荧 光 PCR 原 理 及 应 用 周 煜 ZHOU Yu Application Specialist cnmcbsupport@appliedbiosystems.com
ABI 公 司 及 其 荧 光 PCR 仪 器
美 国 ABI 公 司 荧 光 定 量 PCR 仪 发 展 历 史 1995- 世 界 上 第 一 台 定 量 PCR 仪 7700 型 1997- 向 医 院 用 户 推 出 5700 型 定 量 PCR 仪 2000- 推 出 7900 型 384 孔 荧 光 定 量 PCR 仪 } 公 认 最 高 端 定 量 PCR 仪 2001-7900 型 96 孔 荧 光 定 量 PCR 仪 2001- 推 出 7000 型 荧 光 定 量 PCR 仪 取 得 巨 大 成 功 2003- 获 得 了 荧 光 定 量 PCR 仪 专 利 - 确 立 ABI 在 业 界 内 的 独 特 地 位 2004- 第 3 代 荧 光 定 量 PCR 仪 7300 和 7500 型 2007- 第 4 代 荧 光 定 量 PCR 仪 StepOne 和 StepOnePlus 3
ABI 公 司 荧 光 PCR 仪 器 4
ABI 公 司 荧 光 PCR 仪 器 Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System 5
各 种 荧 光 PCR 仪 器 6
荧 光 PCR 的 化 学
两 种 荧 光 化 学 原 理 Fluorogenic 5 Nuclease Assay An established and proven chemistry for high specificity nucleic acid real-time quantitation The introduction of TaqMan MGB (Minor Groove Binder) probes has produced a turn-key homogeneous chemistry for the detection of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) SYBR Green 1 Double Stranded DNA Binding Dye Assay Ideal for target identification (screening) assays A lower-cost alternative when high specificity is not required 8
TaqMan 探 针 5 3 5 3 3 5 Excitation Excitation R Q Q R R 3 5 9
TaqMan MGB 探 针 R (non-fluorescent quencher) NFQ Q AGGCCTTGAGAGATAT Q MGB (minor groove binder) 提 高 探 针 Tm 值 R AGGCCTTGAGAGATAT Q GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC R 报 告 荧 光 NFQ 无 荧 光 淬 灭 基 团 MGB 小 沟 结 合 物 10
MGB 探 针 的 优 点 提 高 淬 灭 效 率 减 少 背 景 提 高 信 噪 比 提 高 探 针 Tm 值 长 15 碱 基, 提 高 18 C 缩 短 探 针 长 度 最 佳 范 围 13-21 碱 基 11
TaqMan MGB 探 针 鉴 别 等 位 基 因 FAM MGB NFQ Q R 5 3 MGB 分 辨 1 个 碱 基 的 精 确 度 完 全 配 对, 有 信 号 FAM MGB 一 个 碱 基 不 配 对, 没 有 信 号 12
SYBR Green 染 料 SYBR Green I 与 dsdna 结 合 与 DNA 结 合 时 游 离 时 光 13
融 解 曲 线 (Dissociation curve) Easily check for specificity of your SYBR assays immediately after PCR Thermal conditions (after last cycle of PCR): Hold at 95 C for 20 sec Hold at 60 C for 20 sec Ramp and collect fluorescent data to 95 C over course of 20 minutes Software automatically generates melt curve profiles 14
融 解 曲 线 (Dissociation curve) 原 始 图 谱 导 数 图 谱 15
高 分 辨 溶 解 曲 线 (HRM, High Resolution Melting ) Different from a regular SYBR Green dye melt curve: Chemistry: Saturating and brighter dsdna binding dyes LCGreen EvaGreen TM SYTO 9 Instrument: More data points are collected Software: New fluorescent normalization algorithms and plots 16
