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66 Na + Ca 2+ ph 康 俊 霞 1, 康 永 锋 1,2, 包 斌 1,2, 陈 志 华 1, 谢 晶 1, 吴 文 惠 1,2, * (1. 上 海 海 洋 大 学 食 品 学 院, 上 海 201306; 2. 上 海 海 洋 大 学 海 洋 科 学 研 究 院, 上 海 201306) 通 过 差 示 扫 描 量 热 法 (DSC) 对 不 同 浓 度 的 Na + Ca 2+ 和 ph 值 对 鲸 鲨 皮 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 皮 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 进 行 系 统 研 究 I 型 胶 原 蛋 白 的 特 征 性 紫 外 吸 收 波 长 位 于 233.05nm,Ⅱ 胶 原 蛋 白 的 特 征 性 紫 外 吸 收 波 长 位 于 232.90nm 和 277.88nm 研 究 胶 原 蛋 白 的 聚 集 动 力 学 曲 线, 发 现 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 浊 度 随 时 间 变 化 趋 势 均 呈 S 型, 其 聚 集 过 程 均 可 分 为 初 始 阶 段 和 生 长 阶 段 及 趋 于 稳 定 阶 段 通 过 高 灵 敏 度 差 示 量 热 扫 描 仪 对 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 热 稳 定 性 进 行 表 征 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 温 度 为 40, 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 为 62 较 低 浓 度 的 Na + Ca 2+ 使 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 温 度 降 低, 这 可 能 是 由 于 金 属 离 子 的 加 入 影 响 了 胶 原 蛋 白 分 子 之 间 带 电 氨 基 酸 残 基 的 相 互 排 斥 作 用, 降 低 了 胶 原 蛋 白 的 热 稳 定 性 ; 较 高 浓 度 的 Na + Ca 2+ 使 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 变 性 温 度 持 续 降 低, 这 可 能 是 由 于 金 属 离 子 与 胶 原 蛋 白 分 子 竞 争 水 分 子, 从 而 导 致 胶 原 蛋 白 的 不 稳 定 ; 继 续 增 加 Na + Ca 2+ 金 属 离 子 的 浓 度 时,I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 变 性 温 度 由 于 发 生 盐 析 而 增 加 I 型 胶 原 蛋 白 在 强 酸 强 碱 处 理 后, 蛋 白 的 吸 热 变 性 峰 变 小 甚 至 消 失 鲸 鲨 ; 胶 原 蛋 白 ; 热 变 性 温 度 ; 聚 集 动 力 学 曲 线 ; 差 示 扫 描 量 热 分 析 Effects of Metal Ions and ph on Thermal Stability of Whale Sharp (Rhincodon typus) Skin Collagen KANG Jun-xia 1, KANG Yong-feng 1,2,BAO Bin 1,2,CHEN Zhi-hua 1,XIE Jing 1, WU Wen-hui 1,2, * (1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Institute of Marine Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China) Abstract:Differential scanning calorimetry (DSC) analysis was used to systematically study the effect of different concentrations of Na +, Ca 2+ and H + on the thermal denaturation temperatures of type I and type II collagens from whale sharp skin. The type I collagen had maximum absorption at 233.05 nm and the type II collagen at 232.90 nm and 277.88 nm. Aggregation dynamic analysis indicated that the turbidity of the type I and II collagens exhibited an S-shaped curve with 3 stages including initial stage, growth stage and stable stage. The thermal stability of the two types of collagens was examined by