重 庆 医 学 年 月 第 卷 第 期 论 著 基 础 研 究 金 骨 莲 胶 囊 对 兔 膝 骨 关 节 炎 软 骨 保 护 作 用 的 研 究 王 胜 民 刘 毅 刘 波 桑 鹏 仲 鹤 鹤 孙 鹏 鹏 遵 义 医 学 院 附 属 医 院 骨 一 科 贵 州 遵 义 济 仁 骨 科 医 院 关 节 外 科 贵 州 铜 仁 摘 要 目 的 研 究 中 药 金 骨 莲 胶 囊 对 兔 膝 骨 关 节 炎 * 关 节 软 骨 中 白 细 胞 介 素 +& 白 细 胞 介 素 +& 肿 瘤 坏 死 因 子 表 达 水 平 的 影 响 探 讨 其 可 能 作 用 机 制 方 法 只 家 兔 分 为 组 空 白 对 照 组 只 模 型 对 照 组 只 金 骨 莲 胶 囊 组 只 $3 : : 氨 基 葡 萄 糖 组 只 $3 : : 除 空 白 对 照 组 外 其 余 均 按 改 良 %' 法 复 制 * 模 型 术 后 当 天 开 始 药 物 灌 胃 对 照 组 仅 灌 服 等 量 生 理 盐 水 次 天 连 用 周 周 后 处 死 家 兔 取 右 膝 股 骨 髁 及 胫 骨 平 台 大 体 观 察 采 用 3 评 分 评 价 关 节 软 骨 退 变 情 况 采 用 实 时 荧 光 定 量 "((;"( 法 检 测 股 骨 内 侧 髁 负 重 区 关 节 软 骨 +& +& 和 的 $(* 相 对 表 达 量 结 果 空 白 对 照 组 金 骨 莲 胶 囊 组 氨 基 葡 萄 糖 组 和 模 型 对 照 组 3 评 分 分 别 为 >>>> 分 3 评 分 依 次 升 高 组 间 比 较 差 异 均 有 统 计 学 意 义 金 骨 莲 胶 囊 组 和 氨 基 葡 萄 糖 组 种 炎 性 因 子 $(* 表 达 量 均 明 显 低 于 模 型 对 照 组 差 异 均 有 统 计 学 意 义 中 药 金 骨 莲 胶 囊 在 下 调 +&$(* 方 面 与 氨 基 葡 萄 糖 作 用 相 当 差 异 无 统 计 学 意 义 D 金 骨 莲 胶 囊 在 降 低 +& 和 $(* 方 面 优 于 氨 基 葡 萄 糖 作 用 差 异 均 有 统 计 学 意 义 结 论 中 药 金 骨 莲 胶 囊 可 不 同 程 度 下 调 关 节 软 骨 中 +& +& 和 炎 症 因 子 的 表 达 使 软 骨 退 变 的 部 分 因 素 得 到 控 制 从 而 起 到 保 护 关 节 软 骨 的 作 用 关 键 词 骨 关 节 炎 白 细 胞 介 素 白 细 胞 介 素 肿 瘤 坏 死 因 子 金 骨 莲 胶 囊 中 图 分 类 号 ( 文 献 标 识 码 * 文 章 编 号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随 着 社 会 老 龄 化 骨 关 节 炎 -,',* 的 发 生 率 逐 渐 升 高 * 是 以 关 节 软 骨 的 退 变 破 坏 及 骨 赘 形 成 为 主 要 特 征 的 慢 性 关 节 病 西 医 治 疗 * 主 要 是 药 物 玻 璃 酸 钠 注 射 手 术 等 治 疗 临 床 上 药 物 治 疗 主 要 以 氨 基 葡 萄 糖 为 代 表 来 保 护 关 节 软 骨 * 在 祖 国 医 学 中 属 痹 症 范 畴 肝 肾 亏 损 风 寒 湿 邪 痰 淤 痹 阻 为 其 主 要 病 因 民 