入门指南 绝对定量实验 简介和绝对定量 示例实验 美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量 PCR 仪 设计 绝对定量实验 Primer Extended on mrna 5 3 Reverse Primer 5 cdna Oligo d(t) or random hexamer 执行反转录 Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 运行绝对定量 反应板 分析绝对定量 数据
Copyright 2004, Applied Biosystems. All rights reserved. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Authorized Thermal Cycler This instrument, Serial No, is an Authorized Thermal Cycler. Its purchase price includes the up-front fee component of a license under United States Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,965,188, owned by Roche Molecular Systems, Inc., and under corresponding claims in patents outside the United States, owned by F. Hoffmann- La Roche Ltd, covering the Polymerase Chain Reaction ("PCR") process to practice the PCR process for internal research and development using this instrument. The running royalty component of that license may be purchased from Applied Biosystems or obtained by purchasing Authorized Reagents. This instrument is also an Authorized Thermal Cycler for use with applications licenses available from Applied Biosystems. Its use with Authorized Reagents also provides a limited PCR license in accordance with the label rights accompanying such reagents. Purchase of this product does not itself convey to the purchaser a complete license or right to perform the PCR process. Further information on purchasing licenses to practice the PCR process may be obtained by contacting the Director of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404. DISCLAIMER OF LICENSE: No rights for any application, including any in vitro diagnostic application, are conveyed expressly, by implication or by estoppel under any patent or patent applications claiming homogeneous or real-time detection methods, including patents covering such methods used in conjunction with the PCR process or other amplification processes. The 5' nuclease detection assay and certain other homogeneous or real-time amplification and detection methods are covered by United States Patent Nos. 5,210,015, 5,487,972, 5,804,375 and 5,994,056, owned by Roche Molecular Systems, Inc.; by corresponding patents and patent applications outside the United States, owned by F. Hoffmann-La Roche Ltd; and by United States Patent Nos. 5,538,848 and 6,030,787, and corresponding patents and patent applications outside the United States, owned by Applera Corporation. Purchase of this instrument conveys no license or right under the foregoing patents. Use of these and other patented processes in conjunction with the PCR process requires a license. For information on obtaining licenses, contact the Director of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, or The Licensing Department, Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California, 94501, USA. Trademarks Applied Biosystems, MicroAmp, Primer Express, ROX, and VIC are registered trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries. AB (Design), ABI PRISM, Applera, Assays-by-Design, Assays-on-Demand, Celera Genomics, FAM, iscience, iscience (Design), and MultiScribe are trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries. AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. SYBR Green is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. Microsoft and Windows are registered trademarks of Microsoft Corporation. All other trademarks are the sole property of their respective owners. Part Number 4347963 Rev. A 3/2004 ii 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 SAMPLE DOCUMENT 3 19, 2004 1:19 œ ŒÁ, GSG_FrontCover.fm
Primer Extended on mrna 5 3 Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 5 cdna Primer Extended on mrna 5 3 5 cdna Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna t u ç 1 t u 7300/7500 PCR t t u t u 2 t u t t u q Õ Õ - (RT-PCR) Å 3 RNA RNA è RNA cdna 4 t PCR t p t 5 t  t 7300/7500 u t PCR t u iii
iv 7300/7500 u t PCR t u
目 录 绝 对 定 量 实 验 工 作 流 程 iii 前 言 vii 如 何 使 用 本 指 南...................................................... vii 如 何 获 取 更 多 信 息.................................................... viii 如 何 获 取 服 务 与 支 持.................................................. viii 将 您 的 意 见 和 建 议 发 送 给 我 们........................................... viii 第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 1 概 述.................................................................1 关 于 7300/7500 PCR 仪.................................................2 关 于 绝 对 定 量 分 析......................................................2 关 于 绝 对 定 量 实 验......................................................3 绝 对 定 量 示 例 实 验......................................................6 第 2 章 设 计 绝 对 定 量 实 验 11 工 作 流 程............................................................11 概 述................................................................12 设 定 绝 对 定 量 实 验.....................................................12 选 择 化 学 荧 光.........................................................13 选 择 一 步 法 或 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR).........................14 选 择 探 针 和 引 物.......................................................15 第 3 章 执 行 反 转 录 17 工 作 流 程............................................................17 准 备 RNA 指 南.......................................................18 将 总 RNA 转 化 为 cdna................................................19 第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 21 工 作 流 程............................................................21 开 始 之 前............................................................22 准 备 PCR 扩 增 预 混 试 剂................................................22 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 v
准 备 反 应 板..........................................................23 创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件...........................................24 指 定 热 循 环 条 件 并 开 始 运 行 反 应 板........................................28 第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 31 工 作 流 程............................................................31 设 置 分 析 参 数........................................................32 调 整 基 线 和 阈 值.......................................................33 分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据...............................................39 忽 略 样 本............................................................44 导 出 绝 对 定 量 反 应 板 数 据...............................................45 附 录 A 创 建 探 针 47 附 录 B 生 成 标 准 曲 线 指 南 49 附 录 C 熔 解 曲 线 分 析 51 参 考 文 献 53 索 引 55 vi 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
