荧 光 定 量 PCR 解 决 方 案 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD
内 容 概 要 荧 光 定 量 PCR 的 原 理 及 标 记 方 法 荧 光 定 量 PCR 数 据 计 算 方 法 荧 光 定 量 PCR 文 献 解 读 MIQE 标 准 及 实 验 常 见 问 题 分 析 定 量 PCR 引 物 设 计 技 巧
荧 光 定 量 PCR 原 理 -- 定 义 Real-time PCR 技 术 : 利 用 荧 光 信 号 的 变 化 实 时 检 测 PCR 扩 增 反 应 中 每 一 个 循 环 扩 增 产 物 量 的 变 化, 通 过 Ct 值 和 标 准 曲 线 的 关 系 对 起 始 模 板 进 行 定 量 分 析 与 常 规 PCR 技 术 的 比 较 : 1. 对 PCR 反 应 终 产 物 进 行 定 量 和 定 性 分 析 ( 电 泳 ) 2. 无 法 对 起 始 模 板 准 确 定 量, 无 法 对 扩 增 反 应 实 时 监 测
荧 光 定 量 PCR 原 理 -- 常 用 名 词 概 念 扩 增 曲 线 荧 光 阈 值 Ct 值
Rn( 荧 光 强 度 ) 荧 光 定 量 PCR 原 理 -- 扩 增 曲 线 平 台 期 荧 光 基 团 Log-liner phase 荧 光 检 测 元 件 Baselin e Cycle( 循 环 数 )
Rn( 荧 光 强 度 ) 荧 光 定 量 PCR 原 理 -- 荧 光 域 值 前 15 个 循 环 信 号 作 为 荧 光 本 底 信 号 (baseline) 平 台 期 真 正 的 信 号 : 荧 光 信 号 超 过 域 值, 进 入 指 数 扩 增 期 之 后 荧 光 域 值 的 缺 省 设 置 是 3~15 个 循 环 的 荧 光 信 号 的 标 准 偏 差 的 10 倍 手 动 设 置 : 大 于 荧 光 背 景 值 和 阴 性 对 照 的 荧 光 最 高 值 ; 进 入 指 数 期 的 最 初 阶 段 Log-liner phase Baselin e Threshold Cycle( 循 环 数 )
Rn( 荧 光 强 度 ) 荧 光 定 量 PCR 原 理 --Ct 值 Ct 值 的 定 义 : PCR 扩 增 过 程 中, 扩 增 产 物 的 荧 光 信 号 达 到 设 定 的 阈 值 时 所 经 过 的 扩 增 循 环 次 数 Ct value Cycle( 循 环 数 )
荧 光 定 量 PCR 原 理 --Ct 值 定 量 的 数 学 原 理 理 想 的 PCR 反 应 X n =X 0 * 2 n n: 扩 增 循 环 数 X 0 : 起 始 模 板 数 量 X n : 第 n 次 循 环 后 扩 增 产 物 数 量
荧 光 定 量 PCR 原 理 --Ct 值 定 量 的 数 学 原 理 非 理 想 的 PCR 反 应 X n =X 0 * (1+En) n n: 扩 增 循 环 数 X 0 : 起 始 模 板 数 量 En: 扩 增 效 率 X n : 第 n 次 循 环 后 扩 增 产 物 数 量
荧 光 定 量 PCR 原 理 --Ct 值 定 量 的 数 学 原 理 在 扩 增 产 物 达 到 荧 光 阈 值 时, 所 经 历 的 循 环 数 为 Ct X Ct =X 0 (1+En) Ct =M (1) * X Ct : 在 阈 值 设 定 以 后,X Ct 是 一 个 常 数, 可 以 用 荧 光 强 度 表 示 的 产 物 量, 定 为 M 方 程 式 (1) 两 边 同 取 对 数 得 : 整 理 方 程 式 (2): LogM=LogX 0 *(1+En) Ct (2) LogX 0 =Log M -Ct Log(1+En)
Cycle number 荧 光 定 量 PCR 原 理 --Ct 值 与 起 始 模 板 量 的 关 系 起 始 模 板 量 越 多, 荧 光 达 到 域 值 的 循 环 数 越 少, 即 Ct 值 越 小 Log 模 板 起 始 浓 度 与 Ct 值 呈 线 性 关 系 Sample Ck 10 4 Ck 10 2 Log of DNA concentration
荧 光 定 量 PCR 原 理 --PCR vs qpcr 同 一 个 样 品 重 复 96 次 PCR 的 扩 增 曲 线
荧 光 定 量 PCR 技 术 的 应 用 定 性 分 析 研 究 : 杂 合 或 纯 合 子 鉴 定,(SNPs) 分 析 等 绝 对 定 量 研 究 : 病 毒 和 病 原 菌 定 量 分 析, 基 因 拷 贝 数 定 量, GMO 定 量 检 测 等 相 对 定 量 研 究 :mrna 表 达 量 分 析,siRNA 效 果 确 认, 基 因 芯 片 结 果 验 证, 差 异 显 示 结 果 验 证 等