Now can be performed on the ABI 7500 Fast System The analysis is based on the difference in curve shape as well as Tm. HRM can identify mutations that cause Tm changes as minor as 0.1 C. 17
染 料 法 的 特 点 成 本 低 兼 容 熔 解 曲 线 特 异 性 问 题 不 能 进 行 多 重 扩 增 18
荧 光 PCR 的 防 污 染 技 术 Uracil N-glycosylase Chemical method to destroy contaminating amplicons. U U All amplification chemistries use dutp. U U UNG does not function above 55 o C 19
荧 光 参 比 - Passive Reference Dye: ROX ROX 以 固 定 的 浓 度 配 在 Master Mix 中, 不 参 与 PCR 扩 增 ROX 的 功 能 : Improves precision. Compensates for small fluorescent fluctuations that can occur from well-to-well Can be useful for diagnosing troubles Rn = Normalization = Reporter / Reference Reporter Reference 20
ROX Normalizer 36 Replicates analyzed with ROX passive reference dye 36 Replicates analyzed without ROX passive reference dye 21
定 量 PCR 的 数 学 原 理
实 时 定 量 与 终 点 定 量 终 点 处 产 物 量 不 恒 定 Ct 值 则 极 具 重 现 性! 23
PCR 动 力 学 曲 线 和 四 个 阶 段 线 性 图 谱 平 台 期 线 性 增 长 期 指 数 增 长 期 基 线 期 平 台 期 线 性 增 长 期 指 数 增 长 期 基 线 期 对 数 图 谱 24
什 么 是 CT 值? 荧 光 信 号 穿 过 阈 值 线 时 的 循 环 次 数 -threshold cycle 线 性 图 谱 对 数 图 谱 C T 值 C T 值 25
PCR 扩 增 的 数 学 模 型 扩 增 产 物 的 总 数 量 可 以 下 式 表 示 : Y n =X (1+E) n Y n 为 PCR 产 物 的 分 子 数 量 n 为 周 期 数 E 为 扩 增 效 率 (0<E<1) 理 想 条 件 下 浓 度 增 加 1 倍 - CT 值 减 小 1 个 单 位 浓 度 增 加 10 倍 - CT 值 减 小 3.3219280 26
斜 率 与 截 距 CT = - k lgx0 + b Slope=-1/log(1+E) If E=1, Slope= -3.3219280 Normally, slope is about -3.5~-4.2 Intercept Normally, intercept is about 30~40 27
C T 值 对 [DNA] 0 作 图 C T 值 C T = - k lgx 0 + b lg [ 起 始 DNA] 28
成 功 的 定 量 PCR 数 据 29
实 时 荧 光 PCR 技 术 的 主 要 优 点 可 进 行 定 量 PCR 检 测, 定 量 范 围 (Dynamic Range) 宽 ; 操 作 方 便 - 无 复 杂 的 PCR 后 分 析 步 骤 ; 全 封 闭 式 检 测 - 减 少 污 染 ; 检 测 灵 敏 度 及 特 异 性 高 ; 多 通 道 分 析 ; 熔 点 曲 线 分 析 (Dissociation curve) 30
荧 光 PCR 技 术 的 应 用
主 要 应 用 Real time Quantitative PCR End point Plus/minus Assays + + - + Allele Discrimination 32
定 量 PCR - Quantitative PCR How many? 绝 对 定 量 Absolute Quantitation How much? 相 对 定 量 Relative Quantitation 33
Results from RNase P Instrument Verification Plate Standard curve amplifications showing 20K, 10K, 5K, 2.5K and 1.25K copy populations in replicates of four Unknown amplifications showing 10K and 5K copy populations in replicates of 36 34