highsensitivity differential scanning calorimetry. The thermal denaturation temperatures of the type I and II collagens were at 40 and 62, respectively. Their thermal denaturation temperatures were reduced at low concentrations of Na + and Ca 2+. These results indicated that metal ions could affect charged residues in native collagen molecules, thus leading to the reduction in thermal denaturation temperature. At intermediate concentrations of Na + and Ca 2+, the thermal denaturation temperature of type I and II collagens revealed a continuous reduction, which suggested that the loss of thermal stability might be due to the competition for water molecules between metal ions and collagen. High concentrations of Na + and Ca 2+ resulted in an increase in collagen denaturation temperature due to protein salting out. Extreme ph treatment caused partial denaturation of collagen and the denaturation peak became smaller or even disappeared. Key words:rhincodon typus;collagen;thermal denaturation;aggregation dynamic curve;differential scanning calorimetry(dsc) 中 图 分 类 号 : Q518.4;S986.2 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :1002-6630(2011)13-0066-05 收 稿 日 期 :2010-11-02 基 金 项 目 : 上 海 市 自 然 科 学 基 金 项 目 (10ZR1413800); 上 海 市 重 点 学 科 建 设 项 目 (J50704) 作 者 简 介 : 康 俊 霞 (1986 ), 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 为 海 洋 天 然 产 物 化 学 E-mail:kangkang245683396@126.com * 通 信 作 者 : 吴 文 惠 (1965 ), 男, 教 授, 博 士, 研 究 方 向 为 海 洋 天 然 产 物 化 学 E-mail:whwu@shou.edu.cn

基 础 研 究 食 品 科 学 2011, Vol. 32, No. 13 67 胶 原 蛋 白 (collagen) 主 要 存 在 于 动 物 的 结 缔 组 织 如 皮 肤 骨 软 骨 牙 齿 肌 腱 韧 带 而 具 有 一 定 的 结 构 与 机 械 力 学 性 质 如 张 力 强 度 拉 力 黏 弹 力 等 以 达 到 支 持 保 护 等 功 能, 并 具 有 连 接 各 种 组 织 和 支 撑 起 [1-3] 人 体 结 构 的 作 用 由 于 胶 原 蛋 白 具 有 较 好 的 功 能 性 而 广 泛 的 被 应 用 于 医 药 美 容 食 品 化 工 照 相 材 料 饲 料 等 行 业 近 年 来, 在 蛋 白 质 溶 液 体 系 热 力 学 参 量 的 测 量 中 差 示 扫 描 量 热 法 (differential scanning calorimetry,dsc) 的 [4] 应 用 十 分 广 泛 von Hippel 等 报 道 了 中 等 浓 度 的 中 性 盐 对 胶 原 蛋 白 稳 定 性 的 影 响, 发 现 变 性 温 度 与 离 子 浓 度 呈 线 性 相 关, 不 同 的 盐 减 少 或 增 加 胶 原 蛋 白 的 稳 定 性 与 [5] 元 素 在 周 期 表 的 位 置 有 关 Regina 等 通 过 高 灵 敏 度 差 示 量 热 扫 描 仪 对 小 牛 皮 I 型 胶 原 蛋 白 在 NaCl NaSCN NaH2PO4 Na2HPO4 Na2SO4 NH4Cl CaCl2 等 多 种 盐 离 子 中 的 变 性 温 度 进 行 了 研 究, 发 现 在 浓 度 低 于 20mmol/L 范 围 内, 这 些 盐 离 子 都 降 低 小 牛 皮 I 型 胶 原 蛋 白 变 性 温 度 ; 约 在 20~500mmol/L 范 围 内, 不 同 的 盐 减 少 或 增 加 的 胶 原 蛋 白 稳 定 性 与 元 素 在 周 期 表 的 位 置 有 [6] 关 钟 朝 辉 等 采 用 旋 转 流 变 仪 系 统 考 察 了 浓 度 ph 值 剪 切 速 