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常 用 荧 光 标 记 方 法 非 特 异 性 荧 光 标 记 SYBR Green I 特 异 性 荧 光 标 记 TaqMan Probe 分 子 信 标
SYBR Green I 染 料 法 原 理 SYBR Green I 是 一 种 结 合 于 所 有 dsdna 双 螺 旋 小 沟 区 域 的 具 有 绿 色 激 发 波 长 的 染 料 SYBR Green I
SYBR Green I 染 料 法 作 用 机 理 热 变 性 引 物 退 火 延 伸 反 应
SYBR Green I 染 料 法 问 题 点 与 关 键 点 问 题 点 : SYBR Green I 与 任 何 双 链 DNA 进 行 结 合 后 散 发 荧 光, 因 此 如 果 反 应 体 系 中 有 非 特 异 性 扩 增 或 引 物 二 聚 体 的 产 生, 也 将 同 时 被 检 测, 从 而 可 能 导 致 检 测 结 果 不 准 确 关 键 点 : 设 计 合 适 引 物, 防 止 非 特 异 性 扩 增!
SYBR Green I 染 料 法 融 解 曲 线 原 始 图 谱 对 数 图 谱 将 温 度 与 荧 光 强 度 的 变 化 求 导 (-di/dt)
SYBR Green I 染 料 法 融 解 曲 线 融 解 曲 线 分 析, 单 一 峰 无 非 特 异 性 荧 光 定 量 准 确 融 解 曲 线 分 析, 出 现 杂 峰 其 他 产 物 出 现 非 特 异 性 荧 光, 因 此 定 量 不 准 确
Taqman 探 针 法 原 理 5 端 标 记 有 报 告 基 团 (Reporter, R), 如 FAM VIC 等 3 端 标 记 有 荧 光 淬 灭 基 团 (Quencher, Q) 探 针 完 整,R 发 射 的 荧 光 能 量 被 Q 基 团 吸 收, 无 荧 光, R 与 Q 分 开, 发 荧 光 Taq 酶 有 5 3 外 切 核 酸 酶 活 性, 可 水 解 探 针
Taqman 探 针 法 工 作 机 理 探 针 热 变 性 引 物 报 告 基 团 R 淬 灭 基 团 引 物 和 探 针 与 模 板 退 火 DNA 聚 合 酶 R 探 针 延 伸 反 应 R R
实 时 荧 光 定 量 PCR 的 分 类 -- 几 种 方 法 的 比 较 方 法 优 点 缺 点 适 用 范 围 适 用 广 适 合 科 研 中 对 多 个 目 的 SYBR Green I 方 法 灵 敏 方 便 引 物 要 求 高 易 出 现 非 特 异 性 带 基 因 定 量 分 析, 基 因 表 达 量 的 研 究 便 宜 TaqMan 方 法 特 异 性 高 重 复 性 好 价 格 高 只 适 合 特 定 目 标 适 合 病 原 体 检 测, 疾 病 耐 药 基 因 研 究, 药 物 疗 效 考 核, 遗 传 疾 病 的 诊 断 HRM 方 法 特 异 性 极 高 区 分 度 高 对 仪 器 及 试 剂 要 求 较 高 种 系 的 差 异 研 究 SNP 等 单 碱 基 突 变 研 究
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荧 光 定 量 PCR 的 解 析 方 法 ( 依 据 课 题 要 求 提 前 确 定 ) 绝 对 定 量 解 析 方 法 相 对 定 量 解 析 方 法
绝 对 定 量 解 析 方 法
绝 对 定 量 的 定 义 Log( 起 始 浓 度 ) 与 循 环 数 呈 线 性 关 系, 通 过 已 知 起 始 拷 贝 数 的 标 准 品 可 作 出 标 准 曲 线, 即 得 到 该 扩 增 反 应 存 在 的 线 性 关 系 根 据 样 品 Ct 值, 就 可 以 计 算 出 样 品 中 所 含 的 模 板 量 Sample 2 5
质 粒 标 准 品 的 制 备 目 的 基 因 基 因 组 DNA PCR 目 的 基 因 目 的 基 因 目 的 基 因 克 隆 质 粒 质 粒 提 取,OD 值 定 量, 将 质 粒 梯 度 稀 释 作 为 标 准 品 使 用
质 粒 标 准 品 稀 释 方 法 与 拷 贝 数 计 算 倍 比 梯 度 稀 释 方 法 : 1v 原 液 ( 标 准 品 i) +9v 稀 释 缓 冲 液, 得 标 准 品 ii 1v 标 准 品 ii+9v 稀 释 缓 冲 液, 得 标 准 品 iii 1v 标 准 品 iii +9v 稀 释 缓 冲 液, 得 标 准 品 iv 1v 标 准 品 iv +9v 稀 释 缓 冲 液, 得 标 准 品 v 拷 贝 数 的 计 算 : 待 测 样 本 浓 度 (ng/ul)=od260 50 稀 释 倍 数 样 本 分 子 量 = 碱 基 数 324 待 测 样 本 拷 贝 数 (copies/ul)= 待 测 样 本 浓 度 / 样 本 分 子 量 6 10 14