间 治 疗 * 的 药 物 多 为 传 统 中 草 药 组 方 效 果 显 著 因 此 挖 掘 传 统 中 草 药 治 疗 * 是 目 前 研 究 的 焦 点 传 统 中 药 金 骨 莲 胶 囊 是 一 个 经 典 苗 药 组 方 主 要 由 透 骨 香 汉 桃 叶 和 金 铁 锁 等 制 成 具 有 消 炎 镇 痛 软 骨 基 质 保 护 等 疗 效 目 前 对 金 骨 莲 胶 囊 的 研 究 大 多 为 其 化 基 金 项 目 贵 州 省 科 技 厅 社 发 攻 关 基 金 资 助 项 目 黔 科 合 7E 号 硕 士 启 动 基 金 项 目 院 字 号 作 者 简 介 王 胜 民 : 硕 士 主 要 从 事 骨 关 节 炎 及 关 节 镜 的 研 究 通 讯 作 者 6$%$
重 庆 医 学 年 月 第 卷 第 期 表 引 物 序 列 基 因 上 游 下 游 片 段 大 小 2/ *"*"**"*** "**""""" +& ""**"""*"**"*** **""*"**"*"*" +& *****""""" """*"""**" **"***""""** *****""*** 学 成 分 药 理 作 用 组 织 培 养 等 关 于 其 对 * 的 保 护 作 用 少 见 报 道 年 月 笔 者 观 察 了 中 药 金 骨 莲 胶 囊 对 兔 膝 * 的 软 骨 保 护 作 用 并 探 讨 其 可 能 作 用 机 制 材 料 与 方 法 材 料 动 物 及 仪 器 健 康 成 年 家 兔 只 清 洁 级 体 质 量 3 雌 雄 不 限 由 遵 义 医 学 院 动 物 实 验 基 地 提 供 7( 型 病 理 组 织 切 片 机 德 国 &- 公 司 %$/ &=* 光 学 显 微 镜 北 京 世 纪 科 信 科 学 仪 器 有 限 公 司 +"(( 型 高 速 冷 冻 离 心 机 美 国 '-,$7- 公 司 8 型 核 酸 蛋 白 测 量 仪 美 国,/ 公 司 " 型 "( 扩 增 仪 美 国 )+(*8 公 司 "%-,C 荧 光 定 量 "( 仪 美 国 )+(*8 公 司 ( 主 要 药 物 及 试 剂 @ 离 心 柱 型 动 物 组 织 细 胞 总 (* 提 取 试 剂 盒 北 京 庄 盟 国 际 生 物 基 因 科 技 有 限 公 司 逆 转 录 试 剂 盒,$-7,/ ( (--! 实 时 荧 光 定 量 "( 试 剂 盒 7E)(,-$161; 均 购 于 日 本!( 公 司 金 骨 莲 胶 囊 批 号 规 格 粒 盒 贵 州 益 佰 制 药 股 份 有 限 公 司 盐 酸 氨 基 葡 萄 糖 片 批 号 规 格 片 片 盒 江 苏 正 大 清 江 制 药 有 限 公 司 68* 脱 钙 液 / D 北 京 7%,2 公 司 ( 方 法 ( 分 组 及 造 模 只 健 康 成 年 家 兔 适 应 性 喂 养 后 分 为 组 空 白 对 照 组 模 型 对 照 组 金 骨 莲 胶 囊 组 氨 基 葡 萄 糖 组 每 组 只 除 空 白 对 照 组 外 其 余 均 改 良 %' 法 造 模 耳 缘 静 脉 注 射 9 戊 巴 比 妥 钠 $3 术 区 备 皮 常 规 消 毒 行 右 膝 内 侧 切 口 暴 露 右 膝 关 节 腔 切 除 前 交 叉 韧 带 及 内 侧 半 月 板 行 抽 屉 实 验 确 认 前 交 叉 韧 带 