成高带耐受 (high zone tolerance) 在一定范围内, 抗体效价随抗原剂量增加而增高, 蛋白质抗原的免疫剂量的耐受范围比多糖类抗原宽 一般而言, 以动物每千克体重 0 畅 5 mg 抗原剂量计 : 免疫小鼠的剂量为 20 ~ 400 μg /0 畅 2 ml / 次, 大鼠为 100 ~ 1 000 μg /0 畅 5 ml / 次, 兔为 200 ~ 2 000 μg /2 ml / 次, 羊为 5 ~ 20 mg /5 ml / 次 加强免疫的剂量约为首次免疫剂量的 1 / 2 加强免疫应在初次免疫应答高峰后进行, 间隔时间为 2 周以上, 首次加强免疫与再次加强免疫间隔时间为 2 ~ 8 周 按实验需要可作 2 ~ 5 次加强免疫 欲制备高特异性的抗血清, 宜采用低剂量短间隔免疫法 ; 制备高效价的抗血清, 宜采用高剂量长程免疫法 免疫途径有静脉 腹腔 肌肉 皮内 皮下及淋巴结等 多途径比单途径抗体特异性好, 但一次不宜超过两种途径 途径的选择还与抗原性质有关, 激素 酶或毒素不可选静脉途径 当抗原较珍贵时, 首次免疫也可先在淋巴结部位注射卡介苗, 作非特异性免疫, 使淋巴结肿大, 然后再以抗原作特异性免疫 2 畅小样试血与采血末次加强免疫后的第 10 天或水剂加强免疫后的第 5 天, 从兔耳静脉或鼠尾静脉小样取血, 用琼脂双向扩散法测定效价, 如效价不理想, 可再加强免疫一次 琼脂双扩散效价达 1 32 以上时, 即可采血 采血前禁食 12 h, 以防血脂过高 动物采血法包括眼眶取血 ( 小鼠 ) 颈动脉放血 ( 羊 马 ) 心脏采血 ( 兔 大鼠 ) 等 采得血液注入试管或平皿中, 室温放置 4h 以上或 4 放置过夜, 待血液凝固后, 吸取血清,2 000 r /min 离心 15 min, 去除红细胞等血液中有形成分 3 畅抗体的分离和纯化技术抗血清包含血清的全部成分, 其内与抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白即 γ 球蛋白 抗体的分离与纯化一般包括两方面的工作 : 一是以理化性质提取均质的免疫球蛋白部分, 去除无关蛋白 中性盐沉淀法是粗制方法, 凝胶过滤 离子交换 蛋白 A 或蛋白 G 亲和层析等可进行 150
第六章抗体制备技术 第一节多克隆抗体制备技术 进一步分离纯化 ; 二是从免疫学角度提取与某特定抗原结合的特异性抗体, 抗血清经过盐析以后, 再 用吸附抗原的免疫亲和柱进行精细纯化, 经此提取的抗体特异性强, 但可以是几类免疫球蛋白 (IgG Ig M IgA) 的混合物 动物免疫中可能出现的问题及对策问题 1 : 抗体特异性差 解决方法 : 纯化抗原 一般而言, 第一次免疫所用的抗原的纯度对于产生抗体的特异性有很大的影响, 第一次免疫采用纯度较高的抗原, 容易得到高特异性的抗体 但是某些激素, 诸如 L H HCG FS H T S H 等糖蛋白激素之间由于蛋白质结构比较相似, 免疫得到的抗体往往与这类抗原会有交叉反应, 改制单克隆抗体可以提高抗体特异性 问题 2 : 佐剂乳化不充分 解决方法 : 反复乳化 ; 避免使用塑料注射器 ; 抗原不要以 T ris 缓冲液溶解 问题 3 : 抗原的免疫原性弱 解决方法 : 将抗原与载体蛋白交联 ; 抗原分子通过交联剂形成大的聚合物 问题 4 : 动物本身免疫力低下 解决方法 : 换健康 健壮动物 问题 5 : 使用的抗原量过低, 亦可引起免疫反应低下 解决方法 : 提高抗原量 在纯化抗体时需要控制好下列指标 : 抗体的纯度 含量以及活性 (1) 盐析法盐析沉淀法简称盐析法, 是粗提抗体 ( 包括蛋白质类抗原 ) 最简单 最实用的方法之一 盐在溶液中解离成正 负离子, 经反离子作用可改变蛋白质表面所带的电荷, 使蛋白质由带电物质变成惰性物质而发生沉淀 不同蛋白质在同一盐浓度溶液中的溶解度不同而达到分离 盐析法首选硫酸铵沉淀法 硫酸铵易溶于水, 且溶解度受温度影响小 硫酸铵沉淀法分离抗体需经过 3 次分级沉淀, 第一次用 50 % 盐饱和度, 第二 三次用 33 % 盐饱和度 实验时通常预先配制饱和硫酸铵溶液, 然后按以下公式计算达到某一饱和度时应加饱和硫酸铵的量 : X = av /(100 - a) 式中 X 表示所需加入饱和硫酸铵的量 ( ml),v 表示原抗体溶液量,a 表示所需达到硫酸铵的饱和度 有时也可在大容量样品中直接加入固体硫酸铵, 硫酸铵加入量须参考实验温度对其影响 经三次硫酸铵提取以后得到的蛋白质基本上是 γ 球蛋白 因 γ 球蛋白组分中同时含有抗体和其他正常免疫球蛋白, 特异性不强, 所以盐析法粗提的 γ 球蛋白只能用于一般实验 (2) 凝胶过滤法凝胶过滤法是 20 世纪 60 年代建立起来的一种新的分级分离法 凝胶是一种网筛状结构的惰性颗粒, 凝胶过滤法的原理是分子筛原理, 即按分离物相对分子质量大小, 小分子分离物经过凝胶时进入凝胶网筛而不断受阻, 大分子分离物则从网筛颗粒间快速穿过, 从而使不同相对分子质量的物质得以分离 通常而言, 两分离物相对分子质量差异越大, 分离效果越好 常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶 (Sephadex) 系列 琼脂糖凝胶 (agarose) 系列 聚丙烯酰胺凝胶等, 可以根据被分离物的相对分子质量大小选择使用 (3) 离子交换层析法提取 IgG 离子交换剂是在纤维素上连接带电的离子基团而制成 二乙氨基乙基纤维素 ( 简称 DEAE 纤维素, 为阴离子交换剂 ) 及羧甲基纤维素 (C M - 纤维素, 为阳离子交换剂 ) 是带电荷的交换剂, 可以交换带相反电荷的蛋白质, 将蛋白质抗原按其所带电荷的不同或量的差 151
第二部分免疫学基本技术 异经过梯度洗脱而分成不同的组分 特别是经过盐析等初步纯化后的蛋白质和酶抗原采用此方法进一步纯化, 效果较好 常用的离子交换剂有 DEAE 纤维素或 Q AE 纤维素, 以葡聚糖凝胶代替纤维素制成的离子交换剂, 如 Q AE Sephadex 是一种更理想的交换剂, 具有交换容量大 非特异性吸附低 流速好等优点 取 Q AE Sephadex A 25 或 A 50 经酸处理, 并在 0 畅 05 mol /L,p H 7 畅 5 ~ 8 畅 6 的磷酸盐缓冲液中平衡, 将水分抽干, 称湿重为 1 g 离子交换剂加至 10 ml 待分离的血清中, 室温 30 min 后, 离心除去离子交换剂 上清液再如此处理一次, 即可获得较纯的 IgG, 甚至不含其他杂蛋白 用该技术纯化 IgG 方法简便, 不损伤抗体 既可小量提取, 也可大量制备 (4) 亲和层析法提取特异性 IgG 将目的抗原交联在 Sepharose 4B 上, 制成亲和层析柱, 将抗血清过柱后洗去未结合的无关蛋白, 再用硫氰酸钾洗脱结合在目的抗原上的抗体 因硫氰酸钾对抗体有破坏作用, 所以须及时透析除之 纯化的 IgG 失去了无关蛋白的保护, 应及时冻干保存, 或加入甘油后 - 20 保存 亲和层析方法简便易行, 但是试剂价格较高 (5) 抗体 ( 抗原 ) 浓缩法提取抗体或抗原有时候需要浓缩 浓缩可以提高分离物浓度, 通常不提高纯度 常用的浓缩方法有以下几种 1 吸收浓缩 : 通过吸收剂吸收溶液中的溶剂分子达到浓缩目的 使用的吸收剂应不与溶液起化学反应, 且对生物大分子无吸收作用 最常用的吸收剂有聚乙二醇 ( PEG) 凝胶和蔗糖等 使用 PEG 或蔗糖吸收剂时, 先将生物大分子溶液装入透析袋里, 扎紧袋口, 外加吸收剂覆盖, 袋内溶剂渗出被吸收剂吸去, 可不断更换被溶剂饱和的吸收剂, 直至浓缩至所需浓度为止 吸收剂经加热烘干后可循环使用 2 蒸发浓缩 : 蒸发浓缩装置常按照加热 扩大液体表面积 减压及加速空气流动等因素设计而成 冷空气流动法是最简便的方法, 将抗体或抗原溶液装入透析袋, 扎紧袋口, 然后对电扇吹风, 促使水分缓慢蒸发, 可起到浓缩作用 3 超滤浓缩 : 这是使用特定孔径的滤膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法 溶液在一定压力下通过滤膜时, 溶液和小分子物质可以通过, 而大分子仍保留于原来的溶液中 超滤浓缩尤其适用于蛋白质和酶的浓缩和脱盐, 并可用于抗体等生物大分子的分离纯化, 具有成本低 操作方便且能较好保持生物大分子的生物活性等优点 通过超滤浓缩, 蛋白质的稀释液可浓缩到 10 % ~ 15 %, 回收率达 90 % (6) 电泳分离法琼脂板电泳 等电聚焦电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳等通过分离物带电性差异, 使每一种类型的抗体或抗原经电泳以后处于各自泳区, 切割不同泳区可以得到不同的分离物 因为受电泳上样量限制, 电泳法主要以分离少量抗原为主 4 畅抗体的鉴定抗体鉴定指标包括抗体蛋白浓度 抗体效价 抗体纯度 抗体特异性 抗体类型 抗体亲和力等等 鉴定抗体蛋白浓度的方法有紫外分光吸收法 二辛可宁酸 (bicinchoninic acid,bca) 法等 ; 鉴定抗体效价的方法有双向免疫扩散 对流电泳等 ; 鉴定抗体纯度的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳 ; 鉴定抗体特异性的方法有免疫电泳 免疫印迹等 ; 鉴定抗体类型的方法有免疫金试条法 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 等 ; 鉴定抗体亲和力的方法有 ELISA 放射性同位素竞争试验等 (1) 抗体蛋白浓度测定蛋白浓度测定方法有 : 紫外分光比色法, 双缩脲法 福林 - 酚法 二辛可 152