前 言 如 何 使 用 本 指 南 本 指 南 的 目 的 本 指 南 为 使 用 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 (7300/7500 PCR 仪 ) 执 行 绝 对 定 量 实 验 分 析 的 主 要 研 究 人 员 及 实 验 室 人 员 而 编 写 假 定 本 指 南 假 定 您 已 具 备 以 下 条 件 : 熟 悉 Microsoft Windows XP 操 作 系 统 具 备 处 理 DNA 和 RNA 样 本 及 为 PCR 准 备 样 本 的 一 般 知 识 和 技 能 具 备 有 关 硬 盘 驱 动 器 数 据 存 储 文 件 传 输 复 制 和 粘 贴 数 据 的 一 般 常 识 如 果 您 希 望 将 7300/7500 PCR 仪 集 成 到 现 有 的 实 验 室 数 据 流 系 统 中, 则 需 具 备 网 络 经 验 文 字 体 例 用 户 警 示 文 字 粗 体 表 示 用 户 动 作 例 如 : 键 入 0, 然 后 对 剩 余 的 每 个 字 段 按 一 下 Enter 键 斜 体 表 示 新 的 或 重 要 的 内 容, 也 用 于 表 示 强 调 例 如 : 在 开 始 分 析 之 前, 请 始 终 准 备 好 新 鲜 基 质 右 箭 头 状 尖 括 号 (>) 用 于 分 开 您 从 下 拉 菜 单 或 快 捷 菜 单 中 依 次 选 择 的 命 令 例 如 : 选 择 File ( 文 件 ) > Open ( 打 开 ) > Spot Set ( 点 设 置 ) 在 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 用 户 文 档 中, 包 括 以 下 用 户 警 示 文 字 每 种 警 示 文 字 表 示 需 遵 守 事 项 或 执 行 动 作 的 不 同 重 要 性 级 别, 如 下 所 述 : : 提 供 使 用 产 品 的 有 趣 或 帮 助 性 信 息, 但 并 非 使 用 产 品 不 可 或 缺 的 事 项 或 操 作 重 要! 提 供 正 确 操 作 仪 器 精 确 使 用 化 学 试 剂 或 确 保 安 全 使 用 某 化 学 品 所 必 须 遵 守 的 要 求 或 必 须 执 行 的 操 作 表 示 存 在 潜 在 的 危 险 状 况, 如 果 不 加 以 避 免, 则 可 能 导 致 轻 度 或 中 度 人 身 伤 害 也 用 于 提 醒 避 免 不 安 全 的 操 作 表 示 存 在 潜 在 的 危 险 状 况, 如 果 不 加 以 避 免, 则 可 能 导 致 死 亡 或 严 重 人 身 伤 害 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 vii
前 言 如 何 获 取 更 多 信 息 安 全 注 意 事 项 有 关 重 要 的 安 全 注 意 事 项 信 息, 请 参 阅 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 安 装 和 维 护 入 门 指 南 和 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 场 地 准 备 指 南 如 何 获 取 更 多 信 息 有 关 使 用 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 的 更 多 信 息, 请 参 阅 : 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 联 机 帮 助 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 等 位 基 因 鉴 别 实 验 入 门 指 南 ( 货 号 4347964) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 阳 性 / 阴 性 实 验 入 门 指 南 ( 货 号 4347965) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 相 对 定 量 实 验 入 门 指 南 ( 货 号 4347966) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 安 装 和 维 护 入 门 指 南 ( 货 号 4347967) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 场 地 准 备 指 南 ( 货 号 4347968) 序 列 检 测 系 统 化 学 指 南 ( 货 号 4348358) 如 何 获 取 服 务 与 支 持 有 关 不 同 地 区 产 品 服 务 和 技 术 支 持 的 最 新 信 息, 请 登 录 网 站 http://www.appliedbiosystems.com 并 单 击 Support ( 支 持 ) 链 接 查 阅 在 Support ( 支 持 ) 页 上, 您 可 以 : 搜 索 并 查 阅 常 见 问 题 与 解 答 (FAQ) 直 接 向 技 术 支 持 人 员 提 交 问 题 进 行 咨 询 订 购 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 用 户 文 档 材 料 安 全 数 据 表 (MSDS) 分 析 证 书 及 其 它 相 关 文 档 下 载 PDF 文 档 获 取 有 关 客 户 培 训 的 信 息 下 载 软 件 更 新 和 补 丁 程 序 此 外, 在 Support ( 支 持 ) 网 页 上 还 提 供 全 球 各 地 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 技 术 支 持 和 销 售 机 构 的 电 话 和 传 真 号 码 将 您 的 意 见 和 建 议 发 送 给 我 们 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 欢 迎 您 对 我 们 的 文 档 提 出 您 的 宝 贵 意 见 和 建 议, 以 不 断 提 高 我 们 的 用 户 文 档 质 量 请 将 您 的 意 见 或 建 议 发 送 电 子 邮 件 至 : techpubs@appliedbiosystems.com viii 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
Primer Extended on mrna 5 3 Reverse Primer 5 cdna Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 1 概 述 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 关 于 7300/7500 PCR 仪 参 阅 第 2 页 设 计 绝 对 定 量 实 验 关 于 绝 对 定 量 分 析 参 阅 第 2 页 执 行 反 转 录 关 于 绝 对 定 量 实 验 参 阅 第 3 页 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 绝 对 定 量 示 例 实 验 参 阅 第 6 页 分 析 绝 对 定 量 数 据 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 1
第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 关 于 7300/7500 PCR 仪 关 于 7300/7500 PCR 仪 说 明 绝 对 定 量 分 析 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 (7300/7500 PCR 仪 ) 使 用 基 于 化 学 荧 光 的 PCR 检 测 手 段, 提 供 采 用 实 时 分 析 法 的 核 酸 序 列 定 量 检 测, 和 采 用 终 点 和 熔 解 曲 线 分 析 法 的 核 酸 序 列 定 性 检 测 功 能 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 允 许 使 用 96 孔 板 格 式 的 反 应 板 或 试 管 执 行 几 种 检 测 分 析 本 指 南 描 述 绝 对 定 量 (AQ) 实 验 分 析 有 关 其 它 实 验 检 测 与 分 析 的 说 明, 请 参 阅 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 序 列 检 测 系 统 化 学 指 南 (SDS Chemistry Guide) 和 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 联 机 帮 助 (Online Help) 关 于 绝 对 定 量 分 析 定 义 绝 对 定 量 分 析 用 于 确 定 未 知 样 本 中 某 个 目 标 核 酸 序 列 的 绝 对 量 值 实 时 PCR 分 析 使 用 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 进 行 阳 性 / 阴 性 分 析 和 等 位 基 因 鉴 别 分 析 绝 对 定 量 (AQ) 分 析 以 实 时 PCR 方 式 执 行 在 实 时 PCR 分 析 过 程 中,PCR 基 因 扩 增 一 直 在 您 的 监 控 之 中 在 PCR 进 行 期 间 进 行 数 据 采 集, 而 不 是 在 PCR 结 束 时 ( 终 点 PCR) 才 获 取 数 据 在 实 时 PCR 中, 反 应 是 在 目 标 的 扩 增 最 早 被 监 测 到 时 用 循 环 中 的 时 间 点 来 描 述 的, 而 不 是 在 PCR 结 束 时 通 过 目 标 的 累 积 数 来 描 述 尽 管 阳 性 / 阴 性 分 析 和 等 位 基 因 鉴 别 (AD) 分 析 是 终 点 分 析, 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 仍 建 议 您 使 用 7300/7500 PCR 仪 执 行 扩 增, 并 观 察 实 时 PCR 结 果 若 一 旦 实 验 失 败, 您 可 通 过 研 究 扩 增 图 谱 来 帮 助 确 定 实 验 失 败 的 原 因 使 用 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 来 存 储 阳 性 / 阴 性 分 析 和 等 位 基 因 鉴 别 (AD) 分 析 的 实 时 数 据 用 于 阳 性 / 阴 性 分 析 和 等 位 基 因 鉴 别 分 析 的 绝 对 定 量 反 应 板 文 件, 不 需 要 标 准 曲 线 2 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
关 于 绝 对 定 量 实 验 绝 对 定 量 实 验 工 作 流 程 关 于 绝 对 定 量 实 验 绝 对 定 量 实 验 工 作 流 程 本 文 中 绝 对 定 量 (AQ) 实 验 术 语 是 指 绝 对 定 量 实 验 分 析 的 整 个 过 程, 以 从 核 糖 核 酸 (RNA) 生 成 互 补 脱 氧 核 糖 核 酸 (cdna) ( 反 转 录 ) 为 起 点, 直 到 分 析 绝 对 定 量 数 据 结 束 绝 对 定 量 实 验 工 作 流 程 包 括 几 个 步 骤, 如 第 iii 页 流 程 图 所 示 绝 对 定 量 分 析 使 用 标 准 曲 线 计 算 某 个 未 知 目 标 序 列 的 数 量 绝 对 定 量 实 验 的 结 果 采 用 标 准 曲 线 中 所 使 用 的 相 同 测 量 单 位 7300/7500 PCR 仪 存 储 从 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 中 的 反 应 板 上 收 集 的 实 时 PCR 数 据 每 次 运 行 包 括 一 个 反 应 板 7300/7500 PCR 仪 提 供 几 种 视 图 用 来 分 析 数 据 1 反 应 板 上 的 反 应 7300/7500 PCR 仪 SDS 软 件 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 3
第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 关 于 绝 对 定 量 实 验 定 量 分 析 中 使 用 的 术 语 术 语 定 义 基 线 PCR 的 最 初 几 次 循 环, 在 此 基 线 上 荧 光 信 号 几 乎 没 有 变 化 阈 值 Delta R n ( 校 正 后 报 告 荧 光 强 度 ) 的 一 个 值 由 SDS 软 件 自 动 确 定 或 手 动 设 置 用 于 在 实 时 实 验 分 析 中 确 定 C T 值 此 阈 值 应 设 置 为 高 于 基 线, 但 应 足 够 地 低, 使 其 控 制 在 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 阶 段 范 围 之 内 阈 值 线 与 扩 增 曲 线 的 交 叉 点 确 定 C T 值 阈 值 循 环 (C T ) 荧 光 信 号 强 度 超 过 设 置 的 阈 值 强 度 时 所 经 历 的 循 环 数 无 模 板 对 照 (NTC) 不 包 含 模 板 的 样 本 用 于 验 证 扩 增 量 目 标 核 酸 ( 又 称 模 板 ) 阳 性 参 比 荧 光 报 告 基 团 您 想 要 确 定 是 否 含 有 或 其 数 量 为 多 少 的 核 苷 酸 序 列 一 种 荧 光, 其 本 身 产 生 一 种 内 部 荧 光, 通 过 参 比 这 种 荧 光, 在 数 据 分 析 期 间 对 报 告 基 团 信 号 进 行 标 准 化 标 准 化 对 于 纠 正 由 于 浓 度 或 体 积 发 生 改 变 而 引 起 的 荧 光 波 动 现 象 是 必 须 的 此 荧 光 加 在 TaqMan 探 针 的 5 端 它 发 出 的 荧 光 信 号 作 为 特 异 性 扩 增 的 指 示 物 校 正 后 报 告 荧 光 强 度 与 阳 性 参 比 荧 光 信 号 强 度 相 比 较 的 报 告 基 团 荧 光 信 号 强 度 (R n ) Delta R n ( R n ) 在 给 定 的 一 组 PCR 条 件 下 所 生 成 信 号 的 量 值 ( R n = R n 基 线 ) 标 准 样 本 已 知 量 的 样 本, 用 于 构 建 标 准 曲 线 未 知 样 本 包 含 您 要 测 定 的 模 板 的 样 本, 模 板 的 量 未 知 下 图 显 示 了 一 个 有 代 表 性 的 扩 增 图 谱, 其 中 包 括 上 表 定 义 的 一 些 术 语 GR0757 0 5 10 15 20 25 30 35 40 4 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