已 完 全 断 裂 缝 合 关 节 腔 及 皮 肤 术 后 每 组 每 天 肌 肉 注 射 青 霉 素 钠 B3 连 用 单 笼 饲 养 并 每 日 驱 赶 ' (( 动 物 给 药 及 取 材 按 照 药 理 实 验 方 法 学 体 表 面 积 计 算 方 法 来 折 算 给 药 剂 量 兔 等 效 剂 量 为 人 剂 量 倍 金 骨 莲 胶 囊 组 和 氨 基 葡 萄 糖 组 对 应 剂 量 $3 : : 总 量 均 为 分 别 于 造 模 当 天 药 液 灌 胃 空 白 对 照 组 和 模 型 对 照 组 仅 灌 服 等 量 的 生 理 盐 水 次 天 术 后 周 空 气 栓 塞 处 死 家 兔 并 取 兔 右 膝 股 骨 髁 及 胫 骨 平 台 生 理 盐 水 冲 洗 干 净 大 体 观 察 后 分 别 放 于 液 氮 : < 及 9 福 尔 马 林 固 定 备 用 () 关 节 软 骨 3 评 分 标 准 苏 木 精 伊 红 6 染 色 软 骨 结 构 评 分 关 节 软 骨 结 构 光 整 如 常 分 软 骨 结 构 表 面 不 规 则 裂 隙 分 软 骨 血 管 翳 形 成 分 裂 隙 深 达 移 形 层 分 裂 隙 深 达 放 射 层 分 裂 隙 深 达 钙 化 层 分 软 骨 全 层 脱 落 分 细 胞 数 量 评 分 软 骨 细 胞 数 量 如 常 分 数 量 弥 漫 性 增 多 分 出 现 大 量 簇 集 样 细 胞 团 分 数 量 逐 渐 减 少 分 番 红 染 色 基 质 评 分 关 节 软 骨 基 质 染 色 正 常 分 染 色 轻 度 减 退 分 染 色 中 度 减 退 分 染 色 重 度 减 退 分 关 节 软 骨 基 质 不 着 色 分 潮 线 评 分 关 节 软 骨 潮 线 完 整 分 多 重 潮 线 分 (* 6 和 番 红 染 色 9 福 尔 马 林 固 定 右 膝 胫 骨 平 台 继 续 用 68* 脱 钙 液 脱 钙 常 规 脱 水 剥 离 关 节 软 骨 石 蜡 包 埋 行 $ 厚 度 切 片 二 甲 苯 梯 度 脱 蜡 乙 醇 梯 度 水 化 6 染 色 苏 木 精 染 色 $ 盐 酸 乙 醇 分 化 伊 红 染 色 $ 番 红 染 色 番 红 染 色 $ 二 甲 苯 透 明 中 性 树 胶 封 片 镜 检 根 据 3 评 分 标 准 评 估 软 骨 退 变 情 况 (++& +& 和 $(* 的 检 测 总 (* 的 提 取 液 氮 环 境 下 剥 离 及 研 磨 关 节 软 骨 严 格 按 照 试 剂 盒 说 明 书 操 作 提 取 (* 用 8 型 核 酸 蛋 白 测 量 仪 测 (* 浓 度 和 纯 度 8* 的 合 成 按 照,$-7,/)-,,(-% $-&,$-7,/( 64$- 1 &%,$-,&($ $-,& 总 (*&(-,-- & 总 反 应 体 系 & 在 < $ < <,-0-, 的 条 件 下 逆 转 录 成 8* 基 因 扩 增 以 8* 为 模 板 进 行 实 时 荧 光 定 量 "((;"( 严 格 按 照 7E)(,--;"( -, 1 试 剂 盒 说 明 书 进 行 反 应 体 系 (-,-- &7E)(,-$161 ; &8*& 上 下 游 引 物 上 海 生 工 公 司 合 成 表 各 & 总 体 积 & 扩 增 条 件 < 预 变 性 < < 循 环 次 实 