绝 对 定 量 实 验 例 乙 肝 病 人 血 液 中 HBV 的 绝 对 定 量 方 法 : 从 血 液 中 提 取 病 毒 DNA, 以 TaqMan 探 针 法 进 行 荧 光 定 量 检 测 试 剂 :TIANGEN 公 司 探 针 法 试 剂 RealMasterMix(Probe)( 目 录 号 :FP203) 标 准 品 : 质 粒 标 准 品 浓 度 为 10 6 10 5 10 4 10 3 ;2 个 重 复 ; 设 阴 性 空 白 对 照 实 验 步 骤 : 提 取 HBV DNA; 设 计 特 异 引 物 ; 设 计 TaqMan 探 针 并 标 记 探 针 ; 荧 光 定 量 扩 增 ; 结 果 分 析 : 获 取 血 液 样 品 中 HBV DNA 的 精 确 copy 数
绝 对 定 量 实 验 例 乙 肝 病 人 血 液 中 HBV 的 绝 对 定 量 实 验 数 据 Sample copies/ml Ct1 Ct2 Mean Ct STD 标 准 品 标 准 品 标 准 品 标 准 品 5 10 3 28.18 28.64 28.41 0.16 5 10 4 25.25 25.14 25.19 0.04 5 10 5 22.11 22.46 22.28 0.12 5 10 6 18.63 18.92 18.77 0.10 未 知 样 品? 20.56 20.45 20.5 0.05 空 白 对 照 None None
绝 对 定 量 实 验 例 乙 肝 病 人 血 液 中 HBV 的 绝 对 定 量 标 准 曲 线 制 作 : 利 用 Mean Ct 作 图 可 得 到 标 准 曲 线 y = -3.29x + 40.33 R 2 = 0.9978 扩 增 效 率 (E) 计 算 E = 10-1/ 斜 率 -1 = 10-1/-3.29-1 = 2.01-1 = 1.01 相 关 系 数 (R 2 ): 大 于 0.98, 越 接 近 1, 结 果 可 信 度 越 高 扩 增 效 率 (E):0.9-1.2, 越 接 近 1, 越 理 想
绝 对 定 量 实 验 例 乙 肝 病 人 血 液 中 HBV 的 绝 对 定 量 未 知 样 品 拷 贝 数 的 计 算 将 Ct 值 带 入 线 性 方 程 : 20.5= -3.29 X + 40.33 X= 20.5-40.33-3.29 =6.03 QuantityUnknown=10 6.03 =1,071,519 copies
相 对 定 量 解 析 方 法
相 对 定 量 的 必 要 性 理 论 上 目 的 基 因 表 达 量 分 析 条 实 际 目 的 基 因 表 达 量 分 析 Sample A 细 胞 起 始 数 相 同 Sample B RNA 提 取 效 率 相 同 目 的 基 因 扩 增 效 率 相 同
必 须 用 内 对 照 基 因 ( 管 家 基 因 ) 进 行 校 正, 进 行 相 对 表 达 量 分 析
实 验 值 相 对 定 量 分 析 管 家 基 因 筛 选 管 家 基 因 维 持 细 胞 基 本 代 谢 活 动 所 必 须 的 基 因, 如 :GAPDH Actin 18S rrna 等 筛 选 方 法 根 据 文 献 提 供 通 过 具 体 实 验 筛 选 6 5 4 3 2 1 0 Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 实 验 组 P P O P HPRT β-actin GAPDH β-2-microglobulin
相 对 定 量 分 析 两 种 常 用 的 分 析 方 法 双 标 准 曲 线 法 2 - Ct 法 (CT 值 比 较 法 )
相 对 定 量 分 析 双 标 准 曲 线 法 通 过 标 准 曲 线 对 对 照 样 品 待 测 样 品 的 目 的 基 因 及 管 家 基 因 进 行 定 量, 然 后 根 据 计 算 公 式 求 得 相 对 值 即 为 相 对 表 达 量 公 式 : 校 正 值 = 目 的 基 因 定 量 结 果 管 家 基 因 定 量 结 果 相 对 值 = 待 测 样 品 的 校 正 值 对 照 样 品 的 校 正 值