关 于 绝 对 定 量 实 验 用 户 需 提 供 的 材 料 用 户 需 提 供 的 材 料 项 目 ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation (ABI PRISM 6100 核 酸 提 取 仪 ) ABI PRISM Optical Tubes (8 Tubes/Strip) * (ABI PRISM 光 学 反 应 管, 每 条 带 8 支 管 ) ABI PRISM Optical Caps, 8 caps/strip (Flat) (ABI PRISM 光 学 反 应 盖 板, 每 条 带 8 个 盖 板, 平 板 式 ) High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (MicroAmp 光 学 96 孔 反 应 板 ) MicroAmp Optical Tubes * (MicroAmp 光 学 反 应 管 ) 来 源 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 6100-01) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 4316567) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 4323032) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 4322171) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 4304437) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 4306757) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 N801-0933) Optical Adhesive Cover ( 孔 板 高 透 光 度 盖 膜 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 4311971) 下 列 任 一 来 源 的 标 记 引 物 和 探 针 : Assays-on-Demand Gene Expression Products (Assays-on-Demand 基 因 表 达 产 品 )( 预 先 设 计 的 引 物 和 探 针 ) Assays-by-Design ( 代 客 设 计 引 物 和 探 针 ) 服 务 ( 预 先 设 计 的 引 物 和 探 针 ) Primer Express ( 引 物 设 计 ) 软 件 ( 定 制 设 计 引 物 和 探 针 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 网 址 与 您 的 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 销 售 代 表 联 系 货 号 4330710 (1 用 户 许 可 证 ) 货 号 4330709 (10 用 户 许 可 证 ) 货 号 4330708 (50 用 户 许 可 证 ) 带 帽 试 管, 10 ml 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 4305932) 配 备 96 孔 板 转 接 器 的 离 心 机 手 套 微 型 离 心 机 微 型 离 心 管, 无 菌 型 1.5 ml 无 核 酸 酶 水 移 液 管 滴 头, 带 过 滤 塞 正 置 换 移 液 器 微 型 漩 涡 式 混 合 器 (Vortexer) 主 要 实 验 室 供 应 商 (MLS) 主 要 实 验 室 供 应 商 主 要 实 验 室 供 应 商 主 要 实 验 室 供 应 商 主 要 实 验 室 供 应 商 主 要 实 验 室 供 应 商 主 要 实 验 室 供 应 商 主 要 实 验 室 供 应 商 1 * 重 要 : 当 使 用 MicroAmp 光 学 反 应 管 或 ABI PRISM 光 学 反 应 管 时, 在 使 用 ABI PRISM 光 学 反 应 盖 板 覆 盖 之 后, 将 其 安 装 到 直 接 托 盘 的 电 极 固 定 架 上 ( 不 可 使 用 托 盘 / 固 位 器 ) 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 5
第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 绝 对 定 量 示 例 实 验 绝 对 定 量 示 例 实 验 概 述 说 明 为 更 好 地 说 明 怎 样 设 计 执 行 及 分 析 绝 对 定 量 实 验, 本 节 提 供 一 个 示 例 实 验 示 例 实 验 是 一 个 有 代 表 性 的 典 型 绝 对 定 量 实 验, 您 可 将 其 视 为 快 速 入 门 操 作 程 序 来 熟 悉 绝 对 定 量 实 验 的 工 作 流 程 有 关 绝 对 定 量 实 验 工 作 流 程 的 详 细 描 述, 将 在 本 指 南 的 后 续 章 节 中 讲 述 在 随 后 的 章 节 中 用 示 例 实 验 框 式 图 给 出 示 例 实 验 中 一 些 相 关 步 骤 的 细 节 绝 对 定 量 示 例 实 验 的 目 的 是 确 定 两 个 分 组 中 单 个 RNase P ( 核 糖 核 酸 酶 P) 基 因 的 重 复 数 本 示 例 设 计 为 单 一 PCR 扩 增, 引 物 和 探 针 使 用 Primer Express ( 引 物 设 计 ) 软 件 设 计 通 过 对 已 知 量 样 本 的 一 系 列 稀 释, 制 备 一 组 标 准 样 本 反 应 设 定 为 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR), 分 别 使 用 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) 和 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) 参 与 反 转 录 和 PCR 扩 增 通 过 运 行 单 个 绝 对 定 量 反 应 板 生 成 数 据, 反 应 板 包 含 标 准 曲 线 和 样 本, 然 后 使 用 随 7300/7500 PCR 仪 提 供 的 软 件 对 数 据 进 行 分 析 6 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
绝 对 定 量 示 例 实 验 绝 对 定 量 示 例 实 验 过 程 绝 对 定 量 示 例 实 验 过 程 1. 设 计 实 验, 参 阅 第 2 章 a. 指 定 未 知 样 本, 准 备 标 准 曲 线, 并 确 定 重 复 数 b. 订 购 基 于 TaqMan 探 针 化 学 荧 光 的 试 剂 c. 使 用 Primer Express ( 引 物 设 计 ) 软 件 设 计 引 物 和 探 针 1 2. 提 取 总 RNA, 参 阅 第 3 章 3. 使 用 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) 从 总 RNA 生 成 cdna, 参 阅 第 3 章 a. 按 右 表 所 示, 准 备 反 转 录 (RT) 预 混 试 剂 在 High Capacity cdna Archive Kit Protocol ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 实 验 方 案 ) 中 提 供 了 更 详 细 的 指 导 化 学 品 危 险 10 反 转 录 (RT) 缓 冲 液 会 刺 激 眼 睛 皮 肤 和 呼 吸 道 请 认 真 阅 读 MSDS 并 遵 守 操 作 规 程 穿 戴 合 适 的 保 护 眼 罩 衣 服 和 手 套 成 分 10 Reverse Transcription Buffer ( 反 转 录 缓 冲 液 ) 25 dntp ( 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 ) RT Master Mix (RT 预 混 试 剂 ) µl / 1 次 反 应 a µl / 7 次 反 应 10 70 4 28 10 随 机 引 物 10 70 MultiScribe Reverse Transcriptase ( 反 转 录 酶 ), 50 U/µL 5 35 无 核 酸 酶 水 21 147 总 计 50 350 a. 每 个 RT 反 应 体 积 为 100 µl ( 参 阅 步 骤 3b) 对 于 104 次 PCR 扩 增 反 应 ( 参 阅 步 骤 4) 的 每 次 反 应 如 果 需 要 5 µl cdna, 则 需 要 6 次 反 转 录 (RT) 反 应 应 包 含 额 外 的 体 积 ( 足 够 用 于 一 次 额 外 反 转 录 (RT) 反 应 ) 以 弥 补 移 液 过 程 中 造 成 的 损 失, 并 需 有 额 外 的 cdna 用 于 建 库 b. 向 反 应 板 的 每 个 反 应 孔 中 吸 取 以 下 体 积 的 液 体, 准 备 cdna 库 反 应 板 : 50 µl 反 转 录 (RT) 预 混 试 剂 30 µl 无 核 酸 酶 水 20 µl RNA 样 本 确 保 对 于 每 次 50 µl PCR 扩 增 反 应, 从 总 RNA 转 化 为 cdna 的 质 量 为 10 至 100 ng, 体 积 5 µl GR2322 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 7
. 第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 绝 对 定 量 示 例 实 验 c. 使 用 为 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 方 法 给 出 的 各 项 参 数 值, 设 计 热 循 环 : 您 也 可 使 用 一 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR), 有 关 说 明, 请 参 阅 第 14 页 选 择 一 步 法 或 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) d. 在 20 C 温 度 下 贮 存 cdna, 直 到 使 用 时 4. 按 右 表 所 示, 准 备 PCR 扩 增 预 混 试 剂 有 关 详 情, 请 参 阅 第 4 章 :Assays-on-Demand 和 Assays-by- Design ( 代 客 设 计 引 物 和 探 针 ) 产 品 的 反 应 体 积, 显 示 在 随 这 些 产 品 提 供 的 插 卡 说 明 中 化 学 品 危 险 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) 对 眼 睛 和 皮 肤 有 刺 激 性 无 保 护 下 吞 咽 或 吸 入 会 导 致 不 适 感 觉 请 认 真 阅 读 MSDS 并 遵 守 操 作 规 程 穿 戴 合 适 的 保 护 眼 罩 衣 服 和 手 套 5. 准 备 反 应 板 a. 在 反 应 板 上 作 上 标 签, 确 保 您 为 每 个 目 标 序 列 包 括 一 组 标 准 样 本 标 准 样 本 必 须 与 目 标 序 列 同 在 一 个 反 应 板 上 b. 吸 取 50 µl 适 当 的 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ( 含 cdna), 滴 入 反 应 板 的 每 一 个 反 应 孔 中 c. 将 反 应 板 置 于 冰 上 直 到 您 准 备 好 将 其 装 入 7300/7500 PCR 仪 步 骤 类 型 时 间 温 度 保 持 10 分 25 C 保 持 120 分 37 C PCR Master Mix (PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) a 反 应 成 分 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) (2 ) µl/ 样 本 终 浓 度 25.0 1 正 向 引 物 5.0 50 至 900 nm 反 向 引 物 5.0 50 至 900 nm TaqMan 探 针 5.0 50 至 250 nm cdna 样 本 5.0 10 至 100 ng 无 核 酸 酶 水 5.0 - 总 计 50.0 - a. 对 于 本 示 例 实 验, 准 备 了 八 份 PCR 预 混 试 剂, 两 个 样 本 分 组 各 使 用 一 份 ( 进 行 37 次 反 应 ), 六 个 标 准 样 本 各 使 用 一 份 ( 进 行 5 次 反 应 ) 应 包 含 额 外 的 体 积 以 弥 补 移 液 过 程 中 造 成 的 损 失 cdna 直 接 加 入 每 一 份 预 混 试 剂 中 RNase P 分 组 1 NTC STD 1250 STD 2500 STD 5000 STD 10000 STD 20000 RNase P 分 组 2 GR2341 8 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
绝 对 定 量 示 例 实 验 绝 对 定 量 示 例 实 验 过 程 6. 创 建 绝 对 定 量 反 应 板 文 件, 如 第 24 页 创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 所 述 简 言 之, a. 选 择 File ( 文 件 ) > New ( 新 建 ) b. 从 Assay ( 实 验 ) 下 拉 列 表 中, 选 择 Absolute Quantification (Standard Curve) ( 绝 对 定 量, 标 准 曲 线 ), 然 后 单 击 Next > ( 下 一 步 >) 1 重 要! 您 不 能 使 用 相 对 定 量 (RQ) 反 应 板 文 件 执 行 绝 对 定 量 (AQ) 实 验 分 析, 反 之 亦 然 存 储 在 绝 对 定 量 (AQ) 和 相 对 定 量 (RQ) 反 应 板 文 件 中 的 信 息 不 可 互 相 交 换 c. 将 探 针 添 加 到 反 应 板 文 件 中, 然 后 单 击 Next > ( 下 一 步 >) d. 为 每 个 孔 指 定 探 针 和 任 务, 然 后 单 击 Finish ( 完 成 ) 7. 在 Well Inspector ( 反 应 孔 设 定 ) 窗 口 ( 依 次 选 择 View ( 视 图 ) > Well Inspector ( 反 应 孔 设 定 )) 中, 输 入 样 本 名 重 要! 如 果 您 的 实 验 不 使 用 反 应 板 上 的 所 有 反 应 孔, 此 步 骤 中 请 不 要 忽 略 任 何 要 使 用 的 反 应 孔 程 序 完 成 后 您 可 以 忽 略 未 使 用 的 反 应 孔 有 关 忽 略 未 使 用 反 应 孔 的 更 详 细 信 息, 请 参 阅 联 机 帮 助 右 图 显 示 了 完 整 的 反 应 板 设 定 8. 开 始 绝 对 定 量 (AQ) 程 序 a. 选 择 Instrument ( 仪 器 ) 选 项 卡 默 认 情 况 下, 显 示 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 方 法 中 PCR 步 骤 的 标 准 PCR 条 件 b. 选 择 File ( 文 件 ) > Save As ( 另 存 为 ), 输 入 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 的 文 件 名, 然 后 单 击 Save ( 保 存 ) c. 将 反 应 板 装 入 仪 器 中 d. 单 击 Start ( 开 始 ) 运 行 结 束 后, 屏 幕 上 显 示 信 息 报 告 运 行 是 否 成 功 或 遇 到 错 误 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 9