Results from RNase P Instrument Verification Plate 35
Calculating DNA Quantity of a Sample 36 34 y = -1.2908Ln(x) + 27.187 R 2 = 0.997 32 Sample 30 C T 28 26 24 22 20 0.001 0.010 0.100 1.000 10.000 100.000 (Log N) initial concentration 36
Data Report Table 37
Dynamic Range Data Amplification of serial dilutions of IL-10 target in replicates of 8 Standard curve showing 7 logs of linear dynamic range 38
相 对 定 量 Relative gene expression: Compare treated samples vs. untreated samples (calibrator samples) RNAi validation Array validation 39
相 对 定 量 ΔΔCt 相 对 量 = 2 -ΔΔCT 目 标 序 列 和 内 参 序 列 的 扩 增 效 率 相 等 ( 且 接 近 100%) The Relative Standard Curve Method 40
Relative Expression 41
等 位 基 因 分 析 Allelic Discrimination (SNP Detection) 42
等 位 基 因 鉴 定 机 理 野 生 型 (wt) 突 变 型 (mut) 43
TaqMan MGB 探 针 Minor Groove Binder enhances the melting temperature (Tm) of the probe resulting in shorter probes Shorter probes provide better discrimination TaqMan MGB probes provide excellent discrimination even with A/T rich sequences 44
Allelic Discrimination Assay FAM VIC VIC FAM FAM VIC Homozygote for FAM-specific allele Homozygote for VIC-specific allele Heterozygote for both alleles 45
Allelic Discrimination Dye Components Viewer FAM VIC 46
阴 阳 性 鉴 定 Plus/Minus Assay 47
Plus/Minus Calls = Automatic Results Pathogen Internal Positive Control + - = Yes - - = No Amp - + = No + + = Yes 48
Target vs. IPC Competition Target IPC 49
荧 光 PCR 光 学 原 理
需 要 了 解 的 问 题 荧 光 染 料 激 发 光 源 波 长 检 测 器 原 件 波 长 51
7500 System Common Hardware Features - Lamp New Tungsten Halogen Excitation Lamp Rated to 2,000 hours Instrument has lamp life monitoring capability and notifies user when change is required or estimated lifetime is exceeded User changeable 52
7500 System Hardware Features - Optical 5 Excitation Filters 5 Emission Filters Filters are optimized to excite a broader range of dyes FAM, SYBR Green I VIC, JOE NED,TAMRA, CY3 Dye. ROX (passive reference), Texas Red CY5 Dye Multicomponenting algorithm means that we don t require new filters to add new custom dyes 53