第六章抗体制备技术 第一节多克隆抗体制备技术 宁酸 (BCA) 法, 考马斯蓝法,Lo w ry 法等 以紫外分光比色法和 BC A 法用得较多 几种测量方法的 比较见表 6-3 表 6-3 几种测定蛋白质含量方法比较 方法 测定范围 /(μg /ml) 不同蛋白质的差异 测定波长 /nm 特点 紫外分光比色法 100 ~ 1 000 大 260 /280 快速, 简单 双缩脲法 1 000 ~ 10 000 小 540 重复性好 BCA 法 1 ~ 10 中 562 干扰少, 费时 考马斯蓝法 10 ~ 100 中 595 灵敏, 误差大 福林 - 酚法 30 ~ 300 小 750 费时 凯氏定氮法 200 ~ 1 000 小 570 可自动化测定 紫外分光比色法简便 快速, 低浓度盐液不干扰测定 蛋白质中的酪氨酸与色氨酸中的苯环含有共轭双键, 在波长 280 nm 处有一个紫外吸收高峰 对样品进行适当稀释, 以紫外分光比色计读取 A280 值 ( 蛋白质吸收波长 ) 和 A260 值 ( 核酸吸收波长 ), 按以下公式计算蛋白质浓度 : 蛋白质浓度 (mg /ml) = (1 畅 45 A280-0 畅 74 A260 ) 稀释倍数紫外分光比色法的缺陷是其结果因蛋白质中酪氨酸与色氨酸量的变化而异, 并且当样品含核酸含量高于 20 % 时, 结果不准 BCA 法的原理是蛋白质在碱性溶液中可以使 Cu 2 + 还原成 Cu +,Cu + 与二辛可宁酸结合形成稳定的紫色结合物, 在波长 562nm 处有最大吸收光, 光吸收值与蛋白质浓度成正比 BCA 法结果准确 灵敏度较高, 检测试剂已商品化 (2) 双向免疫扩散检测抗体效价固定抗原浓度 ( 通常为 1mg /ml), 倍比稀释抗体, 使抗原抗体在半固体琼脂中自由扩散, 在抗原抗体比例合适处可以形成肉眼可见的沉淀线, 以形成沉淀线最高抗体稀释度判为抗体的效价 ELISA 等方法也可测定抗体的效价, 方法见第八章酶免疫技术章节 (3) 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定抗体纯度与相对分子质量分离物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中被处理成带有相同的电荷 使经纯化的抗体 ( 或抗原 ) 在聚丙烯酰胺凝胶电泳时仅仅按其相对分子质量大小, 小相对分子质量物质电泳速度快, 大相对分子质量物质电泳速度慢 电泳后用考马斯蓝染色, 观察染色条带的形成, 条带越少则分离物纯度越高 以标准相对分子质量作为参考, 可以鉴定分离物的相对分子质量 (4) 免疫印渍术鉴定抗体特异性已知抗原经聚丙烯酰胺凝胶电泳按相对分子质量大小展开以后, 通过转移电泳系统使之从凝胶中转移到硝酸纤维膜上, 然后加入待检抗体和酶标记抗抗体与之反应, 再以有色底物显色反应, 可以观察特定相对分子质量区域的抗原抗体结合的特性 (5) 免疫金试条法鉴定抗体类型免疫金试条法是一种快速 准确的检测方法, 在试纸上预包被有金溶胶标记的抗 Ig 类别 Ig 轻链以及 IgG Ig M 亚类抗体, 一旦和相应被检样品结合, 就可在试纸上形成金溶胶凝集条带 多克隆抗体通常是 IgG Ig M 混合抗体, 一般不测定其类别或亚类 单克隆抗体则需要测定抗体类别及其亚类 (6) ELIS A 鉴定抗体亲和力亲和力关乎于抗体的质量 抗体亲和力高, 表明其在免疫反应中与抗原结合速率快, 不易解离 通常用反应平衡结合常数 K a 值即 [ Ag Ab] 与 [ Ag][ Ab] 比值的大小 153
第二部分免疫学基本技术 来衡量亲和力大小,K a 值的单位为 M - 1 K a 值大于 10 8 M - 1 为高亲和力抗体, 接近于 10 7 ~ 10 8 M - 1 为中等亲和力抗体, 小于 10 5 M - 1 为低亲和力抗体 制备并选择高亲和力的抗体在放射免疫分析中特别重要 K a 值与测定方法有关, 实验室常采用 ELISA 法测定抗体最高稀释度, 并以最高稀释度表示抗体的 K a 值 5 畅抗体的保存抗体具有严密的三维结构, 存在于血清中的抗体比较稳定 即使经历轻度变性的影响, 抗体也能保持其活性 未经纯化的抗血清可直接存放在 - 30 以下, 能够长期储存 低温存放不会丧失抗体的活性 抗体不宜反复冻融, 反复冻融容易导致抗体失活, 发生凝聚 抗体凝聚会导致抗体构象变化, 效价下降 已经纯化的抗体, 可以加入防腐剂, 再加入等量的中性甘油, 置 - 30 保存 ; 也可分装抗体, 冷冻干燥后低温长期保存 抗体工作液一般存放在 4 冰箱内, 但要注意此时的抗体浓度不能太稀, 并且要作除菌和防菌处理 防菌可加一些防腐剂, 如 0 畅 05 % 的叠氮钠或 0 畅 01 % 的硫柳汞等 ( 用于酶标记的抗体不能用叠氮钠防腐, 因为叠氮钠是过氧化物酶的抑制剂 ) 第二节单克隆抗体制备技术 多克隆抗体通过免疫动物制备而成, 由于动物血清量的限制及动物个体间的差异, 即使纯种动物, 各自产生抗体的质和量也有差别, 甚至同一动物不同采血期所得到的抗体的质和量也不尽相同, 由此造成其作为药物 用作检验时在标准化应用中带来了困惑 1960 年,Barski 等发现一个现象, 当两个细胞紧密接触以后, 其细胞膜可以融为一体, 产生包容两个细胞基因信息为一体的新细胞, 称为杂交细胞 ( hybrid cell) 细胞自然融合现象发生的频率很低 冈田等 (1967) 和 Kao 等 (1974) 分别发现仙台病毒和聚乙二醇 ( PEG) 能使细胞发生融合, 并具有很高的融合率 1975 年, 德国的 K 迸 hler 和阿根廷的 Milstein 以 Burnet 克隆选择学说为理论依据, 首次以仙台病毒作为 融合剂, 把由 Milstein 在 1972 年建株的小鼠骨髓瘤细胞 ( P3 X63 Ag8) 与经羊红细胞免疫过的小鼠脾 B 细胞融合, 结果发现融合细胞既有分泌抗羊红细胞抗体的能力, 又有瘤细胞大量繁殖和永生化的倾向, 这种融合细胞被称之为杂交瘤细胞 杂交瘤细胞经过克隆化培养, 即经过单细胞化培养以后所产生的抗体被称为单克隆抗体 (monoclonal antibody,mcab), 简称单抗 单抗制备成功从实践中证实了 Burnet 克隆选择学说, 为免疫学的基础理论研究及临床应用开创了新纪元 为表彰这一重要贡献,K 迸 hler 和 Milstein 荣获了 1984 年度诺贝尔生理学或医学奖 一 单克隆抗体制备的原理单克隆抗体技术亦称细胞工程抗体技术或 B 细胞杂交瘤技术, 是将在体外不能长期生存的 B 淋巴细胞, 在聚乙二醇等融合剂作用下, 与在体外能无限增殖的瘤细胞融合, 通过 H A T 选择性培养基的选择性培养, 获得具有 B 淋巴细胞和同系瘤细胞这两种细胞特性为一体的杂交瘤细胞 (hybridoma cell) 它既保留有细胞无限增殖的能力, 又具有在体外无限产生抗体的特征 杂交瘤技术最重要的成果就是能生产大量高特异性 同质性抗体 如果抗体由鼠 B 淋巴细胞与瘤细胞融合后产生, 则称为鼠源单克隆抗体 (murine McAb,M McAb) ; 如果抗体由人 B 淋巴细胞与瘤细胞融合后产生, 则称为 154