第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 绝 对 定 量 示 例 实 验 9. 分 析 绝 对 定 量 数 据, 请 参 阅 第 5 章 a. 单 击 或 选 择 Analysis ( 分 析 ) > Analysis Settings ( 分 析 设 置 ) 以 设 置 分 析 参 数 使 用 Auto Ct ( 自 动 Ct) 选 项 : 有 关 详 情, 请 参 阅 第 32 页 配 置 分 析 设 置 b. 单 击 OK & Reanalyze ( 确 定 并 再 次 分 析 ), 或 选 择 Analysis ( 分 析 ) > Analyze ( 执 行 分 析 ) 以 再 次 分 析 数 据 c. 如 果 有 必 要, 手 动 调 整 基 线 和 阈 值 : 有 关 详 情, 请 参 阅 第 33 页 调 整 基 线 和 阈 值 d. 单 击 OK & Reanalyze ( 确 定 并 再 次 分 析 ), 或 选 择 Analysis ( 分 析 ) > Analyze ( 执 行 分 析 ) 以 再 次 分 析 数 据 e. 查 看 分 析 结 果 结 论 根 据 标 准 曲 线 进 行 推 测, 分 组 1 中 的 RNase P ( 核 糖 核 酸 酶 P) 基 因 的 重 复 数 为 5000, 分 组 2 中 为 10000 10 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
Primer Extended on mrna 5 3 Reverse Primer 5 cdna Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 第 2 章 设 计 绝 对 定 量 实 验 工 作 流 程 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 2 设 计 绝 对 定 量 实 验 概 述 参 阅 第 12 页 执 行 反 转 录 设 定 绝 对 定 量 实 验 参 阅 第 12 页 选 择 化 学 荧 光 参 阅 第 13 页 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 选 择 一 步 法 或 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 参 阅 第 14 页 选 择 探 针 和 引 物 参 阅 第 15 页 分 析 绝 对 定 量 数 据 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 11
第 2 章 设 计 绝 对 定 量 实 验 概 述 概 述 典 型 的 绝 对 定 量 实 验 设 计 采 用 传 统 ( 单 一 ) PCR 扩 增, 每 个 反 应 中 包 括 单 个 引 物 对, 加 上 一 个 TaqMan 探 针 或 SYBR 结 合 荧 光 以 下 部 分 描 述 设 计 绝 对 定 量 实 验 需 考 虑 的 因 素 设 定 绝 对 定 量 实 验 示 例 试 验 对 于 每 个 绝 对 定 量 实 验, 需 要 指 定 : 一 个 未 知 样 本 即 您 要 确 定 其 量 值 的 核 酸 序 列 一 组 标 准 样 本 本 指 南 假 定 您 已 为 要 确 定 其 量 值 的 每 一 个 目 标 序 列 生 成 了 一 组 标 准 样 本 附 录 B 可 为 您 提 供 有 关 生 成 标 准 样 本 的 详 细 指 导 重 复 反 应 孔 对 于 绝 对 定 量 实 验 分 析, 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 建 议 您 对 每 个 样 本 使 用 三 个 或 更 多 重 复 反 应, 以 确 保 统 计 显 著 性 有 关 这 些 要 求 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 SDS 化 学 指 南 本 示 例 实 验 的 目 的 是 确 定 RNase P ( 核 糖 核 酸 酶 P) 基 因 在 两 个 分 组 中 的 数 量 由 于 只 是 研 究 分 析 单 一 的 基 因, 因 此 只 需 要 使 用 一 组 标 准 样 本 (A) 反 应 中 每 个 未 知 样 本 和 标 准 样 本 使 用 了 四 个 重 复 反 应 孔, 以 确 保 统 计 显 著 性 在 同 时 研 究 分 析 多 个 基 因 的 实 验 中, 每 个 基 因 需 要 使 用 一 组 自 己 的 标 准 样 本 (B) A. 单 一 基 因 在 两 个 分 组 中 B. 两 个 基 因 在 两 个 分 组 中 RNase P 分 组 1 RNase P 分 组 1 RNase P 分 组 2 NTC STD 1250 STD 2500 STD 5000 STD 10000 STD 20000 NTC STD 1250 STD 2500 STD 5000 STD 10000 STD 20000 IL-10 分 组 1 IL-10 分 组 2 NTC STD 1250 STD 2500 STD 5000 STD 10000 STD 20000 RNase P 分 组 2 GR2341 GR2364 12 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
选 择 化 学 荧 光 关 于 化 学 荧 光 选 择 化 学 荧 光 关 于 化 学 荧 光 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 提 供 两 种 化 学 荧 光 试 剂, 用 于 通 过 实 时 PCR 仪 检 测 PCR 产 品, 如 下 表 所 述 基 于 TaqMan 探 针 和 SYBR Green I 荧 光 的 两 种 化 学 荧 光 试 剂 都 可 用 于 一 步 法 或 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 有 关 这 些 化 学 荧 光 试 剂 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 SDS 化 学 指 南 化 学 荧 光 过 程 TaqMan 试 剂 或 试 剂 盒 说 明 基 于 TaqMan 试 剂 的 化 学 荧 光 使 用 一 种 可 发 荧 光 的 探 针 来 检 测 在 PCR 循 环 期 间 聚 积 的 某 种 特 异 性 PCR 产 物 5 3 R Q 3 5 3 5 5 5 3 R Q 3 5 3 5 5 2 优 点 通 过 探 针 增 强 特 异 性 探 针 与 目 标 之 间 的 特 异 杂 交 产 生 荧 光 信 号 提 供 多 重 基 因 检 测 功 能 优 化 可 用 的 实 验 分 析 方 法 允 许 在 PCR 期 间 执 行 5 核 酸 酶 检 测 分 析 5 3 R Q 3 5 5 3 R Q 3 5 5 3 5 5 3 5 SYBR Green I 试 剂 说 明 使 用 SYBR Green I 荧 光 ( 一 种 双 链 DNA 结 合 荧 光 ), 在 PCR 循 环 期 间 PCR 产 物 聚 集 的 同 时 对 PCR 产 物 进 行 检 测 和 分 析 优 点 降 低 成 本 ( 不 需 要 探 针 ) 可 扩 增 所 有 双 链 DNA 产 生 PCR 扩 增 运 行 的 特 征 性 解 链 图 表 增 大 相 对 于 产 物 长 度 而 言 的 扩 增 产 物 检 测 灵 敏 度 局 限 性 可 与 所 有 双 链 DNA 序 列 结 合, 从 而 降 低 了 特 异 性 为 避 免 假 阳 性 信 号, 应 使 用 熔 解 曲 线 或 凝 胶 分 析 来 检 查 非 特 异 性 产 物 的 构 成 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 13
第 2 章 设 计 绝 对 定 量 实 验 选 择 一 步 法 或 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 选 择 一 步 法 或 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 执 行 实 时 PCR 时, 您 可 选 择 在 单 一 反 应 ( 一 步 法 ) 或 在 分 开 的 两 个 反 应 ( 两 步 法 ) 中 执 行 反 转 录 (RT) 和 PCR 扩 增 您 要 使 用 的 试 剂 配 置 取 决 于 您 选 择 的 是 一 步 法 或 两 步 法 RT-PCR: 两 步 法 RT-PCR 在 两 个 分 开 的 反 应 中 执 行 : 首 先, 总 RNA 反 转 录 为 cdna, 然 后 通 过 PCR 对 cdna 进 行 扩 增 这 种 方 法 适 合 于 检 测 从 单 个 cdna 模 板 发 生 的 多 个 转 录, 或 保 存 等 分 cdna 以 便 未 来 使 用 可 使 用 AmpErase UNG 酶 来 防 止 残 留 污 染 两 步 法 RT-PCR 重 要! 本 指 南 假 定 绝 对 定 量 实 验 设 计 为 两 步 法 RT-PCR 有 关 附 加 选 项 的 详 情, 请 参 阅 SDS 化 学 指 南 在 一 步 法 RT-PCR 中, 反 转 录 (RT) 和 PCR 扩 增 在 同 一 个 缓 冲 液 系 统 中 发 生, 只 需 简 单 地 使 用 一 个 试 管 即 可 做 好 RT 及 PCR 扩 增 准 备 然 而, 在 一 步 法 RT-PCR 中, 您 不 能 使 用 残 留 抑 制 酶 AmpErase UNG (uracil-nglycosylase, 即 尿 嘧 啶 -N- 糖 基 化 酶 ) 有 关 UNG 酶 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 SDS 化 学 指 南 一 步 法 RT-PCR GR2333 14 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
选 择 探 针 和 引 物 建 议 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 使 用 的 试 剂 盒 化 学 试 剂 步 骤 试 剂 货 号 TaqMan 试 剂 或 试 剂 盒 反 转 录 (RT) High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) PCR 扩 增 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) SYBR Green I 试 剂 或 试 剂 盒 反 转 录 (RT) High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) PCR 扩 增 反 转 录 (RT) 和 PCR 扩 增 SYBR Green Master Mix (SYBR Green 预 混 试 剂 ) SYBR Green RT-PCR Reagents (SYBR Green RT-PCR 试 剂 ) 4322171 4304437 4322171 4309155 4310179 2 示 例 试 验 上 表 列 出 了 在 两 步 法 RT-PCR 中 使 用 TaqMan 试 剂 和 试 剂 盒 的 方 法 选 择 探 针 和 引 物 为 目 标 序 列 选 择 成 套 探 针 和 引 物 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 为 选 择 探 针 和 引 物 提 供 三 种 选 择 : Assays-on-Demand Gene Expression Products (Assays-on-Demand 基 因 表 达 产 品 ) 提 供 优 化 备 妥 的 TaqMan 5 核 酸 酶 实 验 分 析 套 件, 用 于 人 小 鼠 或 大 鼠 基 因 转 录 有 关 引 物 / 探 针 套 件 的 更 多 信 息, 请 登 陆 以 下 网 址 查 阅 : http://www.allgenes.com Assays-by-Design SM ( 代 客 设 计 引 物 和 探 针 ) 服 务 设 计 合 成 组 合 及 提 供 高 质 量 的 引 物 和 探 针 配 套 服 务 如 果 您 所 需 的 引 物 / 探 针 组 合 当 前 尚 未 备 妥, 可 使 用 这 项 服 务 要 定 购 此 服 务, 请 与 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 代 表 联 系 Primer Express ( 引 物 设 计 ) 软 件 帮 助 您 为 自 己 的 定 量 实 验 分 析 设 计 引 物 和 探 针 有 关 使 用 此 软 件 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 Primer Express 软 件 2.0 版 用 户 手 册 ( 货 号 4329500) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 提 供 实 验 分 析 设 计 指 南, 专 为 定 量 分 析 设 计 开 发 遵 照 这 些 实 验 分 析 设 计 指 南, 可 为 设 计 和 优 化 分 析 提 供 快 捷 可 靠 的 实 验 系 统 有 关 这 些 实 验 分 析 设 计 指 南 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 SDS 化 学 指 南 示 例 试 验 RNase P ( 核 糖 核 酸 酶 P) 的 引 物 和 探 针 使 用 Primer Express ( 引 物 设 计 ) 软 件 设 计 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 15
第 2 章 设 计 绝 对 定 量 实 验 选 择 探 针 和 引 物 16 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
5 cdna Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 第 3 章 执 行 反 转 录 Primer Extended on mrna 5 3 5 cdna Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 工 作 流 程 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 设 计 绝 对 定 量 实 验 3 Primer Extended on mrna 5 3 执 行 反 转 录 提 取 总 RNA 参 阅 第 18 页 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 调 整 RNA 浓 度 参 阅 第 18 页 分 析 绝 对 定 量 数 据 将 总 RNA 转 化 为 cdna 参 阅 第 19 页 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 17