验 数 据 采 用 " 法 " 为 荧 光 达 到 阈 值 时 所 需 "( 的 循 环 数 分 析 +& +& 和 的 $(* 相 对 表 达 量 ) 统 计 学 处 理,/',$ 软 件 进 行 统 计 分 析 计 量 资 料 以 >, 表 示 多 样 本 均 数 比 较 用 单 因 素 方 差 分 析 -5** 两 组 均 数 比 较 使 用 两 独 立 样 本 资 料 的 检 验 检 验 水 准 D 以 为 差 异 有 统 计 学 意 义 ( 结 果 ( 膝 关 节 大 体 情 况 空 白 对 照 组 右 膝 关 节 无 肿 大 体 质 量 无 明 显 增 减 关 节 软 骨 透 明 表 面 光 滑 平 整 色 泽 正 常 模 型 对 照 组 右 膝 关 节 肿 胀 明 显 体 质 量 明 显 减 轻 关 节 软 骨 表 面 粗 糙 部 分 可 见 明 显 骨 赘 形 成 色 泽 灰 暗 部 分 软 骨 剥 脱 并 显 露 软 骨 下 骨 金 骨 莲 胶 囊 组 右 膝 关 节 稍 肿 胀 体 质 量 减 轻 不 明 显 关 节 软 骨 表 面 稍 粗 糙 未 见 明 显 骨 赘 形 成 色 泽 稍 灰 暗 氨 基 葡 萄 糖 组 右 膝 关 节 肿 胀 轻 于 模 型 对 照 组 体 质 量 稍 微 减 轻 关 节 软 骨 表 面 欠 光 泽 部 分 可 见 极 少 量 骨 赘 形 成 见 图 (( 关 节 软 骨 退 变 情 况 空 白 对 照 组 关 节 软 骨 结 构 光 整 细
重庆医学 1%$) 年 ( 月第 05 卷第 1) 期 ')$' 胞数量如常基质染 色 正 常潮 线 完 整) 模 型 对 照 组 软 骨 表 面 @& A! 兔膝关节软骨中 $"* )* & 的 6@[B 相 对 表 达 较粗糙有不规则裂隙形成细胞数量明显减少基质中度或 重 量! 所有扩增曲线均无 非 特 异 性 荧 光融 解 曲 线 呈 单 峰产 物 度失染潮线不完整)金 骨 莲 胶 囊 组 关 节 软 骨 表 面 稍 粗 糙局 特异性好)见 表 1)ZB 模 型 $"* )* &6@[B 相 对 部 见 裂 隙细 胞 数 量 轻 度 减 少基 质 染 色 轻 度 减 退潮 线 欠 完 表达量模 型 对 照 组 ' 种 炎 性 因 子 均 明 显 高 于 空 白 对 照 组差 整)氨基葡萄糖组软 骨 表 结 构 欠 光 整局 部 见 不 规 则 裂 隙细 异均有统计学 意 义 $ %说 明 复 制 ZB 模 型 成 功%金 骨 胞数量减少基质染色轻*中度减退潮线欠完整) 2T*番 红 染 莲胶囊组和氨基葡萄糖组 ' 种 炎 性 因 子 表 达 量 均 明 显 低 于 模 色见图 1)关节软骨 :L,Q, 评 分 数 据 分 析 显 示模 型 对 照 组 型对照组差异 均 有 统 计 学 意 义 $ %说 明 两 种 药 物 均 比 空 白 对 照 组 关 节 软 骨 退 变 严 重差 异 有 统 计 学 意 义 $!$ 有 不 同 程 度 软 骨 保 护 作 用%中 药 金 骨 莲 胶 囊 在 降 低 %%金骨莲胶囊组和氨基葡萄糖组分别与模型对照组 比 较 差异均有统计学差异$ %%金 骨 莲 胶 囊 组 和 氨 基 葡 萄 糖 $"6@[B 方面 作 用 与 氨 基 葡 萄 糖 相 当差 异 无 统 计 学 意 义 $ %)中药金骨莲 胶 囊 在 降 低 ) 和!