第六章抗体制备技术 第二节单克隆抗体制备技术 人源单克隆抗体 (human McAb,H McAb) 单克隆抗体具有如下特点, 优点是 :1 属同一类型或亚类的 Ig, 化学组成均一 ;2 特异性强, 仅针对一种抗原表位 ;3 可大批量生产, 制成的抗体批间差异小 ;4 腹水型抗体含量可达 mg /ml 水平 缺点是与相应抗原结合后不易形成沉淀线, 制备过程比多克隆抗体复杂 繁琐 二 单克隆抗体制备的基本条件制备单克隆抗体需要有特殊的仪器, 包括 CO2 培养箱 倒置显微镜 超净工作台 液氮罐 低速低温离心机等 ; 还需要高质量的特殊培养液包括 RP MI 1640 基础培养液 H A T 培养液 H T 培养液 牛血清 抗生素等以及 96 孔 48 孔 24 孔培养板 培养瓶 吸管 离心管等无菌培养器皿 单克隆抗体制备是一门综合性的免疫学技术, 前期包括动物的免疫 骨髓瘤细胞的筛选与培养 检测方法的建立等 单抗制备工作流程见图 6-1 图 6-1 单克隆抗体制备流程 1 畅动物的免疫选择合适的免疫方案对于能否成功融合细胞 获得高质量的 McAb 极为重要 免疫方案可以凭经验而定, 不仅随所用抗原的种类, 而且随实验室的 习惯 而异 一般根据抗原性质, 免疫原性强弱决定免疫途径 免疫次数, 免疫间隔时间 (1) 抗原与载体颗粒性抗原免疫原性强, 如肿瘤细胞 淋巴细胞 细菌等均属颗粒性抗原, 不加佐剂直接进行免疫, 每次免疫剂量为 (2 ~ 5) 10 7 个细胞 / 次, 即可获得较好的免疫效果 可溶性抗原因其免疫原性较弱, 通常要加佐剂, 如果相对分子质量小于 10 4 或系半抗原, 应连接载体制成人工免疫原, 再加佐剂后免疫动物 必要时, 可将可溶性抗原颗粒化或固相化以后再进行免疫, 由此可增强抗原的免疫原性 也可以细胞因子等作为辅助剂, 用以提高机体的免疫应答能力, 促进抗体产生 (2) 动物的选择根据骨髓瘤细胞来源选择免疫用鼠系 常用的骨髓瘤细胞来自 BA LB /c 小鼠, 因此可选用 6 ~ 10 周龄, 健康 BA LB /c 小鼠进行免疫 155
第二部分免疫学基本技术 (3) 免疫途径通常采用体内注射免疫法, 一次可溶性抗原免疫量为 25 ~ 50 μg 取小鼠后腿肌肉 腹股沟淋巴结或背部皮下等部位多点注射, 免疫 3 ~ 5 次, 第一次免疫采用 抗原 + 完全弗氏佐剂, 随后免疫采用 抗原 + 不完全弗氏佐剂, 每次免疫应间隔 3 周以上, 即当免疫所产生的抗体周期性下降以后再加强免疫 期间可测试抗体, 观察免疫效果 最后一次加强免疫单用抗原溶液自腹腔或尾静脉注射,5 天后取其脾做融合 当抗原相当珍贵时, 可采用脾内免疫法, 即通过外科手术将抗原溶液直接注入小鼠的脾 ; 也可采用体外免疫法, 即将未经致敏的小鼠脾细胞, 在体外与抗原共同培养, 使脾 B 细胞得到抗原特异性刺激 一般而言, 体内注射免疫法模拟自然感染法, 其免疫效果最好 2 畅酶缺陷性骨髓瘤细胞的筛选和培养 (1) 骨髓瘤细胞的演化常用于制备单抗的骨髓瘤细胞为小鼠 NS 1 和 SP2 /0 细胞系, 它们都是由 M OPC21 浆细胞瘤 ( 给 BA LB /c 小鼠注射矿物油诱导产生的骨髓瘤培养而成的细胞系 ) 演化而来的亚系 ( 图 6-2) M OPC21 细胞能合成并分泌 M OPC21 瘤蛋白 ( IgG1 成分 ), 因此不宜用于细胞杂交 NS 1 是 M OPC21 浆细胞瘤的变异株, 其不产生 Ig 重链, 可产生原细胞系 IgG1 的轻链, 但不分泌到细胞外 SP2 /0 细胞是 P3 X6 Ag8 细胞与绵羊细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞融合成的杂交瘤, 经培养和药物筛选而发生变异, 该细胞系已完全失去表达抗体的能力, 因此用 SP2 /0 瘤细胞作为亲本与免疫 B 细胞杂交获得的杂交瘤可分泌更加纯一的单抗 图 6-2 骨髓瘤细胞的演化谱系由于这些骨髓瘤细胞来源于 BA LB /c 小鼠, 能与 BA LB /c 小鼠脾 B 细胞有效地融合, 无需考虑组织相容性问题 (2) 酶缺陷性骨髓瘤细胞的筛选在细胞融合以后, 需要筛选有效的杂交瘤细胞, 因此所用的骨髓瘤细胞应该是核酸旁路合成酶缺陷型 一般有两种酶缺陷型的骨髓瘤细胞 : 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,h GPR T) 缺陷型细胞和胸腺嘧啶核苷激酶 ( thymidine kinases, T K) 缺陷型骨髓瘤细胞 H GPR T 缺陷型骨髓瘤细胞主要是采用 8 杂氮鸟嘌呤 (8 azaguanine,8 AG) 或 6 硫代鸟嘌呤 (6 thioguanine,6 T G) 筛选而成 将骨髓瘤细胞置于含有嘌呤类似物的 8 杂氮鸟嘌呤或 6 硫代鸟嘌呤培养基中生长时,H GPR T 则催化嘌呤类似物掺入 DN A, 从而干扰了正常蛋白合成, 导致细胞死亡 H GPR T 的基因编码在 X 染色体上, 因此, 每个细胞只表达一个拷贝 ( 复制表型 ) 而缺乏 H GPR T 的细胞因嘌呤类似物不能掺入 DN A 而能在含有嘌呤类似物的培养基中生长 这种缺乏 156
第六章抗体制备技术 第二节单克隆抗体制备技术 H GPR T 细胞不能利用次黄嘌呤, 因此合成核苷酸只有通过 DN A 合成的主要途径 T K 缺陷型骨髓瘤细胞是通过溴脱氧尿嘧啶核苷选择而成 3 畅单抗检测方法的建立细胞融合以后须及时对杂交瘤细胞所分泌的抗体进行检测 间接酶联免疫吸附检测技术即 ELISA 是首选方法, 其具有灵敏 快速 简单等优点, 并可进行大批量检测 ELIS A 方法见第八章免疫标记技术 三 单克隆抗体制备的基本方法单克隆抗体的制备是一项周期长 工作量大 涉及面广的综合技术, 无菌概念涉及实验全过程 具体包括两亲本细胞的选择和准备 饲养细胞的制备 细胞融合 杂交瘤细胞的选择性培养 阳性克隆 (clone) 的筛选 杂交瘤细胞的克隆化 阳性克隆细胞的扩大培养与深低温保存 腹水型单抗的制备 单抗特性鉴定和纯化等 1 畅酶缺陷性骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞培养是实验室一项基础性工作, 也是一项重要工作, 需要有严格的无菌操作技能, 更需要有主动工作热情 应使培养中的骨髓瘤细胞时时处于良好的生长状态, 即处于对数生长期, 活率保持在 95 % 以上 用于细胞培养的基本条件是 5 % CO2 37 C 恒温恒湿, 基础培养液主要由含 10 % 胎牛血清 (FCS) 含有 H EPES 缓冲系统的中性 RP MI1640 完全培养液组成 FCS 应确保无菌 无支原体污染 无牛 Ig 存在, 并能支持单细胞生长 培养液中还应加入一定量的抗生素 常规加入青 链霉素, 预防革兰氏阳性菌污染 ; 也可加庆大霉素, 预防革兰氏阴性菌污染 必要时可以加入两性霉素 B 或制霉菌素, 预防霉菌污染 符合细胞融合的骨髓瘤细胞, 必须处于对数生长期, 并于融合前一天换新鲜培养液 2 畅饲养细胞的制备细胞融合过程中发生大量细胞死亡, 并产生大量细胞碎片需要清除, 细胞生长需要一定的密度, 尤其在克隆化培养过程中细胞密度太低, 细胞不易存活 故常在培养系统中加入同种活细胞, 这些另加的活细胞称为饲养细胞 饲养细胞通常在细胞融合的前一天或细胞克隆前一天制备 饲养细胞经一定时间培养以后会自然死亡, 所以不会影响单克隆细胞的纯一性 常用的饲养细胞有 BALB /c 小鼠腹腔细胞 脾细胞及成纤维细胞 一般一个小鼠的腹腔细胞可以种植 2 块 96 孔细胞培养板 腹腔细胞中主要是巨噬细胞, 其兼有分泌促细胞生长因子和 清道夫 作用 3 畅脾 B 细胞分离最后一次加强免疫后第 3 ~ 5 天的 BA LB /c 小鼠, 放血处死, 用 75 % 酒精浸泡消毒, 无菌剖腹, 取出脾置于培养液中, 用弯头镊子挤压脾, 使细胞团块从包膜下游离出来, 以 100 目尼龙网过滤细胞 ( 图 6-3), 再用淋巴细胞分离液分离 B 细胞 4 畅细胞融合早期采用仙台病毒作为融合剂 ( 图 6-4), 目前常用相对分子质量 1 000 ~ 4 000 的聚乙二醇 ( PEG) 作为融合剂 相对分子质量大的 PEG 图 6-3 组织细胞的制备 157
第二部分免疫学基本技术 融合率高, 但毒性也大, 相对分子质量小的 PEG 融合率低, 但毒性也小 PEG 的作用机制通常认为是 使细胞膜上脂类结构重新排列, 并吸收细胞间的水分, 促进细胞间接近, 因而发生细胞融合 ( 图 6-5) 图 6-4 病毒介导细胞融合的原理图 图 6-5 PEG 促进细胞融合的原理图将骨髓瘤细胞与脾细胞按 1 5 比例混合, 缓缓滴加经 37 C 预温的 50 % PEG, 然后再滴加预温的无血清培养液, 终止 PEG 作用 将融合细胞分加至预种有饲养细胞的 96 孔细胞培养板中, 每孔约 10 4 个细胞, 并设单加骨髓瘤细胞和脾细胞作为对照 也可采用电融合, 通过电融合仪电击细胞, 使细胞膜出现瞬间混乱, 导致细胞融合, 电融合法融合率高, 操作简便, 但对细胞损伤也大 5 畅 HAT 选择性培养细胞利用碱基合成 DN A 有两条途径, 一条是 DN A 合成的主要途径, 即利用糖和氨基酸合成核苷酸, 进而合成 DN A, 叶酸拮抗物氨基蝶呤 ( A) 可阻断主要途径 ; 另一条为旁路应急途径, 即当叶酸代谢受阻断后, 细胞通过次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( H GPR T) 和胸腺嘧啶核苷激酶 ( T K), 将核苷酸前体次黄嘌呤 ( H ) 和胸腺嘧啶脱氧核苷 ( T ) 合成为核苷酸, 进而合成 DN A 1964 年 Littlefield 根据上述原理, 研制成筛选用的含次黄嘌呤 ( H) 氨基喋呤 ( A) 和胸腺嘧啶脱氧核苷 ( T) 的选择性培养基 ( H A T 培养基 ) 细胞在此培养基中生长, 只能靠 H GPR T 和 T K 利用培养基中提供的 H 和 T 通过旁路应急途径合成 DN A 而用于融合的骨髓瘤细胞是 H GPR T 缺陷或 T K 缺陷型细胞, 在 H A T 培养基中不能生长 脾 B 细胞具有旁路应急途径相关酶, 但它是正常血细胞, 一般 2 周内自然死亡, 惟骨髓瘤细胞与脾 B 细胞所形成的融合细胞, 同具两者特性, 能在 H A T 培养液中生长 ( 图 6-6) 158