Primer Extended on mrna 5 3 5 cdna Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer 3 5 cdna Synthesis of 1st cdna strand 第 3 章 执 行 反 转 录 准 备 RNA 指 南 准 备 RNA 指 南 提 取 总 RNA 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 提 供 多 种 从 不 同 原 材 料 中 提 取 RNA 的 仪 器 系 统 和 化 学 试 剂, 如 从 血 液 组 织 培 养 细 胞 植 物 材 料 中 提 取 RNA 系 统 ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation (ABI PRISM 6100 核 酸 提 取 仪 ) 总 RNA 化 学 试 剂 : Nucleic Acid Purification Elution Solution ( 核 酸 提 取 洗 脱 溶 液 ) Nucleic Acid Purification Lysis Solution ( 核 酸 提 取 分 解 溶 液 ) Nucleic Acid Purification Wash Solution I ( 核 酸 提 取 洗 液 I) Nucleic Acid Purification Wash Solution II ( 核 酸 提 取 洗 液 II) AbsoluteRNA Wash Solution (DNase treatment) (AbsoluteRNA 洗 液, DNA 酶 处 理 ) Tempus Blood RNA Tubes(Tempus 血 液 RNA 试 管 )( 用 于 使 用 6100 PrepStation 在 基 因 分 析 中 采 集 稳 定 和 提 取 全 血 中 的 总 RNA) Isolation of Total RNA from Whole Blood and from Cells Isolated from Whole Blood Protocol ( 从 全 血 中 提 取 总 RNA 和 从 全 血 中 提 取 细 胞 及 总 RNA 实 验 方 案 ) Tempus Blood RNA Tube and Large Volume Consumables Protocol (Tempus 血 液 RNA 试 管 和 大 容 量 耗 材 实 验 方 案 ) 提 取 组 织 RNA:Isolation of Total RNA from Plant and Animal Tissue Protocol ( 从 植 物 和 动 物 组 织 中 提 取 总 RNA 实 验 方 案 ) 货 号 6100-01 4305893 4305895 4305891 4305890 4305545 4342972 4332809 4345218 4330252 RNA 的 质 量 确 保 您 在 绝 对 定 量 实 验 中 使 用 的 RNA 符 合 以 下 条 件 : 其 A 260/280 比 率 高 于 1.9 用 凝 胶 电 泳 观 察 是 完 整 无 损 的 不 含 反 转 录 (RT) 或 PCR 抑 制 剂 High Capacity cdna Archive Kit Protocol ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 实 验 方 案 ) (4312169) 中 包 括 准 备 RNA 模 板 的 附 加 说 明 调 整 总 RNA 的 始 浓 度 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 实 验 方 案 ) 已 经 过 优 化, 可 将 0.1 至 10 µg 的 总 RNA 转 化 为 cdna 对 于 每 个 50 µl PCR 反 应, 应 将 足 够 量 的 总 RNA 转 化 为 cdna, 以 便 cdna 的 终 浓 度 为 10 至 100 ng / 5 µl 18 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
Primer Extended on mrna 5 3 5 cdna Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer 3 5 cdna 将 总 RNA 转 化 为 cdna 使 用 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) Synthesis of 1st cdna strand 将 总 RNA 转 化 为 cdna 使 用 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) 使 用 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 )( 货 号 4322171) 在 两 步 法 RT-PCR 中 执 行 第 一 步 (RT) 按 照 High Capacity cdna Archive Kit Protocol ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 实 验 方 案 )( 货 号 4322169) 中 描 述 的 手 动 方 法, 将 总 RNA 转 化 为 cdna 重 要! 此 实 验 方 案 并 不 随 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) 提 供 请 从 以 下 网 站 下 载 实 验 方 案 : http://docs.appliedbiosystems.com/search.taf 要 搜 索 此 文 件, 在 Product ( 产 品 ) 列 表 框 中 选 择 ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation (ABI PRISM 6100 核 酸 提 取 仪 ), 然 后 单 击 网 页 底 部 的 Search ( 搜 索 ) 按 钮 在 Protocols ( 实 验 方 案 ) 标 题 下 会 列 出 此 实 验 方 案 反 转 录 (RT) 的 热 循 环 参 数 设 置 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) 使 用 以 下 热 循 环 参 数 执 行 反 转 录 (RT) 步 骤 步 骤 类 型 时 间 温 度 保 持 10 分 25 C 保 持 120 分 37 C : 一 步 法 RT-PCR 的 热 循 环 条 件 在 第 28 页 中 加 以 描 述 3 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 19
Primer Extended on mrna 5 3 5 cdna Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer 3 5 cdna Synthesis of 1st cdna strand 第 3 章 执 行 反 转 录 将 总 RNA 转 化 为 cdna 贮 存 cdna 在 转 化 cdna 之 后, 应 将 所 有 cdna 样 本 贮 存 在 15 至 25 C 温 度 下 为 将 重 复 冷 冻 和 解 冻 cdna 的 次 数 降 至 最 少, 应 以 等 分 方 式 分 开 贮 存 cdna 样 本 化 学 品 危 险 10 反 转 录 (RT) 缓 冲 液 会 刺 激 眼 睛 皮 肤 和 呼 吸 道 请 认 真 阅 读 MSDS 并 遵 守 操 作 规 程 穿 戴 合 适 的 保 护 眼 罩 衣 服 和 手 套 示 例 试 验 总 RNA 是 从 血 液 中 提 取 的 RNA 浓 度 使 用 A 260 确 定, 并 稀 释 为 终 浓 度 50 ng/µl 反 转 录 (RT) 预 混 试 剂 按 以 下 方 法 制 备, 使 用 High Capacity cdna Archive Kit Protocol ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 实 验 方 案 ) 提 供 的 指 南 : 成 分 10 Reverse Transcription Buffer ( 反 转 录 缓 冲 液 ) µl / 1 次 反 应 然 后 向 每 个 反 应 孔 中 滴 入 以 下 试 剂, 准 备 cdna 库 反 应 板 : 50 µl 反 转 录 (RT) 预 混 试 剂 30 µl 无 核 酸 酶 水 20 µl RNA 样 本 ( 使 每 个 100 µl 反 应 的 RNA 初 始 总 量 为 1 µg) µl / 7 次 反 应 a 10 70 25 dntp ( 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 ) 4 28 10 随 机 引 物 10 70 MultiScribe Reverse Transcriptase (MultiScribe 反 转 录 酶 ), 50 U/µL 5 35 无 核 酸 酶 水 21 147 总 计 50 350 a. 每 个 反 转 录 (RT) 反 应 体 积 为 100 µl ( 参 阅 下 文 ) 对 于 104 次 PCR 扩 增 反 应 ( 参 阅 第 23 页 准 备 反 应 板 ) 的 每 次 反 应 如 果 需 要 5 µl cdna, 则 需 要 6 次 反 转 录 (RT) 反 应 应 包 含 额 外 的 体 积 ( 足 够 用 于 一 次 额 外 反 转 录 (RT) 反 应 ) 以 弥 补 移 液 过 程 中 造 成 的 损 失, 并 需 有 额 外 的 cdna 用 于 建 库 GR2322 然 后 使 用 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 的 热 循 环 参 数 将 RNA 转 化 为 cdna, 如 第 19 页 反 转 录 (RT) 的 热 循 环 参 数 设 置 所 述 将 cdna 贮 存 在 20 C 温 度 下, 直 到 使 用 时 20 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
Primer Extended on mrna 5 3 Reverse Primer 5 cdna Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 工 作 流 程 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 准 备 PCR 预 混 试 剂 参 阅 第 22 页 设 计 绝 对 定 量 实 验 准 备 反 应 板 参 阅 第 23 页 创 建 新 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 参 阅 第 24 页 执 行 反 转 录 设 计 热 循 环 条 件 参 阅 第 28 页 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 保 存 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 参 阅 第 29 页 4 开 始 运 行 反 应 板 参 阅 第 30 页 分 析 绝 对 定 量 数 据 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 21
第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 开 始 之 前 开 始 之 前 检 查 并 确 保 已 定 期 执 行 背 景 和 纯 荧 光 校 正 程 序, 以 确 保 7300/7500 PCR 仪 处 于 最 佳 运 行 状 态 欲 了 解 校 正 7300/7500 PCR 仪 的 更 多 信 息, 请 参 阅 联 机 帮 助 准 备 PCR 扩 增 预 混 试 剂 两 步 法 RT-PCR 的 第 二 步 (PCR) 是 扩 增 cdna, 使 用 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) 试 剂 执 行 扩 增 程 序 TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol(TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 实 验 方 案 )( 货 号 4304449) 中 说 明 了 如 何 使 用 试 剂 盒 中 的 试 剂 下 表 列 出 了 使 用 预 混 试 剂 的 常 用 实 验 分 析 条 件 ( 体 积 和 终 浓 度 ) 化 学 品 危 险 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) 对 眼 睛 和 皮 肤 有 刺 激 性 无 保 护 下 吞 咽 或 吸 入 会 导 致 不 适 感 觉 请 认 真 阅 读 MSDS 并 遵 守 操 作 规 程 穿 戴 合 适 的 保 护 眼 罩 衣 服 和 手 套 反 应 成 分 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) (2 ) µl / 样 本 终 浓 度 25.0 1 正 向 引 物 5.0 50 至 900 nm 反 向 引 物 5.0 50 至 900 nm TaqMan 探 针 5.0 50 至 250 nm cdna 样 本 5.0 10 至 100 ng 无 核 酸 酶 水 5.0 - 总 计 50.0 - 如 果 您 使 用 Primer Express ( 引 物 设 计 ) 软 件 来 设 计 探 针 和 引 物, 必 须 使 用 上 表 列 出 的 体 积, 对 探 针 和 引 物 进 行 优 化, 使 之 符 合 常 用 实 验 分 析 条 件 所 有 Assays-by-Design ( 代 客 设 计 引 物 和 探 针 ) 和 Assays-on-Demand 产 品 的 配 方 已 设 计 好, 使 引 物 和 探 针 的 终 浓 度 在 建 议 值 的 范 围 之 内 22 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
