中 国 农 学 通 报 2014,30(6):101-107 Chinese Agricultural Science Bulletin 转 基 因 抗 虫 玉 米 的 定 量 检 测 孙 红 炜, 李 凡, 杨 淑 珂, 张 广 远, 路 兴 波 ( 山 东 省 农 业 科 学 院 植 物 保 护 研 究 所 / 山 东 省 植 物 病 毒 学 重 点 实 验 室, 济 南 250100) 摘 要 : 建 立 高 效 快 速 准 确 的 抗 虫 转 基 因 玉 米 MIR162 转 化 体 特 异 性 实 时 荧 光 PCR(real-time PCR) 检 测 方 法 采 用 SYBR Green I 和 Taqman 探 针 2 种 定 量 方 法 对 抗 虫 转 基 因 玉 米 MIR162 进 行 了 检 测 研 究 SYBR Green I 法 MIR162 转 化 体 特 异 性 片 段 和 内 标 基 因 zssiib 的 熔 解 曲 线 均 表 现 为 单 一 峰, 扩 增 特 异 性 强 ; 二 者 的 扩 增 效 率 均 在 90%~100% 之 间, 标 准 曲 线 相 关 系 数 R 2 均 大 于 0.998 2 种 定 量 方 法 的 检 测 限 (LOD) 均 为 24 个 拷 贝, 定 量 限 (LOQ) 为 48 个 拷 贝, 灵 敏 度 较 高 重 复 测 试 结 果 表 明,SYBR Green I 法 的 标 准 偏 差 () 变 化 范 围 为 0.05~0.13, 相 对 标 准 偏 差 (R) 范 围 为 0.17%~0.40%,Taqman 探 针 法 的 变 化 范 围 为 0.03~0.14,R 范 围 为 0.11%~0.44%, 说 明 2 种 定 量 检 测 方 法 具 有 良 好 的 重 复 性 和 精 密 度 对 MIR162 含 量 为 3% 1% 和 0.5% 的 混 合 样 品 的 定 量 结 果 为 :3.13% 1.09% 0.53%(SYBR Green I 法 ) 和 3.07% 1.02% 0.50%(Taqman 探 针 法 ),R 均 小 于 10%,T 检 验 分 析 表 明 2 种 定 量 方 法 定 值 结 果 差 异 不 显 著 本 研 究 建 立 的 2 种 实 时 荧 光 定 量 PCR 均 可 有 效 对 转 基 因 玉 米 MIR162 进 行 定 量 检 测, 可 根 据 不 同 实 际 需 求 及 实 验 室 条 件 进 行 选 择 相 应 的 检 测 方 法 关 键 词 : 转 基 因 抗 虫 玉 米 ;SYBR Green I;Taqman;real-time PCR 中 图 分 类 号 :S513 文 献 标 志 码 :A 论 文 编 号 :2013-1193 Quantitative Detection of Pest-resistant Genetically Modified Maize Sun Hongwei, Li Fan, Yang Shuke, Zhang Guangyuan, Lu Xingbo (Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory of Plant Virology, Jinan 250100) Abstract: The aim was to build efficient, rapid and accurate event-specific quantitative real-time PCR detection methods of insect-resistant genetically modified maize MIR162. SYBR Green I and TaqMan Probe quantitative PCR methods were established in this study. The melting curves of MIR162 event-specific and endogenous reference gene zssiib were both single peak which mean the primers were specific. The recovery rates of SYBR Green I and TaqMan were between 90%-100% and their R 2 