配 套 试 剂 TaqMan Master Mix TaqMan Gene Expression Master Mix TaqMan SNP Genotyping Master Mix Fast SYBR Green Master Mix TaqMan Gene Expression Assays TaqMan SNP Genotyping Assays Custom Primers & Probes 54
定 量 PCR 的 实 验 要 素
定 量 PCR 实 验 要 素 目 标 基 因 样 品 标 准 曲 线 标 准 品 监 控 系 统 故 障 阳 性 对 照 监 控 污 染 阴 性 对 照 校 准 生 物 学 误 差 阳 性 内 对 照 (IPC) 校 准 物 理 误 差 参 比 荧 光 (ROX) 降 低 其 余 误 差 重 复 实 验 56
样 品 DNA 纯 度 :OD260/OD280=1.8,1.6 ~ 2.0 之 间 DNA 用 量 :0.05 ng 100 ng RNA 纯 度 :OD260/OD280=2.0 cdna 用 量 :1-100 ng 总 RNA 反 转 录 的 cdna 取 1 ul 57
标 准 品 目 的 : 生 成 标 准 曲 线, 建 立 CT 值 与 浓 度 之 间 的 线 性 关 系 要 求 : 浓 度 已 知 5 点 以 上 标 准 品 与 待 测 样 品 的 PCR 效 率 一 致, 且 接 近 100% 仪 器 质 量 一 致 试 剂 质 量 一 致 : 模 板 纯 度 引 物 和 探 针 的 Tm 值 酶 活 性 缓 冲 液 成 分 反 应 条 件 一 致 : 循 环 参 数 相 同 同 一 次 实 验 不 要 求 : 不 要 求 标 准 品 与 目 标 基 因 使 用 相 同 的 DNA 可 以 相 同, 也 可 以 不 同 C T = - k lgx 0 + b 58
标 准 品 梯 度 稀 释 方 法 选 择 目 标 提 取 /PCR 纯 化 测 定 浓 度 调 整 浓 度 梯 度 稀 释 CT 值 在 18-30 之 间, 覆 盖 全 部 样 品 浓 度 区 间 10 倍 连 续 梯 度 稀 释 方 法 : 1v 原 液 ( 标 准 品 i) +9v 稀 释 缓 冲 液, 得 标 准 品 ii 1v 标 准 品 ii+9v 稀 释 缓 冲 液, 得 标 准 品 iii 1v 标 准 品 iii +9v 稀 释 缓 冲 液, 得 标 准 品 iv 1v 标 准 品 iv +9v 稀 释 缓 冲 液, 得 标 准 品 v 切 不 可 由 标 准 品 i 分 别 加 不 同 体 积 的 稀 释 缓 冲 液 直 接 得 到 标 准 品 ii iii iv v 59
标 准 品 单 位 标 准 品 的 单 位 根 据 最 终 目 的 选 择 标 准 品 单 位 如 果 要 求 测 定 样 品 的 基 因 拷 贝 数, 则 梯 度 稀 释 已 知 摩 尔 浓 度 的 DNA 片 段 如 果 要 求 测 定 样 品 的 重 量 百 分 比 [%(w/w)], 如 转 基 因, 标 准 品 是 将 转 基 因 与 非 转 基 因 食 品 粉 末 按 重 量 比 混 合, 然 后 抽 提 混 合 DNA; 切 不 可 先 抽 好 转 基 因 DNA, 再 梯 度 稀 释, 也 不 可 分 别 抽 提 转 基 因 与 非 转 基 因 DNA, 再 按 重 量 比 例 混 合 ( 这 样 得 出 的 是 基 因 重 量 百 分 比, 而 不 是 样 品 重 量 百 分 比 ) 60
PCR 效 率 对 定 量 结 果 的 影 响 n = 30 1+Ex = 1.95 N = N 0 1.95 30 = N 0 x 5.0 x 10 8 相 差 2.2 倍 n = 30 1+Ex = 1.90 N = N 0 1.90 30 = N 0 x 2.3 x 10 8 (Ex= 扩 增 效 率 ;n= 循 环 圈 数 ;No= 起 始 模 板 分 子 数 ;N= 扩 增 产 物 分 子 数 ) 61
PCR 效 率 测 定 K=-1/log(1+Ex) 62
??? 在 使 用 TaqMan MGB 探 针 的 情 况 下, 你 认 为 管 家 基 因 与 目 标 基 因 是 在 同 一 管 内 做 多 重 定 量 好, 还 是 分 成 两 管 分 别 定 量 好? 哪 一 种 检 测 的 数 据 更 精 确? 63
ROX 校 准 增 加 数 据 精 度 64
复 管 测 试 样 品 和 标 准 品 都 要 重 复 重 复 次 数 须 遵 循 统 计 学 要 求 65
误 差 的 校 正 生 物 学 方 面 的 误 差 :IC 校 正 细 胞 数 量 的 差 异 抽 提 效 率 纯 化 损 失 反 转 录 效 率 等 物 理 方 面 的 误 差 :ROX 校 正 枪 的 误 差 ( 如 试 剂 体 积 ) 耗 材 质 量 ( 如 管 盖 厚 度 透 光 性 能 不 一 致 ) 所 导 致 的 光 能 损 失 仪 器 稳 定 性 ( 如 孔 间 批 间 温 度 的 波 动 ) 的 误 差 等 其 余 的 误 差 : 统 计 校 正 重 复 实 验, 取 平 均 值 66
Q & A 67
术 道 生 物 学 意 义 检 测 技 术 68
谢 谢! 8008203939 cnmcbsupport@appliedbiosystems.com