相 对 定 量 分 析 双 标 准 曲 线 法 实 验 数 据 检 测 样 品 管 家 基 因 H 目 的 基 因 X 定 量 结 果 定 量 结 果 校 正 值 相 对 量 对 照 样 品 6391.5 343.4 0.0537 1.000 待 测 样 品 1 8589.7 17.3 0.0020 0.037 待 测 样 品 2 7432.9 1946.1 0.2618 4.874 优 点 : 分 析 简 单, 实 验 优 化 相 对 简 单 缺 点 : 对 每 一 个 基 因, 每 一 轮 实 验 都 必 需 做 标 准 曲 线 应 用 : 基 因 表 达 调 控 研 究 中 最 常 用 与 公 认 的 两 种 相 对 定 量 方 法 之 一
相 对 定 量 分 析 2 - Ct 法 公 式 : F = 2 - { 待 测 组 目 的 基 因 待 测 组 管 家 基 因 对 照 组 目 的 基 因 对 照 组 管 家 基 因 平 均 Ct 值 平 均 Ct 值 平 均 Ct } - - 值 - 平 均 Ct 值 优 点 : 无 需 作 标 准 曲 线 缺 点 : 假 定 扩 增 效 率 接 近 100 %; 假 定 标 准 曲 线 及 每 次 扩 增 之 际 间 的 效 率 都 保 持 一 致 ; 应 用 : 基 因 表 达 调 控 研 究 中 最 常 用 与 公 认 的 两 种 相 对 定 量 方 法 之 一
相 对 定 量 分 析 2 - Ct 法 实 验 数 据 : Sample 处 理 前 处 理 后 Jun(MeanCt) GAPDH(MeanCt) E 18 17 0.95 16 17.4 0.95 2 - Ct 法 : 假 设 目 的 基 因 和 参 照 基 因 扩 增 效 率 都 接 近 100% Ct( 处 理 前 )=18-17=1 Ct( 处 理 后 )=16-17.4=-1.4 Ct= Ct( 处 理 后 )- Ct( 处 理 前 )=-1.4-1=-2.4 比 率 ( 处 理 后 / 处 理 前 )=2 - Ct =2 -(-2.4) = 5.3 所 以 Jun 基 因 在 处 理 后 表 达 水 平 是 处 理 前 的 5.3 倍 修 正 方 法 : 如 果 我 们 知 道 目 标 基 因 和 参 照 基 因 有 相 同 的 扩 增 效 率, 但 扩 增 效 率 不 等 于 1, 那 么 2 - Ct 可 以 修 正 为 :(1+E) - Ct, 例 如 扩 增 效 率 为 0.95, 那 么 计 算 公 式 可 修 正 为 1.95 - Ct
荧 光 定 量 PCR 文 献 分 析 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD
经 典 文 献 刊 物 :PLANT CELL( 植 物 细 胞 )(9.865) 单 位 : 中 科 院 遗 传 所 植 物 基 因 组 国 家 重 点 实 验 室 & 弗 莱 堡 大 学 & 明 尼 苏 达 大 学
经 典 文 献 刊 物 :Journal of Experimental Botany( 实 验 植 物 学 杂 志 )(4.125) 单 位 : 清 华 大 学 & 新 加 坡 国 立 大 学
研 究 内 容 Paper1: 通 过 拟 南 芥 突 变 株 (jdl1/asa1-1) 分 析 了 茉 莉 酸 和 植 物 激 素 的 相 互 作 用 来 调 节 拟 南 芥 的 侧 根 形 成,ASA1 基 因 在 茉 莉 酸 介 导 的 植 物 激 素 生 物 合 成 和 运 输 调 节 中 的 重 要 性 Paper2: 通 过 分 子 学 和 生 理 学 的 方 法 分 析 了 拟 南 芥 中 茉 莉 酸 诱 导 的 花 青 素 积 累 的 分 子 机 制, 表 明 其 主 要 是 通 过 调 节 转 录 因 子 PAP1 PAP2 GL3 的 表 达, 进 而 调 节 花 青 素 后 期 合 成 基 因 DFR LDOX UF3GT 的 表 达, 最 终 调 节 了 拟 南 芥 中 茉 莉 酸 诱 导 的 花 青 素 的 生 物 合 成 共 同 点 : 信 号 诱 导 的 植 物 生 长 发 育 的 分 子 机 制
实 验 思 路 和 技 术 方 法 jdl1/asa1-1 是 茉 莉 酸 诱 导 响 应 JA 特 异 诱 导 花 青 素 的 积 累 MeJA/ 其 型 -MeJA 培 养 实 验 他 激 素 培 养 ASA1-Trp 合 成 限 速 酶 分 子 克 隆 / 底 物 回 补 实 验 ASA1 对 IAA 合 成 的 重 要 性 RNA 凝 胶 印 迹 /qrt-pcr 茉 莉 酸 调 节 - 运 输 元 件 PIN1/PIN2/AUX11 的 表 达 qrt-pcr 茉 莉 酸 诱 导 跟 乙 稀 无 关 MeJA&ACC 培 养 实 验 关 键 基 因 表 达 COI1 的 必 要 性 后 期 合 成 基 因 DFR LDOX UF3GT 表 达 RNA 凝 胶 印 迹 / qrt-pcr COI1 的 必 要 性 转 录 因 子 PA1 PA2 GL3 的 表 达 RNA 凝 胶 印 迹 / qrt-pcr 蔗 糖 在 JA/6BA 诱 导 合 成 中 的 重 要 性 - 蔗 糖 /JA/6BA 培 养