values were both above 0.998. The limits of detection (LOD) and limits of quantitation (LOQ) of these two methods were 24 and 48 copies, respectively, which suggested that the two quantitative systems had an acceptable and high sensitivity. Moreover, the standard deviations () and relative standard deviations (R) of repeatability ranged from 0.05 to 0.13 and 0.17% to 0.40% for SYBR Green I; 0.03 to 0.14 and 0.11% to 0.44% for TaqMan. Thereafter, three mixed maize samples (3%, 1%, 0.5%) were quantified to be 3.13%, 1.09%, 0.53% (SYBR Green I) and 3.07%, 1.02%, 0.50% (Taqman) respectively. T-test showed the quantification results of these two methods were not significantly different. The two event-specific quantitative PCR systems established in the studies were 基 金 项 目 : 转 基 因 生 物 新 品 种 培 育 重 大 专 项 农 业 生 态 风 险 监 测 与 控 制 技 术 (2013ZX08012-004) 第 一 作 者 简 介 : 孙 红 炜, 女,1973 年 出 生, 山 东 海 阳 人, 副 研 究 员, 硕 士, 主 要 从 事 转 基 因 植 物 检 测 及 环 境 安 全 性 评 价 研 究 通 信 地 址 :250100 济 南 市 历 城 区 工 业 北 路 202 号 山 东 省 农 业 科 学 院 植 物 保 护 研 究 所,Tel:0531-83179095,E-mail:hongweisun@126.com 通 讯 作 者 : 路 兴 波, 男,1970 年 出 生, 山 东 新 泰 人, 研 究 员, 博 士, 主 要 从 事 转 基 因 植 物 检 测 及 环 境 安 全 性 评 价 研 究 通 信 地 址 :250100 济 南 市 历 城 区 工 业 北 路 202 号 山 东 省 农 业 科 学 院 植 物 保 护 研 究 所,Tel:0531-83179644,E-mail:luxb99@sina.com 收 稿 日 期 :2013-04-24, 修 回 日 期 :2013-06-25
102 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn acceptable and suitable for MIR162 identification and quantification, and the users might select corresponding method based on actual demand and laboratory conditions. Key words: pest-resistant genetically modified maize; SYBR Green I; Taqman; real-time PCR 0 引 言 截 至 2012 年, 全 球 转 基 因 作 物 种 植 面 积 达 到 1.7 亿 hm 2 [1], 其 中 转 基 因 玉 米 种 植 面 积 居 前 列 作 为 中 国 最 重 要 的 粮 食 及 饲 料 作 物 之 一, 国 内 转 基 因 玉 米 研 发 工 作 进 展 也 较 为 迅 速, 目 前 有 多 个 转 基 因 玉 米 优 良 品 系 进 入 环 境 释 放 阶 段, 申 请 商 业 化 种 植, 其 中 转 植 酸 酶 玉 米 已 经 获 得 安 全 评 价 证 书 在 转 基 因 作 物 迅 猛 