实 时 定 量 PCR: 了 解 影 响 CT 的 关 键 因 素 影 响 CT 值 的 因 素 CT( 阈 值 循 环,Threshold Cycle) 是 扩 增 曲 线 和 阈 值 线 的 交 叉 点 ( 图 1B) 它 是 PCR 反 应 中 模 板 浓 度 的 相 对 测 量 除 了 模 板 浓 度 外, 还 有 许 多 因 素 会 影 响 CT 的 绝 对 值 我 们 将 要 讨 论 最 常 见 的 影 响 CT 值 的 非 模 板 依 赖 性 因 素, 并 描 述 如 何 评 估 实 时 定 量 PCR 反 应 的 效 果 Figure 1. A: Rn is the fluorescence of the reporter dye divided by the fluorescence of a passive reference dye. In other words, Rn is the reporter signal normalized to the fluorescence signal of ROX. In this view, Rn is graphed versus cycle. B: ΔRn is Rn minus the baseline, graphed here versus the cycle of PCR. C: Amplification plot shows the Log (ΔRn) graphed versus cycle. 图 1 显 示 了 实 时 PCR 反 应 扩 增 图 的 几 个 参 数 图 1B 的 对 数 期 对 应 图 1C 的 线 性 期 在 图 1C 扩 增 图 中, 阈 值 必 须 设 在 线 性 期 中 当 模 板 量 减 少 时,CT 值 随 之 增 加 然 而, 反 应 混 合 物 或 仪 器 中 的 任 何 改 变, 只 要 能 影 响 与 CT 值 计 算 相 关 的 荧 光 测 定, 都 会 使 CT 值 产 生 非 模 板 依 赖 性 的 变 化 因 此, 在 不 同 条 件 下 或 用 不 同 试 剂 进 行 的 PCR 反 应 产 生 的 CT 值 不 可 以 直 接 进 行 比 较 2008 年 9 月 10 日 四 十 期 第 10 页, 共 21 页 下 一 页 返 回
反 应 液 成 分 的 影 响 任 何 分 子 的 荧 光 发 射 都 受 环 境 因 素 影 响 ---- 比 如 溶 液 的 ph 值 和 盐 浓 度 图 2 显 示 了 某 个 Taqman 探 针 在 两 种 不 同 的 反 应 液 背 景 下 的 原 始 荧 光 数 据 尽 管 两 组 反 应 的 扩 增 目 标 探 针 和 ROX( 参 比 荧 光 ) 浓 度 都 相 同, 反 应 液 A 中 的 荧 光 信 号 强 度 更 强 Figure 2. Raw fluorescence data obtained with one assay and two master mixes with the same ROX level. The difference in signal is due to the master mix composition. Reaction was performed on an Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System with a VIC MGB probe. The X axis shows the emission wavelength of the fluorophore and the Y axis shows the intensity of the emission. 因 此, 如 图 3 所 示, 产 生 的 Rn 值 也 不 同 注 意 本 底 荧 光 信 号 基 线 属 于 非 模 板 依 赖 的 因 素, 两 种 反 应 液 的 基 线 是 不 同 的 CT 值 的 变 化 并 没 有 反 映 出 反 应 体 系 的 总 体 效 果 ( 图 3B) 灵 敏 度 相 当 的 反 应 液 产 生 的 CT 绝 对 值 可 能 不 同 Figure 3. Master Mix A and Master Mix B were used to amplify RNase P in equal amounts of human gdna using the Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Figure 3A shows the Rn versus cycle number and the baselines for both reactions. Figure 3B shows the Log ( ΔRn) versus cycle number. The threshold (green) is set at the same level for both master mixes. The CT value of Master Mix B (CTB) is earlier than that of Master Mix A (CTA) for identical concentrations of target, reflecting the lower baseline of Master Mix B. www.ebiotradw.com 第 11 页, 共 21 页 下 一 页 返 回