定 量 结 果 Paper1: 茉 莉 酸 处 理 提 高 ASA1 的 表 达 ; 调 节 了 运 输 元 件 的 表 达 Paper2: 转 录 因 子 GL3 PAP1 明 显 受 MeJA 诱 导 且 依 赖 于 COI1
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荧 光 定 量 PCR 的 国 际 化 标 准 MIQE Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments http://miqe.info/
Stephen Bustin BA(Mod) PhD (TCD) FSB Professor of Molecular Science Queen Mary University of London
MIQE
生 命 科 学 与 生 物 医 学 的 国 际 化 标 准 MIBBI The Minimum Information for Biological and Biomedical Investigations (MIBBI)
荧 光 定 量 PCR 的 国 际 化 标 准 MIQE
荧 光 定 量 PCR 的 国 际 化 标 准 MIQE 鼓 励 概 好 念 的 & 实 术 验 语 操 作 规 范 目 的 值 得 研 信 究 赖 & 的 临 实 床 验 应 结 用 果 科 样 学 本 文 的 献 采 的 集 完 整 处 性 理 和 可 制 靠 备 性 实 验 室 核 之 酸 间 的 结 质 果 量 的 控 一 制 致 性 增 加 实 反 验 转 的 录 透 明 度 规 范 实 qpcr& 验 仪 器 数 据 耗 分 材 析 及 试 剂
荧 光 定 量 PCR 的 国 际 化 标 准 MIQE 概 念 & 术 语 规 范 内 容 研 究 & 临 床 应 用 样 本 的 采 集 处 理 和 制 备 核 酸 的 质 量 控 制 反 转 录 qpcr& 数 据 分 析
荧 光 定 量 PCR 的 国 际 化 标 准 MIQE
荧 光 定 量 PCR 的 国 际 化 标 准 MIQE 基 因 检 索 编 号 引 物 探 针 序 列 TM 值 NRT NTC 模 板 量 反 应 条 件 和 程 序 CT 值 slop
荧 光 定 量 PCR 反 应 有 效 性 的 确 认 线 性 关 系 扩 增 效 率 确 认 相 关 系 数 (R 2 ): 大 于 0.98 标 准 曲 线 斜 率 : -3 - -3.5 PCR 扩 增 效 率 (E):0.9-1.2 检 测 灵 敏 度 确 认 35Cycles 内 可 得 到 好 的 定 量 结 果 ( 科 研 领 域 ) 如 果 采 用 SYBR 检 测 方 法,30Cycles 内 无 非 特 异 性 产 物 扩 增 35 Cycles 内 无 引 物 二 聚 体 产 生
APP for cell-phone
SYBR 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 引 物 设 计 样 品 制 备 环 境 要 求 浓 度 确 定 RT 试 剂 选 择 反 应 体 系 优 化 定 量 体 系 配 备 误 差 控 制 反 应 条 件 优 化 上 机 技 能 要 求 分 析 方 法 数 据 分 析 仪 器 介 绍
SYBR 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 RNA 制 备 环 境 要 求 质 量 确 定 RT 无 RNase 环 境 使 用 无 RNase 耗 材 分 光 光 度 计 检 测 电 泳 检 测 定 量 体 系 配 备 专 用 RNase-free 工 具 上 机 纯 度 高 完 整 性 好 的 RNA 数 据 分 析
SYBR 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 样 品 制 备 RT 试 剂 选 择 反 应 体 系 优 化 定 量 体 系 配 备 AMV M-MLV 下 游 反 应 数 确 定 反 转 录 体 积 引 物 的 选 择 上 机 Quant 高 效 数 全 据 分 长 析 的 cdna