发 展 的 同 时, 也 伴 随 着 人 们 对 其 环 境 安 全 和 食 用 安 全 的 关 注 和 质 疑 因 此, 研 究 和 制 定 转 基 因 作 物 及 其 产 品 成 分 检 测 标 准, 对 于 加 强 转 基 因 作 物 安 全 管 理, 防 止 转 基 因 作 物 未 经 安 全 批 准 进 入 生 产 流 通 环 节 ; 保 障 转 基 因 生 物 安 全 和 人 类 健 康, 保 护 消 费 者 利 益 ; 消 除 公 众 对 转 基 因 作 物 安 全 性 的 疑 虑, 营 造 良 好 的 转 基 因 作 物 产 业 化 氛 围 具 有 重 要 意 义 转 基 因 抗 虫 玉 米 MIR162 是 由 先 正 达 公 司 育 成 的 具 有 抗 秋 粘 虫 甘 蔗 食 心 虫 玉 米 穗 蛾 及 其 他 鳞 翅 目 害 虫 的 转 基 因 玉 米, 目 前 该 品 系 已 在 美 国 加 拿 大 巴 西 和 阿 根 廷 获 得 商 业 化 种 植 批 准, 越 南 也 于 近 期 批 准 了 该 转 基 因 品 种 的 田 间 试 验 申 请 随 着 中 国 肉 类 消 耗 量 的 增 多, 玉 米 作 为 饲 料 的 需 求 激 增, 越 来 越 多 地 从 国 外 进 口 玉 米 及 以 玉 米 为 原 料 的 饲 料 如 2012 年 1 10 月 份, 国 内 玉 米 进 口 量 达 455.6 万 t, 比 2011 年 同 期 增 加 361.8 万 t, 增 幅 385.7%, 而 进 口 玉 米 大 部 分 来 自 美 国, 这 些 进 口 玉 米 中 不 可 避 免 会 含 有 转 基 因 玉 米 根 据 中 国 农 业 转 基 因 生 物 安 全 管 理 条 例 及 农 业 转 基 因 生 物 标 识 管 理 办 法 规 定, 转 基 因 产 品 必 须 进 行 必 要 的 标 识 管 理 本 研 究 对 该 抗 虫 玉 米 定 量 检 测 方 法 进 行 了 研 究, 旨 在 建 立 高 效 准 确 方 便 低 成 本 的 转 基 因 玉 米 MIR162 定 量 检 测 技 术, 为 转 基 因 玉 米 MIR162 的 监 管 提 供 重 要 的 技 术 保 障 1 材 料 与 方 法 1.1 试 验 材 料 及 DNA 提 取 转 基 因 玉 米 品 系 为 MIR162 用 DNA 提 取 试 剂 盒 (Omega) 提 取 基 因 组 DNA, 紫 外 分 光 光 度 计 (Nanovueplus) 对 DNA 的 纯 度 和 浓 度 进 行 分 析 1.2 转 化 体 特 异 性 引 物 和 探 针 玉 米 内 标 基 因 zssiib 定 量 PCR 引 物 及 探 针 参 照 [2] 李 想 等 研 究 根 据 MIR162 玉 米 旁 侧 序 列, 采 用 Primer Express2.0 软 件 设 计 MIR162 转 化 体 特 异 性 引 物 和 探 针 引 物 及 探 针 序 列 见 表 1 表 1 引 物 及 探 针 序 列 引 物 名 称 zssiib MIR162 引 物 及 探 针 序 列 (5'-3') F:CGGTGGATGCTAAGGCTGATG R:AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC P:FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-Eclipse F:CTGTCTAATAGTTTGAGTGA R:GTGACTCCCTTAATTCTC P:FAM-CAGATTGTCGTTTCCCGCCTTC-Eclipse 扩 增 大 小 /bp 88 94 1.3 实 时 荧 光 PCR 扩 增 SYBR Green I 法 : 采 用 罗 氏 SYBR Green I 定 量 PCR 试 剂 盒, 反 应 体 系 :2 FastStart Universal SYBR Green Master(Rox) 10 μl, 上 游 引 物 (10 μmol/l) 0.4 μl, 下 游 引 物 (10 μmol/l) 0.4 μl,dna 模 板 1 μl, 加 水 补 至 20 μl 反 应 条 件 :95 10 min,95 15 s,60 60 s( 采 集 荧 光 信 号 ), 共 40 个 循 环 将 SYBR Green I 