率 NaCl CaCl2 丙 三 醇 乙 醇 和 保 温 时 间 对 酶 溶 分 离 的 草 鱼 鱼 鳞 胶 原 蛋 白 黏 度 的 影 响, 并 通 [7] 过 黏 度 变 化 确 定 了 胶 原 蛋 白 的 变 性 温 度 Eva 等 用 DSC 的 方 法 研 究 了 环 状 肠 道 菌 素 As-48 的 热 变 性, 发 现 As-48 在 低 的 ph 值 及 离 子 强 度 下 有 强 的 热 稳 定 性, 即 使 温 度 [8] 在 100 以 上 其 结 构 也 不 会 被 破 坏 Takashi 等 研 究 了 疏 水 环 境 对 I 型 胶 原 蛋 白 稳 定 性 的 影 响, 发 现 由 有 机 化 合 物 加 入 而 造 成 的 疏 水 性 环 境 可 以 增 加 骨 胶 原 蛋 白 的 稳 定 性 及 黏 附 性 对 海 洋 生 物 来 源 的 不 同 种 类 的 胶 原 蛋 白 热 稳 定 性 的 研 究, 尤 其 是 通 过 DSC 研 究 离 子 强 度 对 鲨 鱼 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 温 度 的 影 响, 国 内 外 还 未 见 报 道 本 实 验 通 过 DSC 法 对 不 同 浓 度 的 Na + Ca 2+ 和 ph 值 对 鲸 鲨 皮 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 皮 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 进 行 系 统 地 研 究, 以 期 为 胶 原 蛋 白 在 组 织 工 程 材 料 中 的 应 用 提 供 参 考 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 试 剂 鲸 鲨 皮 I 型 胶 原 蛋 白 (Rhincodon typus type Ⅰ collagen) [9] 和 鲸 鲨 皮 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 (Rhincodon typus type Ⅱ collagen) [10] 电 泳 纯, 为 本 实 验 室 制 备 DSC 样 品 铝 皿 梅 特 勒 - 托 利 多 公 司 ;Tris-HCl 盐 美 国 Sigma 公 司 ; 其 他 化 学 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 1.2 仪 器 与 设 备 DSC823e 差 示 扫 描 量 热 仪 ( 配 有 Mettler Toledo Stare 系 统 ) 梅 特 勒 - 托 利 多 公 司 ;UV-2450 紫 外 - 可 见 分 光 光 度 计 日 本 岛 津 公 司 ;PHS-3C 精 密 ph 计 上 海 精 密 科 学 仪 器 公 司 1.3 胶 原 蛋 白 紫 外 光 谱 特 性 的 分 析 方 法 将 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 样 品 溶 解 于 0.5mol/L 醋 酸 溶 液 中, 分 别 配 制 成 2g/L 胶 原 溶 液 以 0.5mol/L 醋 酸 溶 液 为 空 白 在 波 长 200~400nm 近 紫 外 光 区 用 UV- 2450 紫 外 分 光 光 度 计 进 行 快 速 扫 描 1.4 胶 原 蛋 白 的 浊 度 与 聚 集 特 性 的 分 析 方 法 参 照 文 献 [11] [7] 的 浊 度 测 定 方 法 进 行 将 胶 原 蛋 白 溶 于 低 浓 度 磷 酸 缓 冲 溶 液 (ph 7.0), 使 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 质 量 浓 度 分 别 为 5mg/mL 和 20mg/mL 置 于 30 水 浴 中, 每 隔 3h 测 其 波 长 300nm 处 吸 光 度, 以 表 征 溶 液 中 胶 原 蛋 白 是 否 聚 集 1.5 胶 原 蛋 白 热 稳 定 性 的 测 定 用 去 离 子 水 配 制 质 量 浓 度 为 20mg/mL 的 胶 原 蛋 白 溶 液, 溶 液 中 NaCl CaC12 浓 度 分 别 为 10 100 200 300 400 1000mmol/L, 用 DSC 测 定 不 同 浓 度 的 NaCl 和 CaC12 对 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 配 制 质 量 浓 度 为 20mg/mL 的 胶 原 蛋 白 溶 液, 然 后 用 5mol/L 乙 酸 及 6mol/L 氢 氧 化 钠 调 节 其 ph 值 为 3 和 11, 用 DSC 测 定 ph 值 对 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 所 有 样 品 均 是 在 起 始 温 度 为 25, 终 止 温 度 为 125, 温 度 变 化 率 为 10 /min 的 条 件 下 进 行 DSC 扫 描 实 验 取 T d 为 热 变 性 温 度,T p 为 熔 融 温 度 2 结 果 与 分 析 2.1 鲸 鲨 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 紫 外 光 谱 特 性 蛋 白 质 分 子 中 有 生 色 基 团 能 够 吸 