GC%:50-60% Tm:50-65 单 个 碱 基 重 复 <4 个 引 物 设 计 无 二 级 结 构 样 品 制 备 环 境 要 求 扩 增 长 度 :100-200bp 核 酸 制 备 区 浓 度 确 定 RT 反 应 液 制 备 区 制 作 标 准 曲 线 定 量 体 系 配 备 误 差 控 制 设 定 浓 度 区 间 上 机 使 用 mix 降 低 系 统 误 差 均 一 的 反 应 液 和 模 板 混 合 物 设 置 重 复 ( 3 次 ) 设 置 空 白 和 阴 性 对 照 数 据 分 析
SYBR 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 阳 性 对 照 样 品 制 备 退 火 温 度 优 化 : 梯 度 PCR 延 伸 时 间 : 产 物 长 度 决 定 反 应 体 积 >5ul, 推 荐 20-50ul 待 测 样 本 阴 性 对 照 RT 模 板 准 备 引 物 浓 度 优 化, 模 板 量 优 化 Mg2+ 调 节, 酶 活 调 节 反 应 条 件 优 化 反 应 体 系 优 化 上 机 数 据 分 析 扩 增 效 率 :90%-110% 重 复 性 :std<0.2 标 准 曲 线 :R>0.99 或 R 2 >0.98
SYBR 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 内 参 控 制 样 品 制 备 机 器 校 正 控 制 平 滑 曲 线, 重 复 性 好, 灵 敏 度 高 自 配 realmastermix 分 装 控 制 RT 试 剂 选 择 RCHO-Lightcycler series 模 板 准 备 误 差 控 制 ROTOGEN-RG series BIO-RAD Opticon series 上 机 技 能 要 求 ABI-7series Bioer-Linegene series 数 据 分 析 仪 器 介 绍
ABI 7500 ABI StepOne Roche Lightcycler 1.5 Roche Lightcycler 480 Cepheid SmartCycler Stratagene Mx3005PTM
Mastercycler ep realplex 4 Bio-rad iq5 Bio-rad MiniOpticon 杭 州 博 日 LINE-GENE FQD-66A Corbett Rotor-gene3000 Corbett Rotor-gene6000
SYBR 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 样 品 制 备 可 靠, 准 确 的 数 据 RT 相 对 定 量 :2 - Ct 法 模 板 准 备 绝 对 定 量 : 标 准 曲 线 法 上 机 分 析 方 法 数 据 分 析 仪 器 介 绍
荧 光 定 量 PCR 实 验 调 试 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD
荧 光 定 量 结 果 分 析 - 特 异 扩 增 CT 值 20 左 右 ( 建 议 调 整 到 15-30 之 间 ) 特 异 性 扩 增 ( 单 一 峰 )
荧 光 定 量 结 果 分 析 - 等 比 稀 释 CT 值 跨 度 均 一 熔 解 曲 线 单 一 slope R2 3.34 0.999
荧 光 定 量 结 果 分 析 - 案 例 分 析 引 物 二 聚 体 严 重 CT 值 偏 大, 模 板 量 较 小 (CT 值 30) 解 决 方 案 : 调 整 加 入 模 板 量, 使 CT 值 尽 量 落 在 15-30 之 间
产 物 电 泳 结 果 与 熔 解 曲 线 不 完 全 一 致 的 情 况 产 物 电 泳 结 果 与 熔 解 曲 线 不 完 全 一 致 的 情 况 是 有 出 现 的, 一 般 分 3 种 情 况 : 1. 非 特 异 条 带 TM 值 较 低, 在 熔 解 曲 线 ( 大 概 60-95 度 范 围 ) 中 不 能 体 现, 但 是 电 泳 能 够 看 到 在 靠 前 的 位 置 有 小 片 段 由 于 其 不 计 入 荧 光 总 量, 这 种 情 况 不 用 在 意 2. 非 特 异 条 带 在 胶 中 位 置 较 大, 成 不 规 则 状 态, 有 可 能 是 荧 光 染 料 与 loading 形 成 的 复 合 物, 在 目 的 条 带 上 面 一 点, 所 有 泳 道 都 会 有 这 种 情 况 不 用 在 意 3. 产 物 存 在 剪 接 变 体, 两 种 扩 增 片 段 TM 值 非 常 接 近, 在 熔 解 曲 线 中 不 能 区 分, 但 长 时 间 跑 分 辨 率 高 的 胶 能 够 略 微 区 分 得 开, 但 条 带 距 离 非 常 近 这 种 情 况 就 需 要 具 体 考 虑, 剪 接 变 体 是 否 是 在 你 实 验 设 计 时 考 虑 的 以 上 情 况 中 1,2 均 不 需 要 重 新 设 计 引 物, 因 为 对 于 实 验 数 据 收 集 没 有 造 成 影 响, 而 且 我 们 一 般 认 为 熔 解 曲 线 是 比 跑 普 通 琼 脂 糖 凝 胶 分 辨 率 更 高 的 第 三 种 可 能 需 要 你 进 行 生 物 信 息 学 分 析