的 扩 增 产 物 从 60 缓 慢 而 均 匀 地 以 0.3 /s 的 速 率 升 温 到 95, 记 录 荧 光 信 号 的 变 化, 绘 制 出 扩 增 产 物 的 溶 解 曲 线 Taqman 探 针 法 : 采 用 罗 氏 Taqman 探 针 定 量 PCR 反 应 试 剂 盒 反 应 体 系 :2 FastStart Universal Probe Master(Rox) 12.5 μl, 上 下 游 引 物 (10 μmol/l) 各 1 μl, 探 针 (10 μmol/l) 0.5 μl, 模 板 DNA 1 μl, 加 水 补 足 至 20 μl 反 应 程 序 :95 10 min;95 15 s,60 1 min( 收 集 荧 光 信 号 ),40 个 循 环 1.4 标 准 曲 线 的 制 作 将 样 品 DNA 用 Easy Dilution 缓 冲 液 (TaKaRa) 依 次 稀 释 至 3 10 4 6 10 3 1.2 10 3 2.4 10 2 48 9.6 copies/μl, 分 别 进 行 zssiib 及 MIR162 转 化 体 特 异 性 实 时 荧 光 PCR 扩 增, 每 个 梯 度 设 置 3 个 平 行 重 复, 绘 制 标 准 曲 线
孙 红 炜 等 : 转 基 因 抗 虫 玉 米 的 定 量 检 测 103 1.5 转 基 因 玉 米 MIR162 混 合 样 品 定 量 检 测 玉 米 内 标 准 基 因 zssiib 只 有 一 个 拷 贝, 而 MIR162 转 基 因 玉 米 只 有 一 个 单 拷 贝 插 入 位 点, 根 据 3 次 定 量 实 验 Ct 平 均 值 和 标 准 曲 线 得 出 样 品 中 内 标 准 基 因 zssiib 和 MIR162 转 化 体 特 异 性 序 列 的 DNA 拷 贝 数, 按 照 下 面 公 式 计 算 样 品 转 基 因 含 量 [9] : 转 基 因 含 量 = 2 结 果 与 分 析 转 化 体 特 异 性 序 列 DNA 拷 贝 数 内 标 基 因 拷 贝 数 2.1 SYBR Green I 法 溶 解 曲 线 分 析 100% 由 于 SYBR Green I 实 时 荧 光 定 量 PCR 扩 增 时 染 料 对 双 链 DNA 的 识 别 不 具 备 特 异 性, 因 此 必 须 要 通 过 溶 解 曲 线 来 分 析 反 应 的 特 异 性 对 MIR162 转 化 体 zssiib 扩 增 产 物 溶 解 曲 线 分 析 表 明, MIR162 转 化 体 特 异 性 产 物 Tm 平 均 值 为 73.97 ( 标 准 偏 差 () 为 0.2 ),zssiib 扩 增 产 物 Tm 平 均 值 为 80.68 ( 为 0.3 ), 二 者 扩 增 产 物 溶 解 曲 线 均 呈 单 一 峰 型, 空 白 对 照 呈 平 坦 直 线, 由 此 判 断 MIR162 转 化 体 zssiib 在 SYBR Green I 定 量 PCR 反 应 过 程 中, 无 非 特 异 性 扩 增 和 引 物 二 聚 体 出 现, 所 得 Ct 值 可 信 度 较 高 2.2 标 准 曲 线 建 立 能 否 建 立 准 确 可 靠 的 标 准 曲 线 是 决 定 定 量 检 测 是 否 科 学 准 确 的 主 要 依 据 一 般 来 说, 标 准 曲 线 的 斜 率 在 -3.1~-3.6 之 间, 相 关 性 系 数 R 2 在 0.99 以 上, 扩 增 效 率 在 90%~110% 之 间 表 明 标 准 曲 线 质 量 较 好, 定 量 结 果 可 靠 SYBR Green I 方 法 得 到 的 MIR162 转 化 体 特 异 性 扩 增 曲 线 和 标 准 曲 线 见 图 2, 扩 增 效 率 为 93.779%, 转 化 体 特 异 性 片 段 扩 增 Ct 值 与 起 始 模 板 量 线 性 方 程 为 : Y=-3.437X+39.531, 线 性 相 关 系 数 R 2 =0.998;Taqman 探 针 法 得 到 的 MIR162 转 化 体 特 异 性 扩 增 曲 线 和 标 准 曲 线 见 图 3, 反 应 扩 增 效 率 为 96.905%, 转 化 体 特 异 性 扩 增 Ct 值 与 起 始 模 板 量 线 性 方 程 为 :Y=-3.398X + 42.932, 线 性 相 关 系 数 