收 一 定 波 长 范 围 的 紫 外 光, 胶 原 蛋 白 含 有 酪 氨 酸 和 苯 丙 氨 酸, 这 两 种 氨 基 酸 具 有 敏 感 的 发 色 团, 它 们 的 最 大 紫 外 吸 收 波 长 分 别 为 283nm 和 251nm [12] 在 200~400nm 的 波 长 范 围 内 对 鲸 鲨 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 稀 溶 液 进 行 了 扫 描, 结 果 如 图 1 2 所 示 1.800 吸 光 度 1.500 233.05 1.000 0.500 0.000 200 250 300 350 400 波 长 /nm 图 1 鲸 鲨 皮 I 型 胶 原 蛋 白 的 紫 外 吸 收 光 谱 图 Fig.1 UV-visible spectrum of type I collagen from whale sharp skin

68 吸 光 度 1.800 1.500 232.9 1.000 0.500 277.88 0.000 200 250 300 350 400 波 长 /nm 图 2 鲸 鲨 皮 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 紫 外 吸 收 光 谱 图 Fig.2 UV-visible spectrum of type II collagen from whale sharp skin 2.3 鲸 鲨 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 分 析 当 温 度 升 高 到 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 温 度 以 上 时, 胶 原 蛋 白 吸 收 能 量 超 过 分 子 间 作 用 力 时, 分 子 中 的 氢 键 结 构 发 生 变 形, 溶 剂 水 分 子 作 为 氢 键 的 受 体 或 供 体, 与 蛋 白 质 分 子 骨 架 及 侧 链 上 的 基 团 竞 争 形 成 氢 键, 最 终 导 致 胶 原 蛋 白 三 股 螺 旋 链 被 破 坏, 使 得 包 埋 在 胶 原 蛋 白 结 构 内 部 的 疏 水 性 基 团 暴 露 出 来, 易 于 聚 集 变 性, 胶 原 [6,16] 蛋 白 链 从 伸 展 的 纤 维 状 态 转 变 成 无 规 则 卷 曲 状 态 A 从 鲸 鲨 I 型 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 紫 外 扫 描 光 谱 图 可 以 观 察 到, 其 紫 外 最 大 吸 收 波 长 分 别 在 233.05nm 和 232.90nm, 属 于 胶 原 蛋 白 的 典 型 特 征 紫 外 吸 收 光 谱, 表 明 鲸 鲨 胶 原 蛋 白 芳 香 族 氨 基 酸 含 量 较 少 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 在 277.88nm 有 非 常 明 显 的 紫 外 吸 收 峰, 这 可 能 是 部 分 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 嵌 有 糖 链 导 致 吸 收 峰 部 分 偏 移 2.2 鲸 鲨 胶 原 蛋 白 的 聚 集 动 力 学 曲 线 分 析 T d Ti T f Ts T r T p 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 B A300nm 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 T f T d Ti T p 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 时 间 /h 图 3 鲸 鲨 皮 胶 原 蛋 白 聚 集 动 力 学 曲 线 Fig.3 Aggregation kinetic curves of type I and II collagens from whale sharp skin 在 蛋 白 质 研 究 中, 浊 度 常 作 为 蛋 白 质 聚 集 的 指 标, [13] 蛋 白 质 聚 集 后 颗 粒 直 径 变 大, 浊 度 升 高 因 此 测 定 反 应 过 程 中 溶 液 的 吸 光 度 可 以 动 态 地 跟 踪 聚 集 过 程 中 聚 集 体 的 大 小 随 时 间 变 化 趋 势 如 图 3 所 示, 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 浊 度 随 时 间 变 化 趋 势 均 呈 S 型, 其 聚 集 过 程 均 可 分 为 初 始 阶 段 和 生 长 阶 段 及 趋 于 稳 定 阶 [14] 段 这 与 Sai 等 报 道 的 青 蛙 皮 酸 溶 性 胶 原 蛋 白 和 经 胃 蛋 白 酶 处 理 后 青 蛙 皮 酸 溶 性 胶 原 蛋 白 的 聚 集 特 性 以 及 [15] Sivakumar 等 报 道 的 鱿 鱼 和 鲨 鱼 软 骨 胶 原 蛋 白 的 聚 集 动 力 学 曲 线 相 类 似 随 着 质 量 浓 度 的 增 大, 溶 液 中 胶 原 蛋 白 分 子 增 多, 其 分 子 聚 集 的 机 会 增 多 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 (20mg/mL) 其 质 量 浓 度 远 大 于 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 (5mg/mL), 继 续 放 置 24h 后 I 型 胶 原 蛋 白 会 形 成 不 规 则 的 絮 状 聚 集 体, 而 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 并 未 出 现 这 可 能 是 由 于 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 嵌 有 糖 链, 阻 碍 了 胶 原 蛋 白 分 子 的 进 一 步 聚 集 T s. 