荧 光 定 量 结 果 分 析 - 案 例 分 析 无 特 异 性 扩 增, 完 全 的 引 物 二 聚 体 CT 值 在 正 常 范 围, 但 扩 增 曲 线 趋 缓, 荧 光 信 号 值 相 对 偏 低, 能 与 目 的 片 段 扩 增 曲 线 区 别 解 决 方 案 :PCR 产 物 电 泳 检 测 有 无 目 的 条 带, 以 确 定 加 入 模 板 是 否 正 确
Ct Ct 荧 光 定 量 结 果 分 析 - 体 系 中 引 物 终 浓 度 的 选 择 Comparioson of primer concentration_tiangen Realmastermix_Hs3 Comparioson of primer concentration_tiangen Realmastermix_Hs3 33 33 31 31 29 29 27 25 23 21 Primer_500nM Primer_250nM Primer_100nM 27 25 23 21 Primer_500nM Primer_250nM Primer_100nM 19 19 17 17 15 15 0.1ng 1.0ng 10.0ng 100.0ng 0.1ng 1.0ng 10.0ng 100.0ng human cdna amount human cdna amount
荧 光 定 量 结 果 分 析 - 体 系 中 引 物 终 浓 度 的 选 择
荧 光 定 量 结 果 分 析 - 案 例 分 析 做 相 对 定 量 时, 引 物 交 叉 污 染 导 致 的 体 系 双 扩 增 与 单 一 扩 增 的 熔 解 曲 线 比 较 可 能 原 因 : 引 物 交 叉 污 染 解 决 方 案 : 在 超 净 台 中, 换 用 移 液 器 分 别 加 入 引 物, 避 免 交 叉 污 染
荧 光 定 量 结 果 分 析 - 案 例 分 析 相 对 定 量, 正 常 熔 解 曲 线 正 常 熔 解 曲 线
荧 光 定 量 结 果 分 析 - 案 例 分 析 其 他 非 正 常 熔 解 曲 线 可 能 原 因 : 反 应 体 系 污 染 试 剂 失 效 ; 耗 材 与 仪 器 不 匹 配 ; 仪 器 长 时 间 未 做 矫 正 ; 解 决 方 案 : 在 无 模 板 洁 净 区 内 配 制 体 系 ; 避 免 将 试 剂 暴 露 在 强 光 或 高 温 下 ; 做 好 阳 性 阴 性 对 照 ; 选 用 与 仪 器 匹 配 的 耗 材 ; 定 期 请 工 程 师 进 行 仪 器 校 准
荧 光 定 量 PCR 引 物 设 计 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD
引 物 设 计 原 则 选 择 高 度 保 守, 碱 基 分 布 均 匀 的 靶 序 列 ; 引 物 长 度 通 常 为 20~25bp,Tm 值 通 常 55~60 并 尽 量 保 证 上 下 游 引 物 温 度 一 致, G+C 含 量 在 40-60% 之 间, 产 物 大 小 在 50~250bp; 选 用 G3 端 低,5 端 和 中 间 相 对 较 高 的 引 物 ; 引 物 3 端 避 免 使 用 碱 基 A, 引 物 3 端 避 免 出 现 连 续 3 个 以 上 的 相 同 碱 基, 且 最 后 5 个 碱 基 中 G 和 / 或 C 碱 基 的 总 数 不 超 过 2 个 ; 引 物 二 聚 体 及 发 夹 结 构 的 能 值 不 能 过 高 ( 不 超 过 4.5kcal/mol) 为 避 免 基 因 组 扩 增, 引 物 设 计 最 好 能 跨 两 个 外 显 子
Taqman 探 针 法 PCR 体 系 的 建 立 1 引 物 探 针 的 设 计 原 则 : 探 针 Tm 为 68-70,<30 bp, 5 不 能 有 G,G 可 能 会 淬 灭 荧 光 素, 引 物 尽 量 靠 近 探 针, 扩 增 片 段 <200 bp, 引 物 Tm 为 59-60 2 反 应 参 数 的 设 定 : 一 般 为 :94,10-20S 60,30-60S(Taq 酶 5 3 外 切 核 酸 酶 活 性 在 60 最 高 ), 也 可 通 过 温 度 梯 度 优 化 退 火 温 度 3 优 化 引 物 和 探 针 浓 度 : 获 得 最 小 Ct 值, 最 大 信 号 / 背 景 比 值 引 物 浓 度 :100-900nM 探 针 浓 度 :50-300nM 4 其 他 与 常 规 PCR 相 同