R 2 =0.999 SYBR Green I 方 法 建 立 的 zssiib 扩 增 曲 线 和 标 准 曲 线 见 图 4,zSSIIb 基 因 Ct 值 与 起 始 模 板 量 线 性 方 程 为 :Y=-3.435X+39.334, 线 性 相 关 系 数 R 2 =0.999, 扩 增 效 率 为 95.485%;Taqman 探 针 法 zssiib 扩 增 曲 线 和 标 准 曲 线 见 图 5,zSSIIb 基 因 Ct 值 与 起 始 模 板 量 线 性 方 程 为 :Y=-3.481X+44.568, 线 性 相 关 系 数 R 2 =0.998, 扩 增 效 率 为 95.408% 以 上 数 据 表 明, 这 2 种 定 量 方 法 所 建 立 的 标 准 曲 图 1 MIR162 转 化 体 (A) 及 zssiib(b) 溶 解 曲 线 图 2 SYBR Green I 法 MIR162 转 化 体 特 异 性 扩 增 曲 线 (A) 和 标 准 曲 线 (B)
104 中国农学通报 http://www.casb.org.cn Ｃｙｃｌ ｅ Ｑｕａｎｔ ｉ ｔ ｙ Ａ Ｂ 图 3 Taqman 探针法 MIR162 转化体特异性扩增曲线(A)和标准曲线(B) Ｃｙ ｃ ｌ ｅ Ｑｕａ ｎｔ ｉ ｔ ｙ Ａ Ｂ 图 4 SYBR Green I 法 zssiib 基因扩增曲线(A)和标准曲线(B) Ｃｙ ｃ ｌ ｅ Ｑｕａ ｎｔ ｉ ｔ ｙ Ａ Ｂ 图 5 Taqman 探针法 zssiib 基因扩增曲线(A)和标准曲线(B) 线相关性高 扩增效率适宜 因此采用这 2 种方法对 个和 6 个阳性信号 无法检出全部样品 而在 24 个拷贝 MIR162 进行定量检测具备良好的基础 及以上时所有重复均能检测到阳性信号 说明 2 种定 2.3 检测灵敏度分析 量方法能够稳定检测到 24 个拷贝的模板 DNA 因此 检测限(LOD)和定量限(LOQ)是衡量检测方法灵 确定 2 种定量方法的 LOD 为 24 个拷贝 由于 24 个拷 敏度的重要指标 为确定 SYBR Green I 和 Taqman 2 贝 时 定 量 检 测 Ct 值 的 标 准 偏 差 () 较 大 0.26 和 种方法的 LOD 和 LOQ 将 MIR162 基因组 DNA 依次 0.31 为确保定量结果具有更高的准确度 2 种方法的 稀释至 240 48 24 9.6 copies/μl 以此为模板分别由 3 定量限(LOQ)均认定为 48 个拷贝 总体来看 2 种方 位实验人员分别进行 2 种实时荧光 PCR 扩增 每次设 法检测灵敏度基本一致 置 3 个平行重复 由表 2 可看出 基因组 DNA 为 9.6 个 2.4 定量检测数据稳定性及精密度分析 拷贝时 SYBR Green I 和 Taqman 2 种方法分别检出 5 和相对标准偏差(R)是衡量定量结果是否稳
孙 红 炜 等 : 转 基 因 抗 虫 玉 米 的 定 量 检 测 105 表 2 2 种 定 量 检 测 方 法 灵 敏 度 分 析 拷 贝 数 SYBR Green I 法 阳 性 信 号 数 Taqman 探 针 法 阳 性 信 号 数 240 48 0.11 0.11 24 0.26 0.31 9.6 5/9 a 6/9 注 : a :5/9 表 示 在 9 次 重 复 中 有 5 次 为 阳 性 信 号 定 精 确 的 重 要 指 标 根 据 3 次 定 量 实 验 得 到 的 Ct 值 计 算 2 种 方 法 的 和 R, 结 果 如 表 3 所 示,SYBR Green I 法 的 变 化 范 围 为 0.05~0.13,Taqman 探 针 法 的 变 化 范 围 为 0.03~0.14, 数 值 均 较 小, 说 明 这 2 种 定 量 检 测 方 法 能 够 重 复 获 得 稳 定 的 检 测 数 据 ; SYBR Green I 法 R 的 范 围 为 0.17%~0.40%;Taqman 探 针 法 R 的 范 围 为 0.11%~0.44%, 说 明 这 2 种 定 量 检 测 方 法 精 密 度 较 高, 结 果 准 确 可 靠 2.5 样 品 实 测 结 果 采 用 建 立 的 方 法 对 已 知 浓 度 的 混 合 样 品 进 行 测 定, 按 1.5 公 式 计 算 转 基 因 百 分 含 量, 结 果 显 示 : MIR162 含 量 分 别 为 3% 