第六章抗体制备技术 第二节单克隆抗体制备技术 图 6-6 细胞融合后 HAT 筛选的结果 次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径 正常细胞 : 酶缺陷型骨髓瘤细胞 : 经融合的细胞在 H A T 中培养 3 ~ 5 天, 对照孔骨髓瘤细胞全部死亡, 而融合的杂交瘤细胞呈现 大而透亮的圆形 随时间延长, 杂交瘤细胞增殖成细胞集落 一般每隔 3 天换 1 /2 新鲜培养液, 第 7 ~ 14 天后由 H A T 培养液改为 H T 培养液 4 周以后改为基础培养液 159
第二部分免疫学基本技术 6 畅阳性克隆的筛选当杂交瘤细胞集落长至孔底 1 /6 面积时, 可用酶联免疫吸附试验 ( ELIS A) 检测细胞培养上清液中的特异性抗体 ELISA 方法具有操作简单 快速 灵敏等优点, 可对大批量标本同时进行测定 7 畅克隆化培养初期阳性孔中包含不分泌抗体的细胞克隆, 后者比分泌抗体的融合细胞生长更快, 因此须尽早对细胞进行克隆化培养 所谓有限稀释法 (limiting dilution technique) 是指从抗体阳性孔收集杂交瘤细胞, 经有限梯度稀释以后, 再分加到细胞培养板中, 使每孔细胞数在理论上达到 1 个 / 孔 0 畅 5 个 / 孔 0 畅 3 个 / 孔 反复克隆 3 次以上, 使阳性克隆率达到 100 % 并及时冷冻保存阳性细胞 8 畅单克隆抗体的扩大生产 (1) 体外旋转培养瓶制备 McAb 通过培养瓶旋转系统大量培养杂交瘤细胞, 从培养上清中可以获得单克隆抗体 抗体在培养液中的浓度可以达到 50 μg /ml 水平 采用无血清培养液培养细胞, 可以得到无牛血清的抗体, 有利于后续纯化 图 6-7 单克隆抗体制备的流程简图 (2) 腹水型 McAb 的制备扩增的杂交瘤细胞在培养瓶内培养所产生的 McAb 浓度在 μg /ml 水平 把分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔所产生的腹水型 McAb 浓度约在 mg /ml 水平 常规先于 BA LB /c 小鼠腹腔内注射 0 畅 3 ml 降植烷 (pristane) 或液体石蜡,1 ~ 2 周后注射 1 10 6 个杂 160
第六章抗体制备技术 第二节单克隆抗体制备技术 交瘤细胞, 小鼠于 7 ~ 10 天后可出现腹水, 密切观察小鼠生长情况, 并可不间断用注射针吸取腹水 一般每个小鼠可制得 5 ml 腹水型抗体 (3) 细胞生物反应器制备 McAb 用细胞生物反应器制备 McAb, 可生产 > 100 mg /L 级水平的抗体, 采用 10 L 以上的生物反应器, 可使 McAb 达克级水平 杂交瘤细胞没有细胞壁, 不能耐受剧烈的搅拌和通气, 所以其对环境的要求比微生物发酵苛刻, 培养体系中必须考虑营养构成 溶解氧 渗透压等因素 9 畅单克隆抗体的鉴定与纯化 (1) 单克隆抗体的鉴定一次融合可产生多株抗体, 除了进行特异性测定以外, 还要分析抗体对不同抗原表位的识别格局 采用 ELISA 叠加法, 即用两株 McAb 同时与同一抗原反应, 如果两株 McAb 针对不同表位, 则两支混合抗体比单支抗体的测定值可增加 50 % 以上 亲和力是 McAb 重要的指标, 分为相对亲和力和亲和力常数 前者是对一组单抗与抗原结合能力的大小作出排序 通常选择高亲和力抗体用于体内治疗和检测试剂的组装, 相对弱的 McAb 用于亲和层析 亲和力常数是 McAb 对相应抗原的结合与解离率指标 亚类鉴定对 McAb 纯化方法的确定, 以及进一步制备基因工程抗体具有参考意义 鼠源单克隆抗体亚类大多为 IgG2b, 其次为 IgG1, 轻链大多为 κ 链 ( 约 95 % ), 少量为 λ 链 ( 约 5 % ) McAb 的效价和蛋白质浓度是考核 McAb 质量的基本指标, 紫外分光比色法和 Lo w ry 法常用于 McAb 蛋白质定量, 间接 ELISA 法常用于 McAb 效价的测定 蛋白质浓度相同的 McAb, 效价越高则质量越好 (2) 单克隆抗体的纯化单克隆抗体纯化的策略由其用途决定, 可以采用粗制和精制的方法 作为一抗应用, 辛酸 硫酸铵盐析即可 ; 作为标记二抗或体内治疗可进一步采用蛋白 A 或蛋白 G 亲和层析等方法 四 实验影响因素的分析单克隆抗体制备周期长 环节多以及所用试剂多, 每一步不缜就有可能导致失败 实验中须注意以下方面 : 1 畅污染问题细菌 霉菌 支原体是造成培养体系污染的最主要的微生物 这些微生物可能来自试剂 仪器材料 空气以及操作者自身 一旦有哪一块板或哪一瓶细胞被污染, 唯有弃之才是解决的根本方法 2 畅融合细胞不生长可能原因是 PEG 有毒性或作用时间过长 牛血清质量差 H A T 培养体系中 A 含量过高或 H T 含量不足 3 畅杂交瘤细胞不分泌抗体或分泌量下降可能原因是 H A T 培养体系中 A 失效, 也可能是有支原体污染或是骨髓瘤细胞突变 4 畅杂交瘤细胞难以克隆化可能原因是小牛血清质量有问题或是骨髓瘤细胞活性不好 为防止各种因素对杂交瘤工作的影响, 须做到 三要, 三不要 : 要及时冷冻保存细胞 ; 要勤于观察培养中的细胞, 发现问题及时处理 ; 要定期细胞再克隆, 避免突变细胞优势性生长 不要让细胞 过度生长 ; 不要凭经验而放弃观察 ; 不要终止克隆化而连续传代 161
第二部分免疫学基本技术 五 单克隆抗体的应用 单克隆抗体与多克隆抗体在性能上存在差异 ( 图 6-8), 因而在应用上有所不同, 前者主要用于 研究 检测与疾病的治疗 ( 表 6-4) 图 6-8 单克隆抗体与多克隆抗体的关系 表 6-4 多克隆抗体与单克隆抗体的主要区别 性状 多克隆抗体 单克隆抗体 产生抗体细胞 多株 B 细胞 单株杂交瘤细胞 Ig 类, 亚类 多种 一种 结合特性 多种抗原表位 单个抗原表位 交叉反应 少 极少 沉淀反应 + - 特异性 较好 好 亲和力 高 较高 稳定性 良好 略差 主要用途 常量检测, 紧急防治 微量检测, 免疫治疗 162
第六章抗体制备技术 第三节基因工程抗体制备技术 1 畅单克隆抗体在免疫标记技术中的应用荧光素标记单克隆抗体并采用流式细胞仪 ( F ACS) 技术是检测和分析细胞表面标志最精确 最简捷的实验方法 多色荧光标记各种特异性的单抗可同时检测同一细胞上多个标志 单克隆抗体还可用于对生物活性分子细胞内示踪, 观察生物活性分子在胞浆和胞核内的定位变化 放射性核素标记抗原或抗体, 可通过竞争检测相应的微量分子 McAb 可大批量生产, 并且具有高度特异性和均质性, 使放射免疫检测的实验结果准确度更高, 重复性更好 例如, 单克隆抗体在应用于兴奋剂检测之中, 可分辨机体内源性促红细胞生成素 (EPO) 和摄入性 EPO 细胞因子在免疫调节过程中扮演重要角色, 由辣根过氧化物酶结合物与抗细胞因子单克隆抗体等试剂所建立的 ELISA 方法, 可检测绝大部分微量存在的细胞因子 应用 McAb 还能鉴别病原体不同的种 型 亚型以及不同生活周期的抗原性变化, 对预测病原体流行和疫苗的制备具有重要意义 2 畅单克隆抗体在免疫提取中的应用以 McAb 制成的亲和介质可提取相应抗原 ; 以荧光或磁性微粒标记 McAb, 通过 FACS 或 M ACS 可分离特定的细胞群 3 畅单克隆抗体与抗体芯片技术将单克隆抗体作为探针, 采用微阵列点样机准确 快速 有序地点加在硅化基片或尼龙膜等载片上, 制成抗体芯片 (antibody array), 然后按照方阵检测法检测样本中相应的抗原或抗独特型抗体 通过自动化仪器和软件分析系统可快速获得高通量 高特异的实验结果 抗体芯片技术的发展对基因表达产物的分析以及有效药物新靶点的筛选具有重要的推进作用 4 畅单克隆抗体与抗肿瘤治疗用 McAb 作为载体与生物毒素 化疗药物或放射性核素等细胞毒物质交联, 制成 生物导弹, 其中抗体起到靶向作用, 细胞毒物质则发挥杀肿瘤效用, 这种治疗方法称为靶向治疗 ( targeted therapy) 靶向治疗提高了病灶区有效药物的浓度, 降低了药物对正常机体的毒副作用 常用的生物毒素包括白喉毒素 假单胞菌外毒素 蓖麻毒素等 ; 常用的抗肿瘤化学药物有阿霉素 抗生素 C1027 甲氨喋呤等 ; 常用的放射性核素是 131 I 188 Re 90 Y 等 5 畅单克隆抗体与自身免疫病治疗和移植抗排异治疗抗体可作用于引起自身免疫病 移植排斥的抗原靶点, 包括 T 细胞分化抗原 细胞因子 黏附分子等 通过抑制 清除这些激活的靶点, 可达到免疫治疗效果 目前已有多种单克隆抗体用于类风湿关节炎 系统性红斑狼疮 局限性回肠炎 多发性硬化症 器官移植等疾病的治疗之中 第三节基因工程抗体制备技术 多抗 单抗已广泛应用于医学和生物学检测, 取得了瞩目的成果, 但在反复用于人体疾病治疗中尚有一些难以逾越的障碍 鼠源单抗对人体具有较强的免疫原性, 反复使用可产生人抗小鼠抗体 (human anti mouse antibody,hama), 由此影响疗效 ;McAb 相对分子质量大, 难以穿透肿瘤部位 ; 人源单抗的制备在技术上存在着细胞融合率低 杂交瘤不稳定 抗体产量低等缺点, 并且人体不能随意免疫等问题 基因工程抗体技术的发展, 即第三代抗体的研制, 着手于克服上述问题 目前, 基因工程抗体的制备主要按以下线路进行 : 一是利用 DN A 重组技术对已有的鼠源单抗进 163