ROX 参 比 荧 光 Rn 值 是 由 FAM 荧 光 除 以 ROX 荧 光 而 得 到 的 比 率 因 此, 假 定 FAM 荧 光 信 号 保 持 不 变,ROX 量 越 少, 产 生 的 Rn 值 就 越 高 这 将 导 致 Rn 基 线 的 上 升, 以 及 随 后 Rn 的 减 小 和 CT 值 的 变 化 降 低 ROX 水 平 而 得 到 的 不 同 CT 值, 没 有 对 反 应 的 真 实 灵 敏 度 产 生 任 何 影 响, 却 有 着 意 想 不 到 的 后 果 如 图 4 所 示, 降 低 ROX 浓 度 将 使 CT 值 的 标 准 偏 差 增 加 标 准 偏 差 越 大, 分 辨 目 标 模 板 浓 度 间 的 微 小 区 别 的 可 信 度 就 越 低 Figure 4. Master mixes containing 3 different concentrations of ROX were used to amplify the TGF beta assay on the Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System using the 96-well block. Figure 4A shows the CT value and Figure 4B shows the standard deviation with variable ROX concentrations. Decreasing ROX concentration gives an earlier CT but increases the standard deviation. PCR 反 应 的 效 率 PCR 反 应 的 效 率 也 会 影 响 CT 值 在 PCR 扩 增 效 率 低 的 条 件 下 进 行 连 续 梯 度 稀 释 扩 增, 与 PCR 扩 增 效 率 高 的 条 件 下 相 比, 可 能 会 所 产 生 斜 率 不 同 的 标 准 曲 线 在 图 5 中, 两 个 样 品 (X 和 Y) 分 别 在 低 效 率 (78%) 和 高 效 率 (100%) 条 件 下 扩 增, 目 标 模 板 浓 度 相 同 的 情 况 下 得 到 了 不 同 的 CT 值 在 这 个 例 子 中, 尽 管 高 效 率 条 件 ( 图 5 中 的 蓝 色 曲 线 ) 在 高 浓 度 时 产 生 的 CT 值 更 晚, 但 它 在 目 标 浓 度 低 时 却 更 为 灵 敏 PCR 效 率 取 决 于 实 验 反 应 混 合 液 性 能 和 样 品 质 量 一 般 说 来, 反 应 效 率 在 90-110% 之 间 都 是 可 以 接 受 的 Figure 5. The blue standard curve has an efficiency of 100% (slope is -3.3). The green standard curve has an efficiency of 78% (slope is -4). Amplification of the Y quantity gives an earlier CT with low efficiency condition (green) compared to the high efficiency condition (blue). With a lower quantity (X) there is an inversion and the low efficiency condition (green) gives a later CT compared to the high efficiency condition (blue). 2008 年 9 月 10 日 四 十 期 第 12 页, 共 21 页 下 一 页 返 回
假 如 所 有 的 实 验 条 件 如 仪 器 试 剂 和 实 验 都 是 完 全 相 同 的, 那 么 在 观 察 到 A 样 品 的 CT 值 高 于 B 样 品 时, 就 可 以 下 结 论 说 A 样 品 的 模 板 量 少 于 B 样 品 然 而 如 果 仪 器 试 剂 引 物 和 探 针 或 者 反 应 体 积 不 同 的 话, 下 这 样 的 结 论 就 不 准 确 因 此,CT 绝 对 值 的 比 较 只 有 在 上 述 实 验 条 件 完 全 相 同 的 情 况 下 才 有 意 义 如 何 评 估 实 时 定 量 PCR 反 应 的 效 果 为 了 比 较 不 同 条 件 ( 例 如 两 种 不 同 的 反 应 液 或 两 台 不 同 的 仪 器 ) 下 的 两 个 反 应, 就 必 须 评 估 以 下 参 数 动 态 范 围 为 了 正 确 地 评 估 PCR 扩 增 效 率, 至 少 需 要 做 3 次 平 行 重 复, 至 少 做 5 个 数 量 级 倍 数 (5 logs) 连 续 梯 度 稀 释 模 板 浓 度 图 6 说 明 了 这 种 建 议 的 理 由, 它 对 比 了 模 板 浓 度 连 续 稀 释 1 个 数 量 级 倍 数 (1 log) 和 5 个 数 量 级 倍 数 (5 logs) 这 两 种 情 况 下, 斜 率 (PCR 效 率 ) 可 能 产 生 的 数 学 偏 差 因 此, 即 使 实 验 100% 有 效, 在 按 1 个 数 量 级 倍 数 (1 log) 梯 度 稀 释 时, 由 于 每 个 稀 释 点 的 标 准 偏 差 而 导 致 可 能 的 偏 移 范 围 达 到 70-170% 之 间 在 按 5 个 数 量 级 倍 数 (5 logs) 梯 度 稀 释 时, 做 同 样 数 量 的 稀 释 点 和 平 行 重 复, 可 能 的 偏 移 只 有 ±8% 这 意 味 着 在 5 个 数 量 级 倍 数 (5 logs) 梯 度 稀 释 的 条 件 下 如 果 PCR 效 率 为 94%, 那 么 PCR 反 应 效 率 可 能 的 偏 移 范 围 在 88% 到 100% 之 间 为 了 