变 性 外 推 起 始 温 度 ;T r. 外 推 终 止 温 度 ;T d. 变 性 温 度 ; T i. 熔 融 外 推 起 始 温 度 ;T f. 熔 融 外 推 终 止 温 度 ;T p 熔 融 的 峰 温 ;A. 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 ;B. 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 图 4 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 DSC 曲 线 Fig.4 DSC curves of type I and II collagens from whale sharp skin 从 图 4 可 知, 在 升 温 过 程 中 鲸 鲨 I 型 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 均 有 两 个 吸 热 峰, 此 时 ΔH 为 正, 对 温 度 敏 感 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 第 1 个 吸 热 峰 位 于 温 度 约 为 40 处, 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 第 1 个 吸 热 峰 位 于 温 度 约 为 62 处, 这 是 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 过 程 第 2 个 吸 热 峰 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 位 于 温 度 约 为 114 处, 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 位 于 温 度 约 为 115 处, 这 是 热 变 性 后 的 胶 原 蛋 白 进 一 步 升 温 热 降 解 过 程 从 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 DSC 曲 线 可 以 明 显 看 出,Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 变 性 温 度 要 高 于 I 型 胶 原 蛋 白 这 是 由 于 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 连 接 有 糖 链 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 通 过 其 糖 对 多 肽 链 骨 架 的 氢 键 作 用, 从 [17] 而 使 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 空 间 构 象 更 加 稳 定 这 与 陈 慧 等 所 报 道 的 氧 化 乳 糖 自 身 的 耐 热 性, 在 受 热 时 可 支 撑 胶 原 的 组 织 结 构 及 构 象 转 变, 从 而 使 胶 原 蛋 白 的 耐 热 稳 定 性 增 强 的 结 论 相 类 似 这 与 蛋 白 经 糖 基 化 其 稳 定 性 [12,18] 增 强 的 结 论 相 一 致

基 础 研 究 食 品 科 学 2011, Vol. 32, No. 13 69 2.4 离 子 强 度 对 鲸 鲨 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 2.4.1 Na + 和 Ca 2+ 对 鲸 鲨 I 型 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 1mol/L NaCl 0mol/L NaCl 0.1mol/L NaCl [5] 白 这 与 Regina 等 报 道 的 小 牛 皮 胶 原 蛋 白 在 盐 离 子 中 [6] 的 热 稳 定 性 变 化 及 钟 朝 辉 等 所 研 究 的 草 鱼 皮 胶 原 蛋 白 变 性 温 度 受 NaCl CaC12 浓 度 的 影 响 相 一 致 这 也 证 明 了 [19] Oobatake 等 所 报 道 的 蛋 白 质 和 溶 剂 的 相 互 作 用 在 决 定 天 然 蛋 白 质 的 构 象 和 稳 定 性 中 起 重 要 作 用 2.4.2 ph 值 对 鲸 鲨 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 图 5 Na + 浓 度 对 I 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 Fig.5 