第二部分免疫学基本技术 行改造, 包括鼠源单抗人源化 小分子抗体片段制备及抗体融合蛋白的制备 ; 二是利用机体内固有的 抗体库, 从中克隆 筛选目的抗体 此外, 还可通过基因敲除法, 用替代有人 Ig 基因的小鼠, 以常规免疫方法制备人源抗体 编码人免疫球蛋白重链 κ 链 λ 链的基因分别位于 14 号 2 号和 22 号染色体上, 它们的长度约为 1 畅 5 ~ 2 Mb 重链由不少于 100 个 V 区基因 10 ~ 20 个 D 区基因和 6 个 J 区基因构成 κ 链由 76 个 V 区基因和 5 个 J 区基因构成 在 1 畅 5 ~ 2 Mb 区域中, 还包括各种抗体表达调控 抗体类别转换和亲和力突变的相关基因 抗体分子的重链和轻链的可变区决定了与抗原结合的特异性, 而可变区中 3 个互补性决定区 (CDRl CDR2 CDR3), 即氨基酸序列变动较大的区段, 与抗原决定簇空间构象互补性相关 每个 CDR 由 15 ~ 16 个氨基酸组成 从基因角度看, 可变区基因中的 CDR 核苷酸序列因抗体而异, 而支撑 CDR 的骨架区则相对比较保守 根据抗体及其基因的这些结构特点, 用基因工程技术可以创造出各种新型的抗体 一 鼠源抗体人源化 1 畅嵌合抗体鼠源单抗治疗疾病容易产生 H A M A, 并且主要是针对抗体 C 区的 H A M A 从鼠源杂交瘤细胞基因中分离功能性 Ig V 区基因与人 B 细胞中抗体的 C 区基因按一定方式拼接制备而成的抗体称为嵌合抗体 (chimeric antibody) 这种抗体的 Fab 区是鼠源的,Fc 区是人源的 ( 图 6-9) 较好地解决了针对 C 区的 H A M A 反应 这一方法是于 1984 年美国科学家 Morrison 等首创 目前已有多种不同特异性的嵌合抗体经 FDA 批准进入临床使用, 显示了良好的应用前景 在构建嵌合抗体时, 如选用细胞毒性较强的 IgGl 和 IgG3 的 C 区, 则可增强抗体免疫治疗的功能 嵌合抗体的制备主要包含以下一些步骤 (1) 嵌合基因的构建 1 用探针从杂交瘤细胞基因文库中钓取 V 区基因 V H 基因由 V D J 三个部分组成 在小鼠第 12 号染色体中, 大约有 300 个 V 片段,12 个 D 片段,4 个 J 片段 V D J 三个片段各取其一经过重排形成 V - D - J, 就可构成有功能的抗体可变区基因 2 用 PCR 方法扩增抗体可变区基因从杂交瘤细胞中提取的 DN A 或 R N A, 将后者反转录成 DN A, 然后利用 PCR 或 R T PCR 扩增可变区基因 3 嵌合基因的构建扩增所得的鼠源 V 区基因经基因 图 6-9 人鼠嵌合抗体的制备过程 测序鉴定确认以后, 将 V H 基因插入带有人重链 γ3 恒定区基因的 S V2 gpt 质粒中构建成人 - 鼠重链基因 ; 将 V L 基因 164
第六章抗体制备技术 第三节基因工程抗体制备技术 插入带有人轻链 κ 恒定区基因的 ps V2neo 质粒中构建成人 - 鼠轻链基因 (2) 表达载体的构建与表达构建成人 - 鼠嵌合轻 重链基因以后, 将获得的嵌合基因, 通过脂质体转染 SP2 /0 等骨髓瘤细胞或 C H O 等真核细胞, 利用适当的筛选标志 ( neo 基因或 g pt 基因 ) 进行筛选, 可获得阳性表达克隆 把转染细胞置于 96 孔细胞培养板内培养, 采用 ELISA 筛选阳性细胞, 再经克隆化培养即可得到阳性细胞及其所分泌的嵌合抗体 2 畅改型抗体有些 H A M A 反应是针对 V 区的, 形成抗独特型抗体 如果把嵌合抗体中鼠可变区的骨架即 FR 区替换成人的 FR 区, 仅保留决定抗体特异性和亲和力的 CDR 区, 这种抗体称为改型抗体 (reshaped antibody) 或称为 CDR 移植抗体 (CDR grafting antibody) 改型抗体也可视为把鼠源的 CDR 嵌入人抗体之中 改型抗体的人源化率可以达到 97 %, 最大程度地降低了 H A M A 反应 但在实际制备中很容易导致抗体特异性改变 目前研究聚焦于寻找既保持抗体特异性又降低免疫原性的最佳点 二 小分子抗体分子结构完整的抗体相对分子质量大, 在用于治疗中难以有效地穿行于病灶区域 1988 年 Sherra,Plickthun,Better 等成功地使 Fab 段抗体和 Fv 片段抗体在大肠杆菌中准确装配和表达, 并能保持其与抗原的结合特性, 由此,Fab Fv 等小分子抗体的研究蓬勃开展起来 小分子抗体包括 Fab 段抗体 ( 由 V H CH1 和完整的轻链和 Fd 构成 ) Fv 抗体 ( 由 2V H 和 2VL 构成 ) ScFv 抗体 ( 单链抗体,V H 和 VL 之间由一连接肽连接而成 ) 单域抗体 ( 仅由 V H 组成 ) 抗体 MRU( 最小识别单位, 由一个 CDR 组成 ) 等 ( 图 6-10) 小分子抗体显然不具有完整的抗原结合位点, 因而其特异性和亲和力较低 小分子抗体的优点是 : 制备简单 免疫原性弱 易进入病灶区, 可以作为导向药物的载体 缺点是 : 与抗原的结合能力弱 半寿期短 容易图 6-10 小分子抗体被清除, 从而影响到达肿瘤部位的抗体浓度 1 畅 Fab 段抗体 Fab 段抗体的大小约为完整抗体的 1 /3 可以用化学方法酶解完整的 Ig 而得到 Fab 段, 但是难以保证在酶解中不发生对抗体的损伤, 并且通过化学酶解难以大量制备 Fab 段抗体 通过克隆抗体 Fab 段的基因, 并通过合适的载体表达, 可产生大量匀质性 Fab 段抗体 Fab 穿透实体瘤的能力强, 在免疫治疗中有较高的肿瘤灶 / 血液浓度比 2 畅 Fv 抗体和单链抗体 Fv 抗体和单链抗体 (single chain antibody,scfv) 相对分子质量约为 25 000, 仅为完整抗体的 1 /6 Fv 是抗体的抗原结合部位, 由抗体重链 V 区与轻链 V 区依靠非共价键连接而成, 尽管其有高度保守 165
第二部分免疫学基本技术 的可变区骨架序列, 但是在结构上不稳定 单链抗体由抗体重链 V 区与轻链 V 区通过人工合成的由约 15 个氨基酸组成的连接肽 (linker) 连接而成, 一定大小的连接肽既增强了单链抗体的稳定性又保持了单链抗体的空间构象 单链抗体是目前研究最活跃的基因工程抗体之一 由单链抗体与毒素 酶以及免疫效应分子等基因通过 DN A 重组工程制备的融合蛋白在疾病研究与治疗中受到人们极大的关注 与 Fab 比较, 单链抗体的亲和力相对较低 3 畅单域抗体单域抗体 (single domain antibody) 指 V H 或 V L, 系通过基因工程方法使抗体重链或轻链的 V 区在大肠杆菌中表达而成 这种仅有重链或轻链 V 片段的抗体分子大小仅为完整抗体的 1 /12, 与其同源性抗原结合的特异性与完整抗体的基本一致, 但是结合紧密程度没有完整抗体好 4 畅最小识别单位抗体最小识别单位 (minimal recognition unit,mru) 是具有抗原结合活性的最小识别单位, 由可变区中的单个 CDR 构成, 相对分子质量仅为完整抗体的几十分之一,M R U 也具有与抗原结合的能力, 但特异性不好, 亲和力极低, 实际应用受到限制 三 抗体融合蛋白 1 畅重组免疫毒素抗体与毒素经化学方法形成的偶联物称为免疫毒素 (immunotoxin) 化学偶联易造成抗体损伤 偶联产物不均一 偶联物不稳定以及在体内容易脱离 现代免疫毒素是一类重组免疫毒素, 又称融合蛋白 (fusion protein), 其以 DN A 重组技术将单链抗体基因的 C 末端与毒素蛋白基因连接, 然后在宿主细胞中表达而成 ( 图 6-11) 重组免疫毒素具有相对分子质量小 穿透力强 副作用小 制备方法简单以及制备成本较低等优点 目前, 进入临床应用的免疫毒素大多数是针对血液肿瘤, 因为血液肿瘤比实体瘤更易靶向, 并且可以容易地获得肿瘤细胞进行体外毒性试验和抗体结合试验 重组免疫毒素的临床应用虽然具有一定的疗效, 也面临靶特异性问题 毒素的免疫原性问题等 166 图 6-11 化学合成免疫毒素与重组免疫毒素 2 畅其他抗体融合蛋白单链抗体不仅可与毒素构成融合蛋白, 还可与 IL 2 T N IFN 等细胞因子经基因工程制成融合蛋