准 确 判 断 PCR 反 应 的 效 率, 必 须 进 行 5 个 数 量 级 倍 数 (5 logs) 的 连 续 稀 释 -3.3±10% 的 斜 率 意 味 着 PCR 效 率 达 到 100%±10% PCR 反 应 效 率 越 低, 那 么 灵 敏 度 也 越 低 Figure 6. Accurate calculation of PCR efficiency depends on the range of template amount used for the serial dilution used to calculate the efficiency. With a 2-fold dilution with 5 points (orange), the potential artifact is higher than for the 10-fold dilution with 5 points (blue). R 2 值 另 一 个 评 估 PCR 效 率 的 关 键 参 数 是 相 关 系 数 R 2, 它 是 说 明 两 个 数 值 之 间 相 关 程 度 的 统 计 学 术 语 如 果 R2 等 于 1, 那 么 你 可 以 用 Y 值 (CT) 来 准 确 预 测 X 值 ( 量 )( 图 7A) 如 果 R2 等 于 0, 你 就 不 能 通 过 Y 值 来 预 测 X 值 ( 图 7B) R2 值 大 于 0.99 时, 两 个 数 值 之 间 相 关 的 可 信 度 很 好 www.ebiotradw.com 第 13 页, 共 21 页 下 一 页 返 回
Figure 7. Example of R2 value calculated for 2 straight lines. A: There is a direct relation between x and y values. B: There is no relation between x and y values. 精 确 度 标 准 偏 差 (standard deviation, 偏 差 的 平 方 根 ) 是 最 常 用 的 精 确 度 计 量 方 法 如 果 许 多 数 据 点 都 靠 近 平 均 值, 那 么 标 准 偏 差 就 小 ; 如 果 许 多 数 据 点 都 远 离 平 均 值, 则 标 准 偏 差 就 大 实 际 上, 足 够 多 重 复 次 数 产 生 的 数 据 组 会 形 成 大 致 的 正 态 分 布 这 经 常 可 通 过 经 典 的 中 心 极 限 理 论 来 证 明, 独 立 同 分 布 随 机 变 量 在 无 限 多 时 趋 向 于 正 态 分 布 如 图 8A 所 示, 约 68% 的 数 据 在 平 均 值 的 1 个 标 准 偏 差 之 内, 约 95% 的 数 据 落 在 平 均 值 的 2 个 标 准 偏 差 之 内, 约 有 99.7% 的 数 据 落 在 平 均 值 的 3 个 标 准 偏 差 之 内 Figure 8. Normal distribution and standard deviation. (A) shows a normal distribution of data. If the PCR efficiency is 100% there is one CT between the mean of 2-fold dilution samples (sample X and sample Y). To be able to quantify both samples in 99.7% of cases, the standard deviation has to be less than 1 CT divided by 6 standard deviations (1/6=0.167), shown in (B). To be able to quantify both samples in 95% of the case, the standard deviation has to be less than 1 CT divided by 4 standard deviations (1/4=0.25), shown in (C). 如 果 PCR 反 应 效 率 是 100%, 那 么 2 倍 稀 释 点 之 间 的 平 均 CT 间 隔 应 该 恰 为 1 个 CT 值 ( 图 8B) 要 以 99.7% 的 几 率 分 辨 2 倍 稀 释 浓 度, 标 准 偏 差 就 必 须 小 于 等 于 0.167 标 准 偏 差 越 大, 分 辨 2 倍 稀 释 的 能 力 就 越 低 为 了 能 够 在 95% 以 上 的 情 况 下 分 辨 出 2 倍 稀 释, 标 准 偏 差 必 须 小 于 等 于 0.250( 图 8C) 2008 年 9 月 10 日 四 十 期 第 14 页, 共 21 页 下 一 页 返 回