% &6@[B 方 组比较差异有统计学意义$ %见表 1) 面作用优于氨基葡萄糖差异均有统计学意义$ %) A!模型对照组% 4!氨基葡萄糖组% V!金骨莲胶囊组)!!B!空白对照组% 图 $!! 各组兔膝关节大体标本图 图 1!! 各组关节软骨 2T 染色(]1%%)和番红染色(]1%%) 表 1!! 关节软骨 :L,Q, 评分及 @; $"' )' NbD% 'h$%) & 的 6@[B 的相对表达量( Y?4@ 检测兔 组别 :L,Q, 评分$分& $" ) & 空白对照组 '/%b $/' b b b 模型对照组 $ ')%b $/'L /& 01%b -/5L $ )%%b 11)L $ /%%b 51$L 金骨莲胶囊组 5/%b 0)0LPJ 55%b $)(LP %1%b 1$)LPJ 5/%b 0)0LPJ 氨基葡萄糖组 15%b $0'LP '5%b %'$LP -& 0'%b $$0LP 15%b $0'LP % $5 0%% )-& 1/% /0 -%% $0)&! P! J! %5与空白对照组比较% %5与模型对照组比较% %5与氨基葡萄糖组比较)!!L! A! 讨!! 论 物力学紊乱而 引 起 的 病 理 改 变中 老 年 人 多 发 '$$() 多 项 研 究!! 膝 ZB 是 多 种 生 物 因 素 与 机 械 损 伤 因 素 相 互 作 用 所 致 生 表明成功造模后的膝 ZB 炎症变化包括关节液渗出及滑 膜 增
重 庆 医 学 年 月 第 卷 第 期 生 这 也 许 是 * 患 者 关 节 疼 痛 的 重 要 机 制 之 一 * 模 型 的 建 立 是 本 实 验 成 功 的 前 提 故 采 用 改 良 %' 法 复 制 * 模 型 关 节 软 骨 3 评 分 得 出 模 型 对 照 组 较 空 白 对 照 组 软 骨 退 变 严 重 提 示 造 模 成 功 研 究 证 实 氨 基 葡 萄 糖 在 治 疗 膝 * 中 效 果 肯 定 在 本 实 验 中 作 为 阳 性 药 物 对 照 从 大 体 标 本 角 度 出 发 得 知 金 骨 莲 胶 囊 组 和 氨 基 葡 萄 糖 组 均 比 模 型 对 照 组 的 关 节 软 骨 表 面 光 整 并 没 有 明 显 骨 赘 形 成 中 药 金 骨 莲 胶 囊 组 和 氨 基 葡 萄 糖 组 肉 眼 观 没 有 明 显 差 别 从 病 理 组 织 学 角 度 得 知 金 骨 莲 胶 囊 组 和 氨 基 葡 萄 糖 组 均 比 模 型 对 照 组 的 关 节 软 骨 结 构 规 则 细 胞 数 量 多 基 质 轻 度 失 染 潮 线 完 整 说 明 两 种 药 物 均 有 不 同 程 度 软 骨 保 护 作 用 金 骨 莲 胶 囊 组 和 氨 基 葡 萄 糖 组 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 说 明 在 病 理 组 织 学 水 平 上 金 骨 莲 胶 囊 疗 效 优 于 氨 基 葡 萄 糖 +& 在 * 病 程 中 均 是 典 型 的 致 炎 细 胞 因 子 可 通 过 一 系 列 级 联 反 应 引 起 关 节 软 骨 的 破 坏 和 炎 症 反 应 在 膝 * 中 呈 高 表 达 并 与 病 情 呈 正 相 关 +& 可 调 节 蛋 白 水 解 酶 的 合 成 与 分 泌 促 进 