第六章抗体制备技术 第三节基因工程抗体制备技术 白, 通过抗体的特异性将细胞因子物质带到病灶区, 直接在病灶区发挥增强免疫作用及抗肿瘤效应 单链抗体还可与导向酶构成融合蛋白, 设计 抗体导向酶 - 前体药物 疗法, 即利用抗体的导向作用, 将前体药物专一性活化酶选择性地靶向病灶, 使前体药物在病灶区转化为活性分子, 既发挥了抗病作用, 又减低了药物的毒副作用 抗原靶点 抗体及效应分子关系见图 6-12 3 畅胞内抗体胞内抗体 (intracellular antibody, intrabody) 是应用 DN A 重组技术对单链抗体进行适当修饰, 使之定向分布于胞浆内 胞核内或内质网内, 从而特异性地干扰或阻断某些生物活性物质的合成 加工和分泌过程, 引起细胞一系列生物特性的改变 内质网是蛋白质加工, 分泌的场所, 抗体滞留其内增加了抗体与靶蛋白作用的机会 迄今图 6-12 单克隆抗体的应用大部分用于肿瘤治疗的胞内抗体多采用这样一个策略, 即在单链抗体的羧基端引入一个内质网滞留信号分子, 通过滞留在内质网的抗体作用于某一与肿瘤相关的蛋白, 造成肿瘤蛋白分泌性流产 HIV 1 包膜糖蛋白位于成熟病毒颗粒的外层, 其前体蛋白 gp160 在高尔基体被剪切为成熟的包膜糖蛋白 gp120 和 gp41 胞内抗体可以结合 gp160, 从而阻止其成熟, 造成 HIV 失去感染力 胞内抗体的研究开辟了一条灭活靶蛋白的新途径, 也是对转基因动物 基因敲除 技术的一种补充, 随着胞内抗体基因转导效率进一步提高, 其有望在肿瘤 艾滋病等疾病机制的研究与治疗中发挥重要作用 4 畅双价抗体双价抗体 (bivalent) 是由两个分别针对不同抗原决定蔟的 scfv 聚合成的抗体, 又称双特异性抗体 (bispecific antibody,bsab) 双功能抗体 (bifunction antibody) 早期的双特异性抗体是用化学交联的方法把两个不同特异性的抗体连为一体, 随后曾采用二次杂交使两株不同特异性的杂交瘤细胞再融合成为双特异性的抗体 基因工程方法制备的双特异性抗体是通过两个特异性抗体基因重组表达而成 其中一个针对肿瘤细胞, 一个针对免疫效应细胞, 由此使效应细胞和靶细胞更有效地结合 通过基因工程方法制备的双特异性抗体具有相对分子质量小 制备过程简单 制备成本低等优点, 可应用于免疫治疗 5 畅抗体酶抗原抗体反应和酶与底物反应具有相似性 当与抗体配对的抗原是底物时, 这个抗体就具有类 167
第二部分免疫学基本技术 似于酶一样的催化特性, 即称为抗体酶 (abzyme) 或催化抗体 (catalytic antibody) 传统抗体酶制备方法有半抗原诱导法和拷贝法等 酶催化底物往往有中间过渡体, 以过渡体免疫动物即可得到抗体酶, 然而过渡体是一种不稳定物质, 其存在时间极其短暂 半抗原诱导法即先设计一个与过渡体在形状 基团 带电状况 酸碱度相类似的稳定物质, 这种物质往往是一种小分子半抗原, 须连接载体使之成为完整抗原以后免疫动物, 制备抗体酶 拷贝法是基于 Jerne 的免疫网络学说, 即抗独特型抗体 Ab2β 具有抗原内影像作用 可以模拟抗原决定簇, 以酶作为抗原免疫动物产生抗体, 再以免疫所得的抗体作为抗原进一步免疫动物, 由此产生的抗抗体就可能具有酶活性 基因工程制备抗体酶的思路即是把酶的基因植入到抗体的可变区基因中, 然后通过合适的载体进行表达 抗体酶技术受到众多专家的重视 抗体酶可在特定的氨基酸顺序上切割蛋白质 具有切割血液纤维蛋白 ( 血凝块的主要成分 ) 的抗体酶, 可用于治疗冠心病 通过抗体酶作用于癌变细胞膜表面的特殊蛋白质上, 这样就可以致命性地破坏癌细胞膜而用于治疗癌症 另有一些抗体酶可识别并破坏病毒中由氨基酸连接形成的特殊片段, 从而防止病毒与靶细胞结合, 发挥预防与治疗病毒感染 抗体酶技术可提供新的催化剂, 使那些现在还不能利用天然酶催化的复杂反应实现酶催化反应 自然酶的产生须经历长期的物种选择, 抗体酶的制备则快捷得多 尽管人们对抗体酶寄予厚望, 目前的研究仍处于如何制备具有高效催化活性的抗体酶的阶段 6 畅抗原化抗体天然抗原结构复杂且纯化困难, 而人工制备的肽段存在免疫原性弱 结合力弱和结构稳定性差等诸多缺陷, 从而制约了对抗原的研究和应用 所谓抗原化抗体 (antigenized antibody,agab), 即将编码抗原表位的 DN A 片段插入抗体重链的 CDR3 序列中进行表达, 产生具有天然抗原表位构象和免疫原性的新型抗体 AgAb 能在 Ig V 区的三维折叠结构内表达寡肽, 使抗原肽获得与其天然蛋白相似的稳定构象, 增强了其诱导机体产生应答的能力 AgAb 能使免疫应答局限于所选定的抗原部位, 此种聚焦效应排除了机体对与抗原功能无关部分的不良应答 通过表达外源性蛋白肽和自身蛋白分子,Ag Ab 可在免疫应答的不同阶段发挥作用, 因而在疾病的免疫防治上具有广阔的应用前景 目前已尝试将 Ag Ab 基因转染 B 细胞系, 以期获得可特异性诱导 C T L 活化的新型疫苗 AgAb 还可发展为提供两个以上肽段的表位表达系统 作为一种理想的疫苗,AgAb 可诱导构象依赖性抗体以攻击病原体 中和毒素, 或阻断异常的免疫应答过程 第四节抗体库技术 生物在进化过程中, 为了应对各种外源异物及内源有害物而渐渐形成了免疫防御系统 抗体是免疫防御系统中最主要的蛋白分子 从抗体种系基因的多样性 种系基因重排和体细胞突变等推算, 一个哺乳动物体内可以产生 10 6 ~ 10 8 种针对不同抗原的抗体, 这么多抗体成 库 存在 ( 更确切地说是以基因的形式存在于 B 细胞中 ), 任由抗原从 库 里选择相应的 B 细胞, 由此形成特异性体液免疫 抗体库 (antibody library) 技术就是利用 PCR 技术扩增 B 细胞内全套抗体可变区基因, 随机配对重组入载体, 从而在体外建立一个相应于体内 B 细胞库的抗体多样性基因文库 类似体内 克隆选择 过程, 以目标抗原从人的抗体多样性基因文库中筛选任何所需的抗体, 并且是全人源抗体 简而 168
第六章抗体制备技术 第四节抗体库技术 言之, 抗体库技术就是要把人类所有抗体的基因扩增出来, 并尽量保持抗体原有的多样性 然后通过目的抗原去淘选目的抗体, 并通过错配 PCR 半合成的 CDR 片段等方法模拟人体内抗体亲和力成熟的过程, 借此获取我们所需要的 高亲和力的目的抗体, 用于疾病的治疗 以大容量抗体库作为技术平台, 制备治疗性全人源抗体是继杂交瘤技术之后免疫学发展的又一次飞跃 尤其在制备针对人体自身抗原或有毒抗原的人源化抗体时, 摆脱了以往制备全人源抗体须进行体内免疫之不便 抗体库技术的问世已有十几年, 抗体筛选系统 体外模拟亲和力成熟技术也有了很大的改进, 由此使体外诱导抗体的产生更近乎于自然 一 初期的抗体库技术噬菌体是一种病毒, 一种仅感染细菌的病毒 由于噬菌体 DN A 结构简单, 表达蛋白质种类少而被用作基因工程载体 1989 年美国 Scripps 研究所 Huse 等首次报道用 λ 噬菌体分泌型表达载体系统构建了一个未经免疫的小鼠 Fab 组合抗体库 (combinatorial immunoglobulin library), 并从中筛选出抗 NPN 的 Fab 抗体 其首先将小鼠抗体的重链基因库和轻链基因库克隆在不同的噬菌体上, 再将两个库通过巧妙设计的 EcoR Ⅰ 位点进行随机组合, 使所得到的组合载体上同时携带着一个重链基因和一个轻链基因 ( 图 6-13) 经包装 感染 表达, 用已知抗原筛选出具有抗原特异性识别功能的噬菌体克隆 这种以噬菌体作为载体所建立的抗体库称为噬菌体展示抗体库 (phage display antibody library) 如果构建的重链库和轻链库库容各有 10 8, 组合多样性可达 10 12 λ 噬菌体的 DN A 是双链分子, 基因组大小约为 49 kb, 其中约有 60 % 的基因组对其增殖是必需的, 但其所能接受外来基因的量约是其全部基因的 5 %, 筛选时工作量大, 可用性受到一定限制 图 6-13 Fab 组合抗体库的构建原理目前应用更广的载体系统是来自大肠杆菌单链噬菌体表达系统 大肠杆菌丝状噬菌体是一类单链环状的 DN A 病毒, 包括 M13 fl fd 等噬菌体 ( 图 6-14) 丝状噬菌体仅感染雄性大肠杆菌, 其通过表面 P3 蛋白与大肠杆菌性鞭毛接合而进入宿 主细胞, 在宿主细胞内进行 DN A 复 图 6-14 丝状噬菌体结构示意图 169