准 备 反 应 板 准 备 反 应 板 1. 在 反 应 板 上 作 上 标 签, 确 保 您 为 每 个 目 标 序 列 包 括 一 组 标 准 样 本 标 准 样 本 必 须 与 目 标 序 列 同 在 一 个 反 应 板 上 2. 向 反 应 板 的 每 个 反 应 孔 中, 加 入 50 µl 的 适 当 PCR 扩 增 预 混 试 剂 : 准 备 包 含 标 准 样 本 的 反 应, 与 准 备 包 含 未 知 样 本 的 反 应 方 法 完 全 相 同 使 用 相 同 的 引 物 和 探 针 PCR 扩 增 预 混 试 剂 和 体 积, 但 向 每 个 标 准 样 本 反 应 孔 中 加 入 已 知 量 的 模 板 ( 如 cdna 或 质 粒 DNA), 而 不 是 加 入 cdna 样 本 3. 将 反 应 板 置 于 冰 上 直 到 您 准 备 好 将 其 装 入 7300/7500 PCR 仪 示 例 试 验 根 据 常 用 实 验 分 析 条 件 准 备 PCR 扩 增 预 混 试 剂 反 应 成 分 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) (2 ) µl / 样 本 a µl / 5 次 反 应 b µl / 37 次 反 应 a. 对 于 六 个 标 准 样 本 的 每 一 个 准 备 一 份 预 混 试 剂 (4 个 重 复 样 本, 包 括 补 充 移 液 损 耗 的 额 外 体 积 ) b. 对 于 所 研 究 的 两 个 分 组 的 每 一 个 准 备 一 份 预 混 试 剂 (36 个 样 本, 包 括 补 充 移 液 损 耗 的 额 外 体 积 ) 终 浓 度 25.0 125.0 925.0 1 正 向 引 物 5.0 25.0 185.0 50 至 900 nm 反 向 引 物 5.0 25.0 185.0 50 至 900 nm TaqMan 探 针 5.0 25.0 185.0 50 至 250 nm cdna 样 本 或 标 准 模 板 5.0 25.0 185.0 10 至 100 ng 无 核 酸 酶 水 5.0 25.0 185.0 - 总 计 50.0 250.0 1850.0 - 在 反 应 板 上 分 布 未 知 样 本 ( 要 确 定 其 量 值 的 目 标 序 列 ) 和 标 准 模 板 将 50 µl 的 适 当 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ( 含 cdna) 加 入 每 个 反 应 孔 中 将 反 应 板 置 于 冰 上, 直 到 您 将 反 应 板 装 入 7300/7500 PCR 仪 RNase P 分 组 1 4 NTC STD 1250 STD 2500 STD 5000 STD 10000 STD 20000 RNase P 分 组 2 GR2341 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 23
第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 概 述 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 储 存 从 绝 对 定 量 程 序 中 收 集 的 单 个 反 应 板 的 数 据 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 也 存 储 有 关 程 序 运 行 的 其 它 信 息, 包 括 样 本 名 和 探 针 运 行 设 置 要 求 对 于 您 创 建 的 每 个 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件, 请 指 定 探 针 标 准 和 探 针 任 务 : 一 个 探 针 虚 拟 地 代 表 一 个 基 因 特 异 性 核 酸 探 针 试 剂, 用 于 执 行 分 析 您 为 每 个 目 标 序 列 指 定 要 使 用 的 探 针 附 录 A 将 说 明 如 何 创 建 探 针 标 准 样 本 是 指 已 知 量 的 目 标 序 列 反 应 板 上 的 每 一 个 目 标 序 列, 必 须 有 一 组 标 准 样 本 探 针 任 务 指 定 软 件 在 分 析 期 间 使 用 从 反 应 孔 中 所 收 集 数 据 的 方 式 您 需 要 为 反 应 板 文 件 的 每 个 反 应 孔 中 的 探 针 指 定 三 项 任 务 中 的 一 项 任 务 符 号 应 用 于 探 针... Unknown ( 未 知 ) 包 含 您 要 确 定 其 量 值 的 目 标 序 列 的 反 应 孔 Standard ( 标 准 ) 包 含 已 知 量 样 本 的 反 应 孔 NTC ( 无 模 板 对 照 ) 包 含 PCR 试 剂, 但 不 含 模 板 的 阴 性 对 照 反 应 孔 24 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 创 建 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 创 建 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 您 可 将 样 本 信 息 输 入 到 一 个 新 的 反 应 板 文 件, 也 可 从 现 有 反 应 板 文 件 中 导 入 样 本 信 息, 或 者 使 用 模 板 文 件 创 建 一 个 新 的 反 应 板 文 件 本 节 描 述 如 何 创 建 一 个 新 的 反 应 板 文 件 有 关 导 入 样 本 信 息 或 使 用 模 板 文 件 的 说 明, 请 参 阅 联 机 帮 助 创 建 新 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 : 1. 依 次 选 择 Start ( 开 始 ) > Programs ( 程 序 ) > Applied Biosystems 7300/7500 ( 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 PCR 仪 ) > Applied Biosystems 7300/7500 SDS Software ( 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 PCR 仪 SDS 软 件 ) ( ), 以 启 动 SDS 软 件 2. 选 择 File ( 文 件 ) > New ( 新 建 ) 3. 在 New Document Wizard ( 新 建 文 件 向 导 ) 窗 口 中, 从 Assay ( 实 验 ) 下 拉 列 表 中 选 择 Absolute Quantification (Standard Curve) ( 绝 对 定 量, 标 准 曲 线 ) 接 受 Container ( 反 应 板 类 型 ) 和 Template ( 模 板 ) 字 段 中 的 默 认 设 置 ( 即 分 别 为 96-Well Clear ( 空 白 96 孔 板 ) 和 Blank Document ( 空 白 反 应 板 )) 重 要! 您 不 能 使 用 相 对 定 量 (RQ) 反 应 板 文 件 执 行 绝 对 定 量 (AQ) 实 验 分 析, 反 之 亦 然 存 储 在 绝 对 定 量 (AQ) 和 相 对 定 量 (RQ) 反 应 板 文 件 中 的 信 息 不 可 互 相 交 换 4. 在 Default Plate Name ( 默 认 反 应 板 名 ) 字 段 中 输 入 反 应 板 文 件 名, 或 接 受 默 认 文 件 名 5. 单 击 Next > ( 下 一 步 >) 6. 选 择 要 添 加 到 反 应 板 文 件 的 探 针 a. 单 击 以 选 择 一 个 探 针 ( 按 住 Ctrl 键 单 击 可 选 择 多 个 探 针 ) 如 果 在 Detector Manager ( 探 针 管 理 器 ) 列 表 中 未 列 出 探 针, 请 按 附 录 A 中 的 指 导 说 明 创 建 探 针 b. 单 击 Add >> ( 添 加 >>) 探 针 即 被 添 加 到 反 应 板 文 件 : 要 从 Document ( 文 件 ) 窗 口 中 的 Detectors ( 探 针 ) 列 表 内 删 除 某 个 探 针, 请 选 择 该 探 针, 然 后 单 击 Remove ( 删 除 ) 6a 6b 6c 4 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 25
第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 c. 单 击 Next > ( 下 一 步 >) 7. 为 每 个 反 应 孔 指 定 探 针 和 任 务 a. 单 击 一 个 反 应 孔 ( 或 对 于 重 复 选 择 一 组 反 应 孔 ) 以 选 取 它 ( 们 ) b. 单 击 探 针 名, 为 反 应 孔 选 定 探 针 c. 单 击 Task ( 任 务 ) 栏 的 下 边, 以 指 定 探 针 任 务 d. 为 包 含 标 准 样 本 的 反 应 孔 输 入 量 值 e. 单 击 Use ( 使 用 ) 所 选 反 应 孔 中 显 示 探 针 任 务 和 颜 色 f. 单 击 Finish ( 完 成 ) SDS 软 件 即 创 建 反 应 板 文 件 7d 7c 7a 8. 输 入 样 本 名 7e 7b 7f a. 单 击 或 选 择 View ( 视 图 ) > Well Inspector ( 反 应 孔 设 定 ) b. 单 击 一 个 反 应 孔 或 拖 动 鼠 标 选 取 多 个 重 复 反 应 孔 c. 输 入 样 本 名 d. 如 果 必 要, 更 改 Passive Reference ( 阳 性 参 比 荧 光 ) 设 置 ( 默 认 情 况 下, 选 择 ROX 荧 光 ) e. 重 复 步 骤 b 至 d, 直 到 您 为 反 应 板 上 的 所 有 反 应 孔 均 指 定 好 样 本 名 和 阳 性 参 比 荧 光 重 要! 如 果 您 的 实 验 不 使 用 反 应 板 上 的 所 有 反 应 孔, 此 步 骤 中 请 不 要 忽 略 任 何 要 使 用 的 反 应 孔 程 序 完 成 后 您 可 以 忽 略 未 使 用 的 反 应 孔 有 关 忽 略 未 使 用 反 应 孔 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 联 机 帮 助 8b 8c 8d 8f : 您 可 在 一 次 运 行 完 成 之 后 更 改 样 本 设 定 信 息 ( 样 本 名 探 针 任 务 ) f. 单 击 ( ) 以 关 闭 Well Inspector ( 反 应 孔 设 定 ) 26 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 创 建 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 9. 在 Setup ( 设 定 ) 选 项 卡 上, 检 查 并 核 对 每 个 反 应 孔 的 信 息 示 例 试 验 在 反 应 板 上 分 布 好 要 确 定 其 量 值 的 目 标 样 本 和 标 准 样 本 每 个 反 应 孔 与 一 个 探 针 关 联 ( 显 示 为 彩 色 方 框 ) 而 且 每 个 反 应 孔 也 指 定 了 一 项 探 针 任 务 - U ( 未 知 ) S ( 标 准 ) 或 N ( 无 模 板 对 照 ) 示 例 实 验 只 定 义 了 一 个 探 针 ( 名 为 RNase P), 因 为 只 需 对 单 一 基 因 进 行 定 量 研 究 下 图 显 示 了 为 每 个 反 应 孔 指 定 好 样 本 名 探 针 和 探 针 任 务 之 后 的 示 例 实 验 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 样 本 名 ( 此 处 1 表 示 分 组, 4 表 示 从 中 提 取 样 本 的 个 体 ) 探 针 任 务 和 颜 色 4 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 27
第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 指 定 热 循 环 条 件 并 开 始 运 行 反 应 板 指 定 热 循 环 条 件 并 开 始 运 行 反 应 板 PCR 扩 增 的 默 认 热 循 环 条 件 如 果 您 选 择 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT- PCR) 执 行 绝 对 定 量 实 验 ( 建 议 采 用 此 方 法 ), 至 此 您 已 完 成 反 转 录 (RT) 步 骤 在 工 作 流 程 的 此 位 置, 您 已 准 备 好 对 cdna 执 行 PCR 扩 增 此 实 验 分 析 法 的 PCR 步 骤 的 默 认 热 循 环 条 件 ( 如 下 表 所 示 ) 应 显 示 在 Instrument ( 仪 器 ) 选 项 卡 上 时 间 和 温 度 ( 两 步 法 RT-PCR) 1) 反 转 录 (RT) 步 骤 2) PCR 扩 增 步 骤 保 持 保 持 * 仅 供 参 考 此 时 反 转 录 (RT) 已 完 成 10 分 @ 25 C 120 分 @ 37 C AmpErase UNG 活 化 初 始 步 骤 PCR 扩 增 (40 个 循 环 的 每 个 循 环 ) AmpliTaq Gold DNA 聚 合 酶 活 化 融 解 保 持 保 持 循 环 退 火 / 延 伸 2 分 @ 50 C 10 分 @ 95 C 15 秒 @ 95 C 1 分 @ 60 C 一 步 法 RT-PCR 热 循 环 条 件 如 果 您 选 择 一 步 法 RT-PCR 实 验 分 析 法, 则 cdna 的 生 成 和 扩 增 在 工 作 流 程 的 此 位 置 同 时 进 行 下 表 显 示 一 步 法 RT-PCR 实 验 的 热 循 环 条 件 反 转 录 时 间 和 温 度 ( 一 步 法 RT-PCR) 初 始 步 骤 PCR 扩 增 (40 个 循 环 的 每 个 循 环 ) AmpliTaq Gold DNA 聚 合 酶 活 化 融 解 保 持 保 持 循 环 退 火 / 延 伸 30 分 @ 48 C 10 分 @ 95 C 15 秒 @ 95 C 1 分 @ 60 C 28 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
指 定 热 循 环 条 件 并 开 始 运 行 反 应 板 一 步 法 RT-PCR 热 循 环 条 件 指 定 热 循 环 条 件 并 开 始 运 行 反 应 板 : 1. 选 择 Instrument ( 仪 器 ) 选 项 卡 默 认 情 况 下, 显 示 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 方 法 中 PCR 步 骤 的 标 准 PCR 条 件 2. 验 证 以 下 各 项 : 如 果 您 使 用 两 步 法 RT-PCR 则 已 设 置 默 认 的 PCR 热 循 环 条 件 如 果 您 使 用 一 步 法 RT-PCR 请 按 照 第 28 页 一 步 法 RT-PCR 热 循 环 条 件 中 的 说 明 设 置 各 项 热 循 环 参 数 Sample Volume ( 样 本 体 积 ) 为 50 µl 9600 Emulation (9600 仿 真 ) 选 项 选 取 : 如 果 您 使 用 SYBR Green I 化 学 荧 光 试 剂, 而 且 您 希 望 确 定 是 否 存 在 污 染 或 您 想 确 定 熔 解 温 度, 请 单 击 Add Dissociation Stage ( 添 加 熔 解 步 骤 ) 有 关 详 情, 请 参 阅 联 机 帮 助 : 在 7300 PCR 仪 上 不 提 供 9600 Emulation (9600 仿 真 ) 功 能 3. 选 择 File ( 文 件 )> Save As ( 另 存 为 ), 为 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 输 入 一 个 文 件 名, 然 后 单 击 Save ( 保 存 ) 4. 将 反 应 板 装 入 仪 器 中 : 反 应 孔 A1 位 于 仪 器 托 盘 的 左 上 角 反 应 孔 A1 12 键 控 角 4 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 29