1% 0.5% 的 3 个 混 合 样 品 用 SYBR Green I 法 的 测 定 结 果 分 别 为 3.13% 1.09% 和 0.53%, 相 对 误 差 分 别 为 4.33% 9% 6%, 其 R 分 别 为 4.51% 2.65% 和 2.08%; 而 Taqman 探 针 法 的 检 测 结 果 分 别 为 3.07% 1.02% 和 0.50%, 相 对 误 差 分 别 为 2.33% 2% 0%,R 为 8.74% 9.07% 和 6.08% 比 较 来 看, 在 进 行 混 合 样 品 检 测 时,SYBR Green I 法 检 测 相 对 误 差 大 于 Taqman 探 针 法, 但 检 测 相 对 标 准 偏 差 小 于 Taqman 探 针 法,2 种 检 测 方 法 R 均 小 于 10%, 符 [9] 合 欧 盟 转 基 因 检 测 方 法 的 要 求, 将 2 组 定 量 结 果 进 行 T 检 验 分 析, 结 果 发 现 3 个 样 品 的 定 量 值 在 95% 的 置 信 区 间 无 显 著 差 异 ( 表 4) 这 些 结 果 表 明, 本 研 究 建 立 的 2 种 方 法 都 可 作 为 转 基 因 玉 米 MIR162 定 量 检 测 的 科 学 有 效 手 段, 可 以 根 据 不 同 检 测 要 求 及 实 验 室 条 件 选 择 相 应 的 方 法 表 3 2 种 定 量 方 法 检 测 数 据 稳 定 性 及 精 密 度 比 较 模 板 拷 贝 数 Ct 平 均 值 SYBR Green I R/% Ct 平 均 值 Taqman R/% 30000 25.57 0.09 0.35 25.74 0.03 6000 27.51 0.10 0.36 27.06 0.03 0.11 1200 29.91 0.05 0.17 29.45 0.08 0.27 240 32.54 0.13 0.40 32.16 0.14 0.44 48 35.11 0.34 34.65 0.09 0.26 表 4 SYBR Green I 法 和 Taqman 探 针 法 测 定 转 基 因 样 品 的 转 基 因 成 分 含 量 MIR162 理 论 含 量 /% MIR162 实 测 含 量 /% 相 对 误 差 /% R/% P 3 3.13 a,3.07 b 4.33 a,2.33 b 4.51 a,8.74 b 0.305 1 1.09,1.02 9,2 2.65,9.07 0.250 0.5 0.53,0.50 6,0 2.08,6.08 0.420 注 : a :SYBR Green I 法 定 量 结 果 ; b :Taqman 探 针 法 定 量 结 果 结 果 进 行 T 检 验,α=0.05 3 结 论 与 讨 论 转 基 因 作 物 的 检 测 方 法 主 要 有 核 酸 检 测 法 和 蛋 白 质 检 测 法 由 于 蛋 白 质 检 测 方 法 繁 琐 复 杂, 检 测 灵 敏 度 低, 因 此 日 常 检 测 工 作 中 主 要 应 用 核 酸 检 测 法 核 酸 检 测 方 法 有 多 种 形 式, 如 多 重 复 合 PCR [3-4] 多 重 巢 式 PCR [5] real-time PCR [6-10] [11] 基 因 芯 片 环 介 导 等 温 扩 增 技 术 (LAMP) [12] 等 其 中, 尤 以 定 性 PCR 检 测 和 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 应 用 最 为 广 泛 定 性 PCR 方 法 简 单 方 便 仪 器 及 试 剂 成 本 低, 但 是 存 在 重 复 性 差, 假 阳 性 高 EB 污 染 严 重 等 问 题, 尤 其 在 进 行 复 杂 样 品 ( 如 混