第二部分免疫学基本技术 制 增殖, 然后被释放出宿主细胞外, 进行新一轮感染 当宿主细胞成片感染以后, 可以形成模糊的噬菌体斑 ( 图 6-15) 丝状噬菌体与 λ 噬菌体的区别之一是前者被宿主细胞释放以后不会导致细胞裂解, 即不会致细胞内源性蛋白释放而干扰筛选 20 世纪 80 年代末期, 美国研究者 Stephen 等研制了单链噬菌体载体系统,Smith 等首先利用这一系统表达了多肽库, 随后, 英国 Winter 等和美国 Lerner 等将其用于抗体库表达,1991 年 Barlias 等成功建立了人抗体库, 获得了人源抗体 抗体蛋白与噬菌体外壳蛋白以融合状态存在于噬菌体表面, 抗体仍具有与抗原结合的特性, 因而只需利用固定化的抗原就可以从容筛选到带有特异性抗体蛋白的噬菌体克隆 以活噬菌体的形式高效率地筛选 富集 克隆和繁殖目的基因 ; 并通过 吸附 - 洗脱 - 扩增 过程, 可轻易筛选容量达 10 8 个噬菌体以上的抗体库 由于此类载体为附着型载体, 所构建的抗体库可称为附着型抗体库 还有一种表达型载体, 可根据需要表达附着型抗体或可溶性抗体 在外壳蛋白基因 Ⅲ 和抗体基因之间引入一个琥珀突变密码子 T AG, 当噬菌体感染琥珀突变抑制菌种 (SupE) 时,T A G 密码子被读为谷氨酸, 抗体以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面, 当为琥珀突变菌种时, 则 T AG 为终止密码子, 抗体以可溶性蛋白的形式分泌于细菌体外, 附着型抗体用于筛选十分方便, 而可溶性抗体对进一步分析与鉴定十分有利 170 图 6-15 丝状噬菌体的生活周期 抗体库制备抗体与常规制备单克隆抗体相比较有如下的优越性 :1 抗体库技术省去了细胞融合
第六章抗体制备技术 第四节抗体库技术 的步骤, 避免了因杂交瘤不稳定而需要反复亚克隆等繁琐程序 ;2 抗体库技术扩大了抗体筛选容量, 可筛选 10 6 以上个细胞克隆, 而单克隆抗体技术一般筛选能力在上千个细胞克隆 ;3 抗体库技术直接克隆到抗体的基因, 便于进一步构建各种基因工程抗体及抗体片段 ;4 抗体库技术得到的抗体可以在原核细胞系统表达, 降低了抗体制作成本 ;5 构建抗体库时, 轻链和重链可变区基因可以在体外随机组合, 可产生体内不存在的轻 重链组合, 有可能得到新的特异性抗体 二 噬菌体抗体库技术 1 畅噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术 (phage display technology) 是基于外源 DN A 片断能被插入到丝状噬菌体表达外壳蛋白 (P3 蛋白 ) 的基因中, 由此导致外源 DN A 片段所编码的氨基酸序列可与丝状噬菌体外壳蛋白一起以融合蛋白的形式表达并展现在噬菌体的表面 当外源 DN A 是编码人 Ig 的基因时, 则噬菌体表面可展现人 Ig 人们将带有这种融合蛋白的噬菌体称为融合噬菌体 (fusion phage) 噬菌体表面的 Ig 可被相应抗原选择性结合, 利用靶分子 ( 抗体 受体蛋白 抗原等 ) 与表达在噬菌体表面的抗体 多肽或蛋白质进行特异性 非共价结合, 采用效率高 特异性强的亲和筛选方法, 可筛选获得目标融合噬菌体 敏感的筛选方法可以从 10 9 个克隆组成的文库中筛选出所需要的目标基因 2 畅噬菌体抗体库制备的基本程序噬菌体抗体库制备的基本程序可用图 6-16 简化表示, 操作步骤如下 : (1) 收集不同人群 足够量的淋巴细胞, 提取 DN A 或提取 mrn A 并转录成 cdn A 理论上, 利用 PCR 方法从正常人外周 B 细胞中扩增得到的可变区基因库可以达到多样化, 但实际上, 每一个体的免疫状态各异, 抗体的多样性难以预测 因此, 采用经自然免疫或体外免疫等方法构建可变区基因文库的效率更高 (2) 设计模板, 扩增 DN A 中的抗体可变区基因 噬菌体可以表达 Fab ScFv 及双链抗体, 但以表达 Fab ScFv 图 6-16 噬菌体抗体库构建过程为主 用 PCR 方法直接将轻链和重链可变区基因组合在一起构建 Fab 或 ScFv, 也可分别将携带轻链或重链的基因载体导入同一个菌体内 (3) 把抗体可变区基因克隆到噬菌体外壳蛋白的基因中, 通过噬菌体的主动侵染作用或联合使用电穿孔法, 将含有抗体 DN A 片段的噬菌体转染大肠杆菌, 构建重组噬菌体库 (4) 以目的抗原包被固相载体 ( 聚苯乙烯管 ), 以经扩增的噬菌体与固相抗原反应, 通过洗涤获取 171
第二部分免疫学基本技术 阳性噬菌体, 进一步扩增培养 此即谓 吸附 - 洗脱 - 扩增 经过几轮 吸附 - 洗脱 - 扩增 过程, 即 可筛选到所需的融合噬菌体 ( 图 6-17) 图 6-17 噬菌体抗体的亲和筛选 (5) 采用突变或链置换使亲和力成熟 从 天然 抗体库中筛选得到的抗体, 亲和力一般较低 体外提高抗体亲和力通常有两条途径 第一条途径是对可变区基因进行体外突变, 模拟体内抗体亲和力成熟 (affinity maturation) 的过程 可变区基因体外突变有两种方式 : 一是可变区基因的体外随机突变, 包括改变 PCR 扩增条件, 造成易错配的 PCR 扩增或利用在突变菌株中多次传代等模拟体内的体细胞突变, 但这种方法产生的突变率低 而且大多数突变位点并不发生在抗原结合部位, 因此对亲和力的提高并不明显 二是针对 CDR 的随机突变和半随机突变以及寡核苷酸诱导的定点突变 因为 CDR 是影响亲和力的关键部位, 所以能获得亲和力显著提高的突变体 另一条途径是进行链 替换 (chains shuffling) 链 替换 技术是抗体体外亲和力提高的特有方式 抗体与抗原结合的特异性, 住往只决定于其中的一条可变区, 多数情况下 V H 的作用更大 这些特异性的 V H, 可与多种不同的 V L 组合, 而不改变抗体片段对抗原结合的特异性 利用这一性质, 从组合抗体库中得到特异性抗体片段后, 可将特异性的 V H 基因, 再与 V L 基因文库进行组合, 通过构建次级文库, 增加特异性的 V H 与各种 V L 配对的可能性, 从中找到最佳配对的 V L, 产生高亲和力的特异性抗体片段 3 畅噬菌体抗体库技术的特点 (1) 建库方法简单 快速 高效 (2) 将抗体的基因型与表型密切联系在一起 (3) 可以模拟固有免疫系统亲和力成熟过程 机体经抗原刺激后所产生的抗体其亲和力是逐步升高的, 尽管亲和力升高过程的确切分子机制目前尚不清楚, 但已可通过基因突变 体外淘选等方法改进抗体的亲和力 (4) 无需经过人体免疫过程 从理论上讲,10 6 ~ 10 8 的库容就可能包容所有的抗体 利用目的抗原即可从抗体库中筛选出特异性抗体 (5) 可替代动物多克隆抗体 由此制备所得的全人源抗体, 在用于人类疾病治疗中可减少排斥反应 172
第六章抗体制备技术 第四节抗体库技术 (6) 易规模化生产 由于细菌繁殖速度比真核细胞快, 且培养成分简单, 培养成本不高, 利于大量制备高纯度抗体 (7) 目前噬菌体抗体库技术还受两方面的因素所困惑 :1 以丝状噬菌体作为载体, 并非所有的抗体片段都能在大肠杆菌中进行分泌性表达, 而且许多抗体基因在大肠杆菌中表达, 常造成宿主菌生长缓慢, 甚至裂解, 由此导致抗体基因在文库中消失 2 从未经免疫动物的抗体库获得的抗体亲和力不高, 体外亲和力成熟技术还不尽人意 三 其他展示抗体库技术 1 畅细菌表面展示技术细菌质粒 (plasmid) 是细菌菌体内的核外 DN A 分子 尽管质粒非细菌生长繁殖之必需, 但其可赋予细菌某些遗传特征, 如耐药性的形成 细菌素的产生等 细菌表面展示技术 (bacteria display technology) 是通过质粒把人源抗体基因转染到细菌蛋白质基因之中, 使细菌菌体表面同时表达其自身蛋白质和人源抗体蛋白, 再经淘选获取表达目的抗体的菌株 早先所用的细菌为大肠杆菌 伤寒杆菌等革兰氏阴性菌, 随后采用葡萄球菌 链球菌等革兰氏阳性菌 细菌体积比噬菌体大得多, 所以可采用 FACS 快速进行阳性菌的筛选, 使富集阳性克隆的能力明显提高 质粒 DN A 导入细菌的方式有化学转化法和电穿孔法 电穿孔法操作简单 不需制备感受态细胞 转化效率高, 所以常用作文库的构建 由于细菌表面展示库容较小, 不能完全装载人源抗体库源, 造成抗体多样性的限制 2 畅酵母表面展示技术酵母是单细胞真核生物, 遗传背景清晰, 不产生毒素, 其所合成的蛋白质可以完成具有与哺乳动物细胞相似的折叠过程和糖基化修饰过程, 所以, 酵母表面展示技术 (yeast display technology) 所表达产生的抗体具有抗体介导的细胞毒作用 ( ADCC) 基因工程所用的酵母主要是酿酒酵母和毕赤酵母两种, 后者能以甲醇作为能源和碳源, 并具有高表达 高稳定 高分泌等特性 通过酵母质粒把抗体基因转染到酵母中的 α - 凝集素基因中, 使融合基因表达抗体与 α - 凝集素于酵母表面, 通过 F ACS 技术进行大规模筛选, 获取表达目标抗体的酵母 酵母表达的缺点是转化效率低, 并且酵母细胞表面抗原多, 在筛选中容易出现非特异性反应 3 畅哺乳动物细胞表面展示技术噬菌体 细菌 酵母等表面展示系统通常适用于展示小分子抗体, 哺乳动物细胞在合成蛋白质过程中因为具有准确装配 折叠和糖基化过程, 所以更适合用于展示全抗体 将抗体轻链和重链可变区基因和恒定区基因相连并克隆到真核表达载体中, 再转染哺乳动物细胞, 即可在哺乳动物细胞表面表达人源全抗体 抗体在哺乳动物细胞表面展示同样存在库容小的问题, 但如果抗体基因来自经自然免疫或体外免疫的淋巴细胞时, 则可较容易地从中筛选到特异性抗体 4 畅核糖体展示技术核糖体存在于原核或真核细胞的胞浆或线粒体内, 主要由 rr N A 和蛋白质组成, 呈葫芦状, 是细胞内蛋白质合成的场所 核糖体展示技术 (ribosome display technology) 是继噬菌体展示技术之后的一种新技术, 一种完全在体外展示与筛选的技术 与其他展示技术比较其有 2 个优点 :1 蛋白质文库的多样性不再受到细菌转化效率的影响, 由此可以使其库容达到 10 14, 甚至更大 ;2 核糖体展示中包含多次 PCR 过程, 可模拟进化过程 如果同时采用低保真聚合酶或通过错配 PCR, 则容易增加多样 173