软 骨 细 胞 和 滑 膜 细 胞 分 泌 基 质 金 属 蛋 白 酶 并 加 速 胶 原 蛋 白 及 聚 蛋 白 多 糖 的 降 解 近 期 研 究 表 明 金 骨 莲 胶 囊 能 够 降 低 类 风 湿 性 关 节 炎 大 鼠 血 清 中 的 +& 因 此 推 测 金 骨 莲 胶 囊 抑 制 炎 症 因 子 +& 是 治 疗 类 风 湿 关 节 炎 的 机 制 之 一 本 实 验 发 现 金 骨 莲 胶 囊 和 氨 基 葡 萄 糖 均 可 不 同 程 度 的 下 调 膝 * 中 +& 炎 症 因 子 但 是 金 骨 莲 胶 囊 在 降 低 +&$(* 方 面 作 用 与 氨 基 葡 萄 糖 相 当 差 异 无 统 计 学 意 义 而 在 降 低 $(* 方 面 作 用 优 于 氨 基 葡 萄 糖 差 异 有 统 计 学 意 义 +& 在 * 中 的 作 用 仍 存 在 很 大 争 议 有 研 究 认 为 在 * 中 晚 期 的 关 节 软 骨 中 有 过 量 的 +& 表 达 进 而 刺 激 更 多 的 基 质 金 属 蛋 白 酶 表 达 大 量 软 骨 基 质 被 降 解 软 骨 进 一 步 加 重 最 新 研 究 表 明 +& 可 能 是 和 +& 作 用 于 其 他 细 胞 重 要 的 中 介 物 质 和 +& 通 过 +& 的 产 生 将 * 的 疾 病 进 程 放 大 与 延 续 三 者 的 协 同 作 用 可 加 速 * 的 进 展 +& 在 * 软 骨 下 骨 成 骨 细 胞 中 表 达 较 高 并 与 * 软 骨 破 坏 紧 密 相 关 有 研 究 表 明 +& 也 可 以 刺 激 产 生 金 属 蛋 白 酶 组 织 抑 制 剂 + 从 而 负 反 馈 抑 制 因 此 可 认 为 +& 在 * 中 影 响 是 双 向 的 从 分 子 水 平 得 知 中 药 金 骨 莲 胶 囊 和 氨 基 葡 萄 糖 均 可 不 同 程 度 的 下 调 膝 * 中 +& 炎 症 因 子 但 是 中 药 金 骨 莲 胶 囊 作 用 优 于 氨 基 葡 萄 糖 差 异 有 统 计 学 意 义 综 上 所 述 中 药 金 骨 莲 胶 囊 和 氨 基 葡 萄 糖 均 可 不 同 程 度 的 下 调 膝 * 中 +& +& 炎 症 因 子 而 中 药 金 骨 莲 胶 囊 在 降 低 +& 和 $(* 方 面 作 用 优 于 氨 基 葡 萄 糖 从 而 达 到 中 药 金 骨 莲 胶 囊 抑 制 软 骨 基 质 破 坏 和 延 缓 关 节 软 骨 退 变 的 目 的 对 关 节 软 骨 起 保 护 作 用 参 考 文 献 5E8*( *8-%10-'- %/',-/0%-,-% -'-,%,,%-A* ('-$ 8 -,*5--,(%-"7-%'-,-%0-, 2$-'%,--$/,-- -,-/--,','- 6 A* ('-$ 8 肖 晓 金 包 侠 萍 陈 文 列 等 透 骨 消 痛 胶 囊 对 兔 膝 骨 关 节 炎 模 型 血 清 与 关 节 液 炎 症 因 子 的 影 响 A 风 湿 病 与 关 节 炎 汪 洪 吴 昊 关 节 注 射 联 合 金 骨 莲 胶 囊 治 疗 骶 髂 关 节 炎 疗 效 观 察 A 中 国 中 医 骨 伤 科 杂 志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