灵 敏 度 无 论 CT 绝 对 值 是 多 少, 任 何 能 够 有 效 扩 增 和 检 测 起 始 模 板 拷 贝 数 为 1 的 系 统 都 达 到 了 灵 敏 度 的 极 限 如 上 文 所 述,PCR 效 率 是 决 定 反 应 灵 敏 度 的 关 键 因 素 ( 图 5) 在 检 测 极 低 拷 贝 数 时 的 另 一 个 重 要 的 考 虑 因 素 是, 低 拷 贝 时 的 模 板 数 量 不 能 按 普 通 情 况 来 预 期 相 反, 它 会 遵 循 泊 松 分 布, 即 进 行 大 量 的 平 行 重 复, 平 均 应 该 含 有 一 个 拷 贝 的 起 始 模 板, 实 际 上 约 37% 不 含 有 拷 贝, 仅 有 约 37% 含 有 1 个 拷 贝, 约 18% 实 际 上 含 有 两 个 拷 贝 ( 图 9) 因 此, 为 了 更 可 靠 地 检 测 低 拷 贝, 必 须 做 大 量 的 平 行 重 复 实 验 来 提 供 统 计 显 著 性, 并 克 服 泊 松 分 布 的 限 制 Figure 9. Poisson distribution for low copy number. The blue curve represents Poisson distribution for 3.3 pg of DNA (1 copy of DNA). The pink curve represents Poisson distribution for 6.6 pg of DNA (1 cell, 2 copies of DNA). 结 论 当 比 较 不 同 反 应 条 件 下 的 PCR 反 应 时, 需 要 用 效 率 R2 精 确 度 灵 敏 度 这 些 因 素 来 评 估 PCR 反 应 为 了 精 确 严 谨 地 评 估, 表 1 中 所 列 的 所 有 因 素 都 必 须 评 估 TABLE 1. 评 价 荧 光 PCR 结 果 的 标 准 因 素 建 议 指 标 5 个 数 量 级 梯 度 Slope ~ -3.3 效 率 稀 释 R2 > 0.99 精 密 度 至 少 3 个 重 复 标 准 差 < 0.167 增 加 低 浓 度 样 灵 敏 度 统 计 分 析 本 的 重 复 数 除 了 这 些 因 素, 还 必 须 评 估 和 验 证 合 适 的 实 验 对 照 ( 如 无 模 板 对 照, 无 反 转 录 酶 对 照 等 ) 以 及 模 板 质 量 附 录 扩 增 图 扩 增 图 是 荧 光 信 号 对 循 环 数 的 坐 标 图 反 应 以 循 环 中 首 次 检 测 到 PCR 产 物 扩 增 的 时 间 点 为 特 征 核 酸 目 标 的 起 始 拷 贝 数 越 高, 就 越 快 观 察 到 荧 光 的 显 著 增 加 基 线 在 PCR 的 最 初 几 个 循 环 中, 荧 光 信 号 是 几 乎 不 变 的 这 确 定 了 扩 增 图 中 的 基 线 在 这 些 初 始 的 循 环 中, 我 们 看 到 的 其 实 是 反 应 的 荧 光 背 景 通 过 设 定 基 线 以 从 读 数 结 果 中 扣 除 荧 光 背 景 ( 关 于 如 何 设 定 基 线, 请 从 ABI 公 司 的 网 站 www.appliedbiosystems.com 上 下 载 Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System 文 件 ) Rn Rn 是 Rn 扣 除 基 线 后 得 到 的 标 准 化 结 果 ( Rn = Rn 基 线 ) 参 比 荧 光 一 种 用 于 提 供 内 部 荧 光 参 照 的 荧 光 染 料, 荧 光 报 告 基 团 信 号 在 数 据 分 析 时 参 照 它 来 进 行 标 准 化 必 须 使 用 标 准 化 来 校 正 由 浓 度 体 积 或 样 品 变 化 引 起 的 荧 光 波 动 www.ebiotradw.com 第 15 页, 共 21 页 下 一 页 返 回
PCR 效 率 下 面 的 方 程 式 描 述 了 PCR 的 指 数 扩 增 Cn= Ci * (1 + E) n Ci = 起 始 拷 贝 数 Cn = 在 n 个 循 环 的 拷 贝 数 n = 循 环 数 E = 目 标 扩 增 效 率 如 果 效 率 最 大 (=1), 这 个 方 程 式 就 变 成 :Cn = Ci * 2 n, 它 意 味 着 每 一 个 循 环 的 扩 增 倍 数 是 2 如 果 效 率 降 低, 每 个 循 环 产 生 PCR 产 物 的 数 量 也 降 低, 扩 增 图 将 会 延 滞 推 荐 的 效 率 是 介 于 90-110% 之 间 荧 光 报 告 基 团 染 料 (Reporter Dye) 是 指 偶 联 在 TaqMan 探 针 5 端 的 荧 光 基 团 这 个 荧 光 基 团 提 供 的 荧 光 信 号 可 反 应 特 异 扩 增 的 情 况 如 果 使 用 可 与 双 链 DNA 结 合 的 SYBR Green I, 此 时 荧 光 信 号 的 增 加 也 同 样 可 以 指 示 扩 增 情 况 特 异 性 可 以 通 过 熔 解 曲 线 来 分 析 ((Power SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol, P/N 4367218) ), 或 对 PCR 产 物 进 行 凝 胶 分 析 Rn(Normalized reporter) 是 荧 光 报 告 基 团 的 荧 光 发 射 强 度 与 参 比 染 料 的 荧 光 发 射 强 度 的 比 值 阈 值 用 于 确 定 实 时 定 量 分 析 中 的 CT 值 的 某 个 Rn 水 平 这 个 水 平 设 定 得 比 基 线 高, 又 在 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 区 域 内 足 够 低 阈 值 是 与 扩 增 图 相 交 确 定 CT 值 ( 阈 值 循 环 ) 的 线 关 于 如 何 设 定 阈 值, 请 从 ABI 公 司 的 网 站 www.appliedbiosystems.com 上 下 载 Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System 阈 值 循 环 (CT) 荧 光 穿 过 阈 值 时 的 循 环 数 (ABI 供 稿 生 物 通 译 ) 2008 年 9 月 10 日 四 十 期 第 16 页, 共 21 页 下 一 页 返 回