第二部分免疫学基本技术 性 由于事先从 D N A 文库的蛋白质编码序列中去除了终止密码, 因此可以形成 mr N A - 核糖体 - 编码蛋白三重复合体, 可以直接用于固相筛选 在筛选中洗去无关复合体, 再利用 ED T A 解离相关复合体, 就可以获取目的 mrn A,mR N A 经 R T PCR 反转录成 DN A, 由此组成新的 DN A 文库, 再进行下一轮筛选 经过一轮筛选, 复合物的富集率可以提高 100 ~ 1 000 倍 核糖体展示过程见图 6-18 图 6-18 核糖体展示过程 四 抗体库的应用目前, 抗体库技术的应用主要在两个方面 : 一是用于制备全人源抗体 ; 二是改良基因工程抗体的性能包括提高抗体的表达量, 增强抗体的特异性以及改善抗体的亲和力 1 畅制备全人源抗体以抗体库制备全人源抗体可以从正常人群中克隆全套抗体基因 目前已成功构建了大容量天然抗体库, 库容量达到了 10 10 以上, 其功能性和多样性在不断地改善和提高 目前主要用于制备抗细胞因子 细胞受体 黏附因子 肿瘤相关抗原等抗体 这些抗体都具有良好的应用前景 但是从正常人群得到的全套抗体基因是未经免疫的自然抗体, 在制备过程中需要经历亲和力成熟等过程 我们也可以采用经免疫或经自然感染后的人群的 B 细胞, 从中克隆全套抗体基因建立抗体库 例如从经疫苗免疫者 微生物感染者 自身免疫患者以及肿瘤患者等群体中获取 B 细胞 由此建立的抗体库虽然库容较小, 但是容易筛选得到目的抗体, 并且抗体已经历了亲和力成熟过程 由此制备的抗体有抗艾滋病毒 抗肝炎病毒 抗呼吸道病毒 抗血型抗体以及黑色素瘤抗体等等 2 畅改良基因工程抗体基因工程抗体的缺陷是表达量低 特异性不够好 亲和力差 不断改进中的抗体库技术可以弥补基因工程抗体的缺陷 例如把低表达抗体基因置于高突变菌体中表达, 引入随机突变, 经筛选后即可获得高表达抗体基因 抗 17 β 雌二醇单抗有时会与睾丸酮发生交叉反应, 把此抗体的 Fab 段基因在大肠杆菌中表达, 并通过错配 PCR 在 V H 中引入随机突变, 构建噬菌体抗体库, 并以 17 β 雌二醇和睾丸酮进行固相竞争反应, 由此可以筛选得到高特异性的抗 17 β 雌二醇单抗 提高抗体亲和力是改造基因工程抗体最重要, 也是最基本的过程 上述工作尚在不断探究之中 由抗体库衍生而成的肽库是蛋白质研究的一个新的领域 ( 余奇文文, 刘欢图 ) 174
第六章抗体制备技术 辅读材料 辅读材料 抗体转基因动物的制备技术 利用转基因动物生产人抗体是抗体人源化改造的最高阶段 抗体转基因动物 (transgenic animal) 是采用人工方法将人的抗体基因组导入动物的受精卵 早期胚胎细胞或体细胞中, 并与动物本身的 基因组整合, 随着细胞的分裂增殖, 从而使抗体基因能够正常 稳定地表达并遗传的工程化动物 利用转基因动物生产的人抗体具有如下优点 :1 抗体转基因动物是将人抗体基因组导入动物体 内而构建成功的, 通过任何抗原免疫后均能产生相应的特异性人抗体, 方便 快捷, 而且可以长久利 用 ;2 抗体转基因动物生产的完全是人抗体, 并具有与人最为接近的糖基化修饰, 因而该抗体具有结 合抗原和免疫效应的双重功能 ;3 抗体转基因大动物可以在短时间内生产人的抗体, 不但满足临床 科研的需要, 还能保护人类免受新型病毒 细菌等突发事件的危害 抗体转基因小鼠的制备流程见图 6-19 1 制备 假孕母鼠 : 输精管结扎后的绝育雄鼠与代孕雌鼠交配, 形成具有怀孕症状的假孕母鼠 ;2 准备受精卵 : 给受精 卵提供雌鼠注射激素, 使其超排卵并与雄鼠交配, 受精 后自雌鼠输卵管内收集受精卵 ;3 导入抗体基因 : 用显 微注射装置将含有抗体基因的质粒导人受精卵的雄性 原核内 :4 胚胎移植 : 将导入抗体基因的受精卵自背部 移植入假孕母鼠输卵管内, 使胚胎在养母体内发育成 熟 ;5 分子生物学检测子一代小鼠的基因型 由于人抗体的编码基因比较复杂, 在生产人抗体 的转基因动物研究初期, 只能将部分人抗体基因导入 小鼠体内 1989 年 Brüggemann 等首次将 25kb 长的 人 Ig H 基因外显子拼接后导入小鼠受精卵内, 获得了 一系列能产生人 Igμ 链的转基因小鼠 该实验证明人 抗体基因能在小鼠体内表达 ; 随后该小组在 1991 年, 将 100kb 的人 Ig H( V H 的 6 个片段及部分 D JH Cμ 片段 ) 基因导入小鼠, 发现导入片段能在异种细胞内发 图 6-19 显微注射法制备转基因小鼠流程 生重排,Ig M 表达量为 50 μg /ml 该实验奠定了转基因小鼠表达人抗体的基础 由于转基因小鼠的 内源性 Ig 基因率先表达, 影响了人 Ig 的表达, 随后出现了敲除鼠内源性 Ig 基因并导入人 Ig 基因的 小鼠, 提高了人 Ig 的表达量 1994 年,Green 利用酵母人工染色体作为载体, 成功地将 220 kb 的人 Ig 基因导入内源性 Ig 敲除的小鼠内, 其 Ig M 表达量增加到 350 μg /ml 事实证明导入越长的人抗体 基因组片段, 小鼠表达的人抗体量越多, 表达的抗体的种类越齐全 目前, 利用人工染色体能将 2 Mb 的人 Ig 基因片段导入小鼠体内, 该转基因小鼠产生的人 Ig 量竟然与鼠内源性 Ig 表达量相当 转基因小鼠生产人抗体的技术成熟后, 人们开始将生产人抗体的研究转向大动物, 因为大 动物经抗原免疫后在短时间内能够产生较多的抗血清 目前, 能够生产人 Ig 的动物有鸡 猪 175
第二部分免疫学基本技术 羊 牛等 抗体转染色体牛的制备流程见图 6-20 图 6-20 利用人工染色体制备转染色体牛的流程图利用重组系统将人免疫球蛋白轻 重链基因组连接到人工染色体相应位置, 转染 C H O 细胞后, 该含有人工染色体的 C H O 细胞经秋水仙素处理后, 形成染色体外由脂质双层包围的微细胞库, 人工染色体具有抗性基因, 经药物筛选出的微细胞与牛胎儿成纤维细胞融合, 融合的细胞注射到囊胚腔中, 随囊胚细胞进一步发育成牛胚胎, 最终形成含有人免疫球蛋白基因组的转染色体牛 ( 孙剑华文, 杜冰图 ) 思考题 1 畅比较多克隆抗体 单克隆抗体特性与应用中的差异 2 畅比较各种小分子抗体作为药物应用时各自的特点 3 畅了解目前有哪些抗体已作为药物用于疾病治疗 参考文献 1 畅焦炳华, 孙树汉. 现代生物工程. 北京 : 科学出版社,2007 2 畅沈倍奋, 陈志南, 刘民培. 重组抗体. 北京 : 科学出版社,2005 3 畅甄永苏, 邵荣光. 抗体工程药物. 北京 : 化学工业出版社,2002 4 畅沈关心, 周汝麟. 现代免疫学实验技术. 湖北 : 湖北科学技术出版社,1998 5 畅钱旻, 杜冰. 肽库的建立和应用. 见 : 马端. 生物学前沿技术在医学研究中的应用. 上海 : 复旦大学出版社,2007,217 248 6 畅 K 迸 hler G, Milstein C.Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined 176
第六章抗体制备技术 参考文献 specificity.nature,1975,256(5517) :495 497 7 畅 Azzazy H M, Highsmith WE. Phage display technology : clinical application and recent innovation.clin Biochem,2002,35(6) :425 445 8 畅 Bowley DR,Labrijin AF,Zwick MB et al.antigen selection from an HIV 1 immune antibody library displayed on yeast yields many novel antibodies compared to selection from the same library displayed on phage.peds,2007,20(2) :81 90 177