第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 指 定 热 循 环 条 件 并 开 始 运 行 反 应 板 5. 单 击 Start ( 开 始 ) 在 仪 器 运 行 PCR 程 序 期 间, Instrument ( 仪 器 ) 选 项 卡 上 会 显 示 实 时 状 态 信 息, 并 报 告 荧 光 信 号 强 度 程 序 运 行 结 束 后, 状 态 值 和 按 钮 变 为 灰 色, 而 且 Analysis ( 分 析 ) 按 钮 ( ) 变 为 可 用 状 态, 并 显 示 信 息 提 示 您 程 序 是 否 成 功 运 行 程 序 运 行 期 间 生 成 的 所 有 数 据 都 保 存 到 您 在 步 骤 3 中 指 定 的 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 中 30 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
Primer Extended on mrna 5 3 Reverse Primer 5 cdna Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 工 作 流 程 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 设 计 绝 对 定 量 实 验 设 置 分 析 参 数 参 阅 第 32 页 执 行 反 转 录 调 整 基 线 和 阈 值 参 阅 第 33 页 分 析 并 查 看 结 果 参 阅 第 39 页 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 需 要 时 忽 略 样 本 参 阅 第 44 页 分 析 绝 对 定 量 数 据 需 要 时 导 出 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 参 阅 第 45 页 5 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 31
第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 设 置 分 析 参 数 设 置 分 析 参 数 在 您 可 以 分 析 数 据 之 前, 必 须 先 指 定 各 项 分 析 参 数 值 除 非 您 已 为 您 的 实 验 确 定 了 最 佳 基 线 和 阈 值 设 置, 否 则 您 可 使 用 SDS 软 件 的 自 动 生 成 基 线 和 阈 值 (Auto Ct) 功 能 来 确 定 基 线 和 阈 值 如 果 程 序 能 够 为 每 个 反 应 孔 正 确 地 调 用 基 线 和 阈 值, 您 便 可 继 续 进 行 查 看 结 果 否 则, 您 必 须 手 动 设 置 基 线 和 阈 值, 有 关 指 导, 请 参 阅 第 33 页 手 动 确 定 基 线 和 阈 值 本 节 描 述 如 何 使 用 Auto Ct ( 自 动 Ct) 功 能 指 定 分 析 设 置 : 1. 单 击 或 选 择 Analysis ( 分 析 ) > Analysis Settings ( 分 析 设 置 ) 2. 从 Detector ( 探 针 ) 下 拉 列 表 中, 选 择 All ( 全 部 ) 3. 选 择 Auto Ct ( 自 动 Ct) SDS 软 件 将 自 动 为 每 个 反 应 孔 生 成 基 线 和 阈 值 2 3 重 要! 分 析 完 毕 后, 您 必 须 验 证 每 个 反 应 孔 的 基 线 和 阈 值 是 否 已 被 正 确 调 用, 如 第 33 页 调 整 基 线 和 阈 值 所 述 或 者, 您 也 可 选 择 Manual Ct ( 手 动 Ct), 以 手 动 指 定 阈 值 和 基 线 值 4. 选 择 Use System Calibrator ( 使 用 系 统 校 正 器 ) 以 使 用 存 储 在 计 算 机 中 的 校 正 文 件 ( 背 景 和 纯 荧 光 ), 而 不 使 用 存 储 在 反 应 板 文 件 内 的 校 正 信 息 有 关 系 统 校 正 文 件 的 详 细 说 明, 请 参 阅 联 机 帮 助 4 5 5. 单 击 OK & Reanalyze ( 确 定 并 再 次 分 析 ) 按 钮 6. 检 查 扩 增 图 谱 ; 如 果 必 要, 按 以 下 部 分 的 说 明 手 动 调 整 基 线 和 阈 值 32 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
调 整 基 线 和 阈 值 自 动 确 定 基 线 和 阈 值 调 整 基 线 和 阈 值 自 动 确 定 基 线 和 阈 值 SDS 软 件 的 C t 功 能, 根 据 数 据 显 示 的 典 型 扩 增 曲 线 为 探 针 计 算 基 线 和 阈 值 典 型 扩 增 曲 线 包 括 : 平 台 期 (a) 线 性 增 长 期 (b) 指 数 增 长 期 (c) 背 景 (d) 基 线 (e) R n 阈 值 a b c d 实 验 性 错 误 ( 如 污 染 移 液 错 误 等 ) 可 能 会 产 生 与 典 型 扩 增 曲 线 数 据 偏 差 极 大 的 数 据 这 种 非 典 型 数 据 可 能 会 导 致 软 件 算 法 为 相 关 联 的 探 针 生 成 不 正 确 的 基 线 和 阈 值 因 此, 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 建 议 您 在 分 析 研 究 数 据 后 复 查 所 有 基 线 和 阈 值 参 数 值 如 有 必 要, 手 动 调 整 这 些 值, 如 第 36 页 所 述 循 环 e 手 动 确 定 基 线 和 阈 值 如 果 您 为 研 究 中 的 任 何 探 针 以 手 动 方 式 设 置 基 线 和 阈 值, 必 须 为 每 个 探 针 执 行 第 36 页 所 述 的 步 骤 以 下 扩 增 图 谱 显 示 不 同 基 线 和 阈 值 设 置 值 产 生 的 效 果 5 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 33
第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 调 整 基 线 和 阈 值 基 线 正 确 设 置 扩 增 曲 线 从 最 大 基 线 之 后 开 始 不 需 要 进 行 调 整 基 线 设 置 太 低 扩 增 曲 线 从 远 离 最 大 基 线 的 右 侧 位 置 开 始 应 增 大 End Cycle ( 结 束 循 环 ) 的 值 基 线 设 置 太 高 扩 增 曲 线 从 最 大 基 线 之 前 开 始 应 减 小 End Cycle ( 结 束 循 环 ) 的 值 34 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
调 整 基 线 和 阈 值 手 动 确 定 基 线 和 阈 值 阈 值 正 确 设 置 阈 值 设 置 在 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 之 内 高 于 或 低 于 最 优 化 值 的 阈 值 设 置 将 会 增 大 重 复 组 的 标 准 偏 差 阈 值 设 置 太 低 阈 值 设 置 在 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 之 下 其 标 准 偏 差 远 高 于 正 确 设 置 阈 值 时 图 谱 的 标 准 偏 差 向 上 拖 动 阈 值 条, 使 之 处 于 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 内 阈 值 设 置 太 高 阈 值 设 置 在 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 之 上 其 标 准 偏 差 远 高 于 正 确 设 置 阈 值 时 图 谱 的 标 准 偏 差 向 下 拖 动 阈 值 条, 使 之 处 于 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 内 5 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 35
第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 调 整 基 线 和 阈 值 1 3 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 5a 5b 4a 4b 2 手 动 调 整 基 线 和 阈 值 : 1. 选 择 Amplification Plot ( 扩 增 图 谱 ) 选 项 卡, 然 后 从 Data ( 数 据 ) 下 拉 列 表 中 选 择 Delta Rn vs Cycle ( Rn 随 循 环 变 化 ) 2. 选 择 要 在 图 谱 上 显 示 的 反 应 孔 ( 如 果 不 作 选 择, 图 谱 将 显 示 为 空 白 ) 3. 从 Detector ( 探 针 ) 下 拉 列 表 中, 选 择 一 个 探 针 SDS 软 件 显 示 所 选 探 针 和 反 应 孔 的 图 谱 36 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
调 整 基 线 和 阈 值 手 动 确 定 基 线 和 阈 值 4. 为 探 针 设 置 基 线 a. 在 Analysis Settings ( 分 析 设 置 ) 下 边, 选 择 Manual Baseline ( 手 动 设 置 基 线 ) b. 在 Start (cycle) ( 开 始 循 环 ) 和 End (cycle) ( 结 束 循 环 ) 字 段 中 输 入 相 应 的 值, 确 保 扩 增 曲 线 的 增 长 从 End Cycle ( 结 束 循 环 ) 值 之 后 的 一 个 循 环 处 开 始 : 在 您 更 改 某 个 探 针 的 基 线 和 阈 值 设 置 之 后, Analyze ( 执 行 分 析 ) 按 钮 ( ) 变 为 可 用 状 态, 指 示 您 必 须 重 新 分 析 数 据 5. 为 探 针 设 置 阈 值 a. 在 Analysis Settings ( 分 析 设 置 ) 下 边, 选 择 Manual Ct ( 手 动 Ct) b. 用 鼠 标 拖 动 阈 值 设 置 条, 直 到 阈 值 位 于 : 背 景 的 上 边 扩 增 曲 线 的 平 台 期 和 线 性 增 长 期 的 下 边 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 之 内 SDS 软 件 调 整 阈 值, 并 于 分 析 之 后 在 Threshold ( 阈 值 ) 字 段 中 显 示 此 值 6. 重 复 步 骤 3 至 4, 为 实 验 分 析 中 的 所 有 剩 余 探 针 设 置 适 当 的 基 线 和 阈 值 7. 单 击 Analysis ( 分 析 ) > Analyze ( 执 行 分 析 ), 以 使 用 调 整 后 的 基 线 和 阈 值 设 置 重 新 分 析 数 据 用 鼠 标 拖 动 阈 值 条, 以 调 整 阈 值 设 置 阈 值 条 变 为 红 色, 表 示 已 更 改 阈 值 更 改 基 线 或 阈 值 之 后, Analyze ( 执 行 分 析 ) 按 钮 变 为 可 用 状 态 5 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 37
第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 调 整 基 线 和 阈 值 示 例 试 验 数 据 首 先 使 用 Auto Ct ( 自 动 Ct) 和 Auto Baseline ( 自 动 基 线 ) 设 置 进 行 分 析, 生 成 以 下 扩 增 图 谱 通 过 放 大 检 视, 似 乎 基 线 和 阈 值 已 被 正 确 调 用 而 无 需 进 行 调 整 扩 增 曲 线 从 最 大 基 线 之 后 开 始 阈 值 设 置 在 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 之 内 38 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据 关 于 Results ( 结 果 ) 选 项 卡 分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据 关 于 Results ( 结 果 ) 选 项 卡 在 Results ( 结 果 ) 选 项 卡 上, 您 可 查 看 到 扩 增 程 序 的 结 果, 并 可 更 改 参 数 例 如, 您 可 忽 略 一 些 样 本, 或 手 动 设 置 基 线 和 阈 值 如 果 您 更 改 任 何 参 数, 应 重 新 分 析 数 据 Results ( 结 果 ) 选 项 卡 上 包 括 7 个 二 级 选 项 卡, 分 别 描 述 如 下 有 关 各 选 项 卡 的 详 细 说 明, 请 参 阅 联 机 帮 助 要 在 不 同 的 视 图 之 间 移 动, 单 击 选 项 卡 要 选 择 反 应 板 上 的 所 有 96 个 反 应 孔, 单 击 反 应 板 的 左 上 角 要 调 整 图 形 设 置, 双 击 图 谱 的 y 轴 或 x 轴 以 显 示 Graph Settings ( 图 形 设 置 ) 对 话 框 可 调 整 的 设 置 取 决 于 您 正 查 看 的 图 谱 5 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 39