Taqman 探 针 设 计 原 则 Taqman 探 针 发 展 : Taqman--MGB 序 列 保 守 探 针 位 置 尽 可 能 靠 近 上 游 引 物 ; 探 针 长 度 通 常 20~30bp,Tm 值 在 65~70, 通 常 比 引 物 高 5 ~10,G-C 含 量 在 40-70% 之 间 ; 避 免 同 一 碱 基 重 复 过 多, 特 别 是 G, 不 可 超 过 4 个 及 以 上 5 end 不 能 是 G; 整 条 探 针 探 针 中 碱 基 C 的 含 量 要 高 于 碱 基 G, 如 果 不 能 满 足, 则 使 用 互 补 链 上 的 探 针
常 用 引 物 设 计 软 件 Oligo 6: 引 物 评 价 Primer Primier 5: 自 动 搜 索 Vector NTI Suit: 综 合 分 析 Primer 3: 在 线 服 务 Primer Express: 实 时 定 量 PCR 引 物 和 探 针 设 计 Beacon Designer: 分 子 信 标 和 Taqman 探 针 设 计 Primer Express+Oligo 6
Primer Express 3.0
Oligo 6- 导 入 序 列
Oligo 6- 导 入 序 列
Oligo 6- 选 择 引 物
Oligo 6- 引 物 评 价
Oligo 6- 引 物 评 价
Oligo 6- 自 动 搜 索
HRM( 高 分 辨 率 溶 解 曲 线 分 析 技 术 ) 原 理 : 每 一 段 DNA 都 有 其 独 特 的 序 列, 也 就 有 了 独 特 的 熔 解 曲 线 形 状, 应 用 饱 和 荧 光 染 料 和 高 分 辨 率 的 熔 解 曲 线 分 析 技 术 可 精 确 对 样 品 的 基 因 型 进 行 分 析, 精 度 可 达 单 碱 基 差 异 优 点 : 高 通 量 简 单 快 速 省 钱 高 灵 敏 度 ; 闭 管 检 测, 避 免 污 染 造 成 的 假 阳 性 ; 可 检 测 已 知 和 未 知 SNP; <400bp 扩 增 产 物 内 SNP, 灵 敏 度 和 精 确 度 100% 缺 点 : 仅 LightCyclerTM 480 PCR 仪, 或 LightScanner 等 少 量 仪 器 可 以 使 用 ;
内 容 概 要 荧 光 定 量 PCR 的 原 理 及 标 记 方 法 荧 光 定 量 PCR 数 据 计 算 方 法 荧 光 定 量 PCR 文 献 解 读 MIQE 标 准 及 实 验 常 见 问 题 分 析 定 量 PCR 引 物 设 计 技 巧
RealMaster Mix- 荧 光 定 量 培 训 班 的 明 星
RealMaster Mix- 荧 光 定 量 培 训 班 的 明 星
SuperReal PreMix- 双 核 时 代 特 异 性 buffer 中 加 入 H-band 因 子, 保 证 扩 增 效 率 的 同 时 消 除 非 特 异 性 扩 增 化 学 修 饰 Hotstar 抗 体 修 饰 Hotstar 高 效 性 耐 热 性 能 较 普 通 热 启 动 Taq DNA 聚 合 酶 更 为 卓 越 HotStart Taq DNA 聚 合 酶 具 有 高 度 的 严 谨 性 和 普 适 性, 并 且 具 有 较 高 的 扩 增 效 率 化 学 修 饰 抗 体 修 饰 抗 抑 制 性 抑 制 剂 来 源 广 泛, 对 于 单 一 来 源 热 启 动 酶 的 活 性 可 能 会 有 较 大 影 响, 而 两 种 酶 则 会 具 有 双 管 齐 下 的 效 果, 大 大 提 高 了 反 应 体 系 对 于 模 板 的 耐 受 度
SuperReal PreMix 比 较 单 酶 双 酶 16.22 15.22 平 均 CT 值 18.5 17.72 21.88 20.7 25.15 24.46
TIANGEN 公 司 荧 光 定 量 产 品 SYBR Green 法 TaqMan 探 针 法 以 DNA 为 模 板 以 RNA 为 模 板 FP202 RealMasterMix (SYBR Green) FP302 Quant qrt-pcr (SYBR Green) Kit FP203 RealMasterMix (Probe) FP304 Quant 一 步 法 qrt PCR (Probe ) FP204 /FP205 FP303 SuperReal PreMix Quant 一 步 法 qrt (SYBR Green) PCR (SYBR Green)