106 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn 合 样 品 ) 检 测 时, 定 性 PCR 方 法 更 容 易 因 为 模 板 成 分 复 杂 等 原 因 产 生 互 相 干 扰 等 问 题 而 影 响 检 测 结 果 的 判 断 而 定 量 PCR 方 法 以 其 快 速 准 确 灵 敏 自 动 化 程 度 高 重 现 性 好 污 染 少 等 优 势 在 实 际 检 测 工 作 中 得 到 越 来 越 广 泛 的 应 用 [6-10] 目 前 Taqman 探 针 实 时 荧 光 PCR 是 国 际 标 准 中 普 遍 使 用 的 定 量 方 法 [13-14], 国 内 标 准 中 部 分 涉 及 到 定 量 PCR 检 测 方 法, 并 且 大 部 分 采 用 Taqman 探 针 法, 但 仅 限 于 转 基 因 玉 米 及 大 豆 等 少 数 品 种, 而 且, 大 部 分 标 准 中 虽 然 使 用 了 Taqman 探 针 法, 但 只 是 用 定 量 方 法 进 行 定 性 判 断, 并 未 对 产 品 进 行 定 量 [15-16] Permingeat [17] 对 4 种 欧 盟 认 可 的 转 基 因 玉 米 及 食 品 中 转 基 因 玉 米 的 成 分 进 行 了 实 时 定 量 PCR 检 测, 其 检 测 低 限 可 达 0.1%, 约 36 个 拷 贝, 对 不 同 转 基 因 玉 米 品 种 检 测 的 标 准 偏 差 为 5%~20% 而 本 实 验 中 采 用 的 2 种 定 量 方 法 的 检 测 限 均 为 24 个 拷 贝, 定 量 限 为 48 个 拷 贝, 相 对 标 准 偏 差 均 小 于 1%, 灵 敏 度 高 于 Permingeat 的 研 究 结 果, 相 对 标 准 偏 差 小 于 Permingeat [18] 的 研 究 结 果, 说 明 该 方 法 精 密 度 非 常 高 ; 宋 君 等 根 据 转 基 因 玉 米 NK603 外 源 基 因 的 旁 侧 序 列 设 计 引 物 和 Taqman 探 针, 建 立 转 基 因 玉 米 NK603 品 系 特 异 定 量 PCR 检 测 方 法, 曲 线 斜 率 为 -3.6~-3.1, 相 关 系 数 大 于 0.99, 扩 增 效 率 为 100.2%, 在 90%~110% 范 围 内 ; 采 用 该 法 检 测 2% 含 量 的 NK603 标 准 品, 检 测 结 果 (1.9%), [19] 不 确 定 度 为 10% Hird 等 利 用 RQ-PCR 对 若 干 植 物 及 其 加 工 产 品 的 转 基 因 成 分 进 行 了 检 测, 检 测 结 果 显 示 RQ-PCR 的 转 基 因 大 豆 检 测 结 果 与 标 准 含 量 的 误 差 仅 为 1.0%, 在 3 种 不 同 玉 米 标 准 品 中 误 差 仅 为 :2.0% 10.0% 7.0% 本 研 究 中,Taqman 探 针 法 各 项 技 术 指 标 如 曲 线 斜 率 相 关 系 数 扩 增 效 率 均 满 足 定 量 PCR 检 测 的 要 求, 采 用 这 2 种 方 法 对 已 知 含 量 样 品 进 行 检 测, [18] [19] 相 对 标 准 偏 差 均 小 于 10%, 与 宋 君 等 Hird 等 的 研 究 结 果 一 致, 说 明 采 用 本 研 究 中 建 立 的 Taqman 探 针 方 法 对 转 基 因 玉 米 MIR162 进 行 检 测 科 学 准 确 尽 管 本 研 究 中 建 立 的 MIR162 Taqman 检 测 技 术 特 异 性 强 灵 敏 度 高, 但 Taqman 探 针 法 也 有 不 足 之 处 即 通 用 性 不 好, 必 须 特 定 引 物 与 特 定 探 针 配 合 使 用, 且 探 针 合 成 成 本 较 高 与 Taqman 探 针 法 相 比, 染 料 法 无 需 合 成 探 针, 因 此 比 较 简 单 经 济 但 SYBR Green I 染 料 法 不 具 有 特 异 性, 染 料 与 所 有 双 链 DNA 均 结 合, 因 此 引 物 二 聚 体 非 特 异 扩 增 等 均 会 影 响 结 果, 因 此 需 要 在 PCR 反 应 结 束 后, 通 过 逐 渐 升 温 同 时 监 测 每 一 步 的 R n 值 绘 制 溶 解 曲 线 来 判 断 扩 增 反 应 的 特 异 性 本 研 究 中 MIR162 转 化 体 片 段 和 zssiib 基 因 的 溶 解 曲 线 均 为 单 一 峰 型, 空 白 对 照 为 一 条 平 坦 直 线, 说 明 反 应 过 程 无 非 特 异 性 扩 增 产 物 和 引 物 二 聚 体 出 现, 表 明 本 引 物 特 异 性 好, 而 且, 该 法 标 准 曲 线 相 关 系 数 R 2 均 大 于 0.998, 相 关 性 非 常 强 因 此, 利 用 本 研 