第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据 Plate ( 反 应 板 ) 选 项 卡 显 示 每 个 反 应 孔 的 结 果 数 据, 包 括 : 每 个 反 应 孔 的 样 本 名 探 针 任 务 和 颜 色 计 算 值 - 量 值 ( 默 认 值 ) Rn 或 Ct 选 择 Analysis ( 分 析 ) > Display ( 显 示 ) 以 选 择 要 显 示 的 值 Spectra ( 光 谱 ) 选 项 卡 显 示 所 选 反 应 孔 的 荧 光 光 谱 用 鼠 标 指 针 点 击 并 拖 动 Cycle ( 循 环 ) 滑 块 上 的 指 示 器, 可 查 看 每 一 循 环 的 光 谱 Cycle # ( 循 环 次 数 ) 文 本 框 中 显 示 滑 块 指 示 器 的 当 前 位 置 Component ( 成 分 ) 选 项 卡 显 示 整 个 PCR 运 行 期 间 所 选 反 应 孔 的 每 种 荧 光 的 完 整 光 谱 表 现 每 次 只 能 显 示 第 一 个 选 取 的 反 应 孔 : 如 果 您 使 用 TaqMan 产 品, 则 在 Component ( 成 分 ) 选 项 卡 上 会 显 示 三 个 成 分 (ROX 荧 光 报 告 基 团 和 TAMRA 淬 灭 荧 光 ), 如 右 图 所 示 如 果 您 使 用 TaqMan MGB 产 品, 则 只 显 示 两 个 成 分 (ROX 和 报 告 基 团 ) 40 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据 Amplification Plot ( 扩 增 图 谱 ) 选 项 卡 Amplification Plot ( 扩 增 图 谱 ) 选 项 卡 在 三 个 Amplification Plot ( 扩 增 图 谱 ) 上, 您 可 查 看 特 定 样 本 的 扩 增 后 荧 光 信 号 读 取 情 况 Amplification Plot ( 扩 增 图 谱 ) 上 显 示 所 选 反 应 孔 中 的 所 有 样 本 Rn vs. Cycle (Linear) (Rn 随 循 环 变 化, 线 性 ) 视 图 显 示 校 正 后 报 告 荧 光 强 度 (R n ) 荧 光 随 循 环 变 化 的 曲 线 您 可 通 过 此 图 来 识 别 和 检 查 不 规 则 扩 增 有 关 校 正 后 报 告 荧 光 强 度 (R n ) 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 SDS 化 学 指 南 Rn vs.cycle (Log) ( Rn 随 循 环 变 化, 对 数 ) 视 图 显 示 荧 光 ( R n ) 随 循 环 数 变 化 的 曲 线 您 可 通 过 此 图 来 识 别 和 检 查 不 规 则 扩 增, 也 可 手 动 设 置 运 行 程 序 的 阈 值 和 基 线 参 数 Ct vs. Well Position (Ct 值 与 反 应 孔 位 置 关 系 ) 视 图 显 示 阈 值 循 环 (C T ) 与 反 应 孔 位 置 的 关 系 变 化 图 您 可 通 过 此 图 查 找 探 针 数 据 设 置 中 不 当 设 置 的 极 端 值 ( 有 关 详 情, 请 参 阅 第 44 页 忽 略 样 本 ) 5 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 41
第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据 Standard Curve ( 标 准 曲 线 ) 显 示 指 定 为 标 准 的 样 本 标 准 曲 线 SDS 软 件 根 据 此 标 准 曲 线 推 断 并 计 算 出 未 知 样 本 的 量 Dissociation ( 熔 解 ) 显 示 与 熔 解 分 析 相 关 的 融 解 (T m ) 曲 线 当 使 用 SYBR Green 产 品 时, 在 以 下 任 一 情 况 下 会 显 示 此 项 数 据 : 在 Instrument ( 仪 器 ) 选 项 卡 上 选 择 了 Dissociation Protocol ( 熔 解 实 验 方 案 ) 选 择 Dissociation ( 熔 解 ) 作 为 实 验 分 析 类 型 附 录 C 和 联 机 帮 助 中 均 提 供 了 有 关 熔 解 曲 线 分 析 的 详 细 说 明 Report ( 报 告 ) 以 表 格 方 式 显 示 所 选 反 应 孔 的 数 据 报 告 中 的 数 据 栏 取 决 于 正 运 行 的 实 验 分 析 类 型 对 于 绝 对 定 量 实 验 分 析, 可 能 包 括 以 下 数 据 栏 :Well ( 反 应 孔 ) Sample Name ( 样 本 名 ) Detector ( 探 针 ) Task ( 任 务 ) Ct StdDev Ct (Ct 值 标 准 偏 差 ) Qty( 数 量 ) Mean Qty( 平 均 数 量 ) 和 StdDev Qty ( 标 准 偏 差 数 量 ) Qty ( 数 量 ) 栏 中 的 值 根 据 样 本 的 标 准 曲 线 推 断 并 计 算 得 出 在 Report Settings ( 报 告 设 置 ) 对 话 框 中 可 设 置 报 告 显 示 格 式 和 报 告 打 印 方 式 有 关 此 对 话 框 的 详 细 说 明, 请 参 阅 联 机 帮 助 42 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据 Report ( 报 告 ) 示 例 试 验 在 两 个 研 究 的 分 组 中, RNase P ( 核 糖 核 酸 酶 P) 的 数 量 ( 如 Plate ( 反 应 板 ) 和 Report ( 报 告 ) 选 项 卡 上 所 显 示 ) 分 别 是 : 分 组 1 中 为 5000 ; 分 组 2 中 为 10000 5 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 43
第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 忽 略 样 本 忽 略 样 本 实 验 性 错 误 可 能 会 导 致 某 些 反 应 孔 扩 增 不 充 分 或 根 本 不 扩 增 这 些 反 应 孔 一 般 会 产 生 与 关 联 重 复 反 应 孔 的 平 均 C T 值 相 比 显 著 不 同 的 值 如 果 在 计 算 中 包 括 这 些 偏 差 值 ( 异 常 值 ), 则 会 得 出 错 误 的 测 量 结 果 为 确 保 精 确 度, 应 认 真 查 看 重 复 组 以 发 现 可 能 的 异 常 值 使 用 C T vs. Well Position (Ct 值 与 反 应 孔 位 置 关 系 ) 扩 增 图 谱, 您 可 手 动 删 除 异 常 值 删 除 异 常 值 : 1. 选 择 Amplification Plot ( 扩 增 图 谱 ) 选 项 卡 2. 从 Data ( 数 据 ) 下 拉 列 表 中, 选 择 Ct vs. Well Position (Ct 值 与 反 应 孔 位 置 关 系 ) 异 常 值 3. 选 择 要 检 查 的 反 应 孔, 然 后 通 过 比 较 不 同 分 组 的 C T 值, 验 证 每 个 重 复 分 组 值 的 一 致 性 4. 如 果 发 现 异 常 值, 选 择 View ( 视 图 ) > Well Inspector ( 反 应 孔 设 定 ), 然 后 选 择 相 应 反 应 孔 的 Omit ( 忽 略 ) 复 选 框 图 谱 中 显 示 的 异 常 值 选 择 Omit Well ( 忽 略 反 应 孔 ) 复 选 框 忽 略 的 反 应 孔 被 排 除 并 标 上 叉 号 44 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
导 出 绝 对 定 量 反 应 板 数 据 Report ( 报 告 ) 5. 单 击 或 选 择 Analysis ( 分 析 ) > Analyze ( 执 行 分 析 ), 在 排 除 异 常 数 据 的 情 况 下 再 次 分 析 数 据 异 常 值 已 被 排 除 6. 对 您 想 筛 选 的 其 它 反 应 孔 重 复 步 骤 3 至 5 导 出 绝 对 定 量 反 应 板 数 据 您 可 将 绝 对 定 量 反 应 板 中 的 数 值 数 据 导 出 为 文 本 文 件, 然 后 可 将 数 据 导 入 诸 如 Microsoft Excel 的 电 子 表 格 程 序 软 件 1. 选 择 File ( 文 件 ) > Export ( 导 出 ), 然 后 选 择 要 导 出 的 数 据 类 型 Sample Setup ( 样 本 设 定 ) (*.txt) Calibration Data ( 校 正 数 据 ) (*.csv) Spectra ( 光 谱 ) (*.csv) Component ( 成 分 ) (*.csv) Delta Rn ( 校 正 后 报 告 荧 光 强 度 ) (*.csv) Ct ( 阈 值 循 环 ) (*.csv) Dissociation ( 熔 解 ) (*.csv) 有 关 导 出 文 件 类 型 的 说 明, 请 参 阅 联 机 帮 助 2. 为 要 导 出 的 文 件 输 入 一 个 文 件 名 3. 单 击 Save ( 保 存 ) 5 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 45
第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 导 出 绝 对 定 量 反 应 板 数 据 46 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
创 建 探 针 A 在 您 使 用 反 应 板 文 件 运 行 反 应 板 之 前, 需 要 创 建 探 针 并 将 其 应 用 到 反 应 板 上 的 所 有 样 本 一 个 探 针 虚 拟 地 代 表 一 个 基 因 或 等 位 基 因 特 异 性 核 酸 探 针 试 剂, 用 于 在 仪 器 中 执 行 分 析 创 建 探 针 : 1. 选 择 Tools ( 工 具 ) > Detector Manager ( 探 针 管 理 器 ) : 必 须 先 打 开 一 个 反 应 板 文 件 ( 任 何 类 型 ), 然 后 您 才 能 访 问 Tools ( 工 具 ) 菜 单 2. 在 Detector Manager ( 探 针 管 理 器 ) 中, 选 择 File ( 文 件 ) > New ( 新 建 ) 2 3. 在 New Detector ( 新 建 探 针 ) 对 话 框 中, 为 探 针 输 入 一 个 名 称 重 要! 探 针 名 称 必 须 是 唯 一 的, 应 能 反 映 出 分 析 的 目 标 基 因 座 ( 如 GAPDH ( 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 ) 或 RNase P ( 核 糖 核 酸 酶 P)) 不 要 为 多 个 探 针 使 用 同 一 个 名 称 4. 另 外, 单 击 Description ( 描 述 ) 字 段, 也 可 为 探 针 输 入 一 个 简 短 的 描 述 3 4 5 6 7 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 47
附 录 A 5. 在 Reporter Dye ( 报 告 基 团 ) 和 Quencher Dye ( 淬 灭 基 团 ) 下 拉 列 表 中, 为 探 针 选 择 适 当 的 荧 光 : 在 Reporter Dye ( 报 告 基 团 ) 和 Quencher Dye ( 淬 灭 基 团 ) 下 拉 列 表 中 显 示 的 荧 光, 是 此 前 您 使 用 Dye Manager ( 荧 光 管 理 器 ) 输 入 的 荧 光 如 果 您 想 使 用 的 荧 光 并 未 显 示 在 下 拉 列 表 中, 请 使 用 Dye Manager ( 荧 光 管 理 器 ) 添 加 该 荧 光, 然 后 返 回 此 过 程 的 此 步 骤 有 关 详 情, 请 参 阅 联 机 帮 助 : 选 择 TAMRA 作 为 TaqMan 探 针 的 淬 灭 基 团, 为 TaqMan MGB 探 针 选 择 None ( 无 ) 6. 单 击 Color ( 颜 色 ) 框, 在 Color ( 颜 色 ) 对 话 框 中 选 择 一 种 颜 色 来 代 表 探 针, 然 后 单 击 OK ( 确 定 ) 7. 此 外, 也 可 单 击 Notes ( ) 字 段, 然 后 输 入 对 该 探 针 的 任 何 附 加 说 明 8. 单 击 OK ( 确 定 ) 以 保 存 探 针, 并 返 回 Detector Manager ( 探 针 管 理 器 ) 窗 口 9. 重 复 步 骤 2 至 8, 创 建 剩 余 的 探 针 10. 添 加 完 探 针 后, 在 Detector Manager ( 探 针 管 理 器 ) 窗 口 中, 单 击 Done ( 完 成 ) 示 例 试 验 在 绝 对 定 量 示 例 实 验 中, 为 实 验 分 析 中 要 确 定 量 值 的 一 个 目 标 创 建 了 一 个 探 针 此 探 针 命 名 为 RNase P 并 指 定 用 蓝 色 根 据 常 规, 所 用 探 针 是 由 FAM 标 记 的 TaqMan MGB 探 针 TaqMan MGB 探 针 包 含 不 发 荧 光 的 淬 灭 基 团 在 对 两 个 或 更 多 个 目 标 进 行 定 量 检 测 的 绝 对 定 量 实 验 中, 应 为 每 个 目 标 创 建 一 个 探 针 : 随 Assays-on-Demand 产 品 提 供 了 一 个 分 析 信 息 文 件 (AIF) 此 文 本 文 件 包 含 您 订 购 的 实 验 分 析 信 息, 包 括 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 的 实 验 分 析 代 码 每 个 实 验 分 析 的 反 应 孔 定 位 引 物 浓 度 以 及 引 物 序 列 此 文 件 也 列 出 了 每 种 实 验 分 析 中 使 用 的 报 告 基 团 和 淬 灭 基 团 ( 若 适 用 ) 当 您 创 建 探 针 时, 可 使 用 报 告 基 团 和 淬 灭 荧 光 信 息 ( 也 可 使 用 基 因 名 或 样 本 名 符 号 ) 您 可 在 诸 如 Microsoft Excel 的 电 子 表 格 程 序 中 查 看 AIF 文 件 的 内 容 48 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
生 成 标 准 曲 线 指 南 B 使 用 7300/7500 PCR 仪 执 行 绝 对 定 量 实 验 分 析, 对 标 准 样 本 的 绝 对 定 量 需 要 通 过 某 些 独 立 方 式 来 确 定 通 常 使 用 质 粒 DNA 或 体 外 转 录 RNA 来 准 备 绝 对 标 准 样 本 通 过 A 260 测 量 浓 度, 并 使 用 DNA 或 RNA 的 分 子 量 转 化 达 到 重 复 数 为 确 保 正 确 使 用 绝 对 定 量 标 准 曲 线, 应 考 虑 以 下 要 点 : 标 准 DNA 或 RNA 必 须 为 单 一 的 纯 种 DNA 或 RNA 例 如, 从 E. coli ( 大 肠 杆 菌 ) 制 备 的 质 粒 DNA 通 常 已 受 RNA 污 染, 会 增 大 A 260 的 测 量 值, 并 夸 大 所 确 定 的 质 粒 重 复 数 需 采 用 精 确 的 移 液 吸 取 和 滴 入 操 作, 因 为 标 准 样 本 必 须 经 过 几 个 量 级 的 稀 释 必 须 对 质 粒 DNA 或 体 外 转 录 RNA 进 行 浓 缩, 以 便 测 量 精 确 的 A 260 值 浓 缩 的 DNA 或 RNA 必 须 稀 释 10 6 至 10 12 倍, 使 其 浓 度 与 生 物 样 本 中 目 标 的 浓 度 相 似 必 须 考 虑 对 稀 释 后 的 标 准 样 本 进 行 稳 定 处 理, 特 别 对 于 RNA 尤 其 重 要 将 稀 释 后 的 标 准 样 本 等 分 为 几 份, 贮 存 在 80 C 温 度 下, 在 使 用 前 只 解 冻 一 次 Collins 等 科 学 家 通 过 努 力, 探 索 出 了 生 成 高 置 信 度 标 准 样 本 的 方 法 1995 年, 他 在 一 份 报 告 中 介 绍 了 他 在 病 毒 定 量 分 析 中 开 发 绝 对 定 量 RNA 标 准 样 本 的 步 骤 一 般 而 言, 不 可 能 使 用 DNA 作 为 RNA 绝 对 定 量 分 析 的 标 准 样 本, 因 为 尚 无 有 效 的 对 照 来 执 行 反 转 录 步 骤 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 49