究 中 的 转 化 体 特 异 性 引 物, 采 用 SYBR Green I 法 对 转 基 因 抗 虫 玉 米 进 行 定 量 是 可 行 的 从 2 种 方 法 对 比 来 看, 各 项 检 测 指 标 如 反 应 灵 敏 度 相 关 系 数 扩 增 效 率,LOD LOQ, R 差 异 不 显 著 应 用 本 研 究 建 立 的 2 种 定 量 PCR 对 转 基 因 玉 米 MIR162 含 量 分 别 为 3% 1% 和 0.5% 的 混 合 玉 米 样 品 进 行 定 量 检 测, 测 得 结 果 与 实 际 值 接 近, 相 对 误 差 均 小 于 10%, 且 2 种 定 量 方 法 在 统 计 学 上 没 有 显 著 差 异, 表 明 染 料 法 和 探 针 法 荧 光 定 量 PCR 均 能 够 较 为 准 确 地 对 含 有 MIR162 成 分 的 转 基 因 玉 米 混 合 样 品 进 行 定 量 本 研 究 建 立 的 检 测 方 法 能 够 为 中 国 有 效 监 测 及 监 管 转 基 因 玉 米 MIR162 提 供 科 学 的 技 术 手 段, 检 测 人 员 可 以 根 据 实 际 情 况 灵 活 选 用 2 种 检 测 方 法 本 研 究 中 采 用 的 实 时 荧 光 定 量 PCR 具 有 重 复 性 好 灵 敏 度 高 核 酸 交 叉 污 染 少 等 优 点, 克 服 了 传 统 定 量 只 能 终 点 检 测 的 局 限, 但 也 存 在 着 很 多 不 足, 比 如, 在 标 准 曲 线 定 量 中, 标 准 品 必 不 可 少, 但 目 前 成 熟 稳 定 商 品 化 的 标 准 品 极 少, 各 实 验 室 所 用 生 成 标 准 曲 线 的 样 品 各 不 相 同, 因 此 实 验 结 果 缺 乏 可 比 性 ; 另 外, 仪 器 昂 贵 探 针 制 备 成 本 高, 无 法 进 行 多 样 品 同 时 检 测 等 也 是 定 量 PCR 检 测 面 临 的 问 题 因 此, 如 何 进 一 步 提 高 检 测 的 灵 敏 度, 降 低 检 测 成 本, 加 强 转 基 因 检 测 标 准 物 质 的 研 制, 提 高 定 量 PCR 的 可 比 性, 是 今 后 研 究 的 主 要 方 向 参 考 文 献 [1] Clive J. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops[R]. ISAAA,2012. [2] Li X, Yang L T, Zhang J, et al. Simplex and duplex polymerase chain reaction analysis of Herculex RW (59122) maize based on one reference molecule including separated fragments of 5' integration site and endogenous gene [J]. J AOAC Int,2009,92(5): 1472-83. [3] James D, Schmidt A M, Wall E, et al. Reliable detection and identification of genetically modified maize, soybean, and canola by multiplex PCR analysis[j]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51(20):5829-5834. [4] 金 芜 军, 郝 旸, 程 红 梅, 等. 用 复 合 PCR 方 法 检 测 6 种 转 基 因 玉 米 中 外 源 DNA 的 特 异 性 [J]. 农 业 生 物 技 术 学 报,2005,13(5):562-567. [5] Lam W Y, Yeung A C M, Tang J W, et al. Rapid multiplex nested PCR for detection of respiratory viruses[j].journal of Clinical Microbiology,2007,45(11):3631-3640.
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