Effect of NaCl concentration on thermal denaturation temperature of type I collagen from whale sharp skin 热 变 性 热 变 性 64 60 56 52 48 44 40 36 32 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 75 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 70 65 60 NaCl 55 CaCl2 50 0 200 400 600 800 1000 浓 度 /(mmol/l) NaCl CaCl2 0 200 400 600 800 1000 浓 度 /(mmol/l) 图 6 Na + 和 Ca 2+ 离 子 强 度 对 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 Fig.6 Effect of Na + intensity and Ca 2+ ion intensity on thermal denaturation temperature of collagen from whale sharp skin 由 图 5 6 可 知, 在 相 对 低 浓 度 NaCl CaC12 溶 液 中 I 型 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 均 降 低, 这 可 能 是 由 于 盐 离 子 的 加 入 影 响 了 胶 原 蛋 白 分 子 之 间 带 电 氨 基 酸 [5-6] 残 基 的 相 互 排 斥 作 用, 降 低 了 胶 原 蛋 白 的 热 稳 定 性 当 进 一 步 加 大 NaCl CaC12 浓 度,I 型 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 变 性 温 度 仍 降 低, 这 可 能 是 由 于 NaCl CaC12 与 胶 原 蛋 白 分 子 骨 架 及 侧 链 上 的 基 团 竞 争 水 分 子 形 成 氢 键, 这 使 得 胶 原 蛋 白 间 的 氢 键 易 于 被 破 坏 当 继 续 增 加 盐 离 子 的 浓 度 时 胶 原 蛋 白 的 变 性 温 度 会 迅 速 增 加, 在 这 个 浓 度 范 围 内 胶 原 蛋 白 发 生 了 盐 析 和 聚 集, 其 热 稳 定 性 与 高 稳 定 性 的 胶 原 纤 维 相 类 似, 要 明 显 高 于 溶 解 态 的 胶 原 蛋 A B C 40 50 60 70 80 90 100 110 120 A.Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 的 DSC 曲 线 ;B. ph3 的 酸 溶 液 处 理 后 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 的 DSC 曲 线 ;C. ph11 的 碱 溶 液 处 理 后 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 的 DSC 曲 线 图 7 ph 值 对 鲸 鲨 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 DSC 的 影 响 Fig.7 Effect of ph on DSC curve of type I collagen from whale sharp skin 差 示 扫 描 量 热 仪 通 过 测 量 蛋 白 变 性 时 的 热 量, 直 观 反 映 蛋 白 的 变 性 过 程 只 要 条 件 一 定, 蛋 白 在 DSC 图 [20] 上 有 固 定 的 吸 热 峰 如 果 蛋 白 在 测 定 前 已 经 变 性, 则 在 DSC 图 上, 蛋 白 的 吸 热 峰 变 小 位 移 或 消 失 如 图 9B C 所 示 在 加 热 过 程 中 强 酸 强 碱 处 理 后 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 的 吸 热 变 性 峰 消 失, 其 原 因 可 能 是 在 极 端 ph 值 条 件 下, 胶 原 蛋 白 分 子 表 面 的 负 电 荷 增 多, 电 荷 间 强 烈 的 排 斥 作 用 使 得 埋 藏 在 胶 原 蛋 白 分 子 内 部 的 疏 水 基 团 暴 露, 最 终 导 致 胶 原 蛋 白 发 生 变 性 酸 碱 环 境 使 蛋 白 的 [21] 分 子 结 构 和 功 能 性 质 发 生 一 定 变 化 3 结 论 鲸 鲨 皮 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 皮 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 紫 外 最 大 吸 收 波 长 比 较 接 近, 分 别 为 233.05nm 和 232.90nm, 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 特 征 性 吸 收 峰 位 于 277.88nm, 该 吸 收 峰 的 形 成 与 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 连 接 糖 链 有 关 这 些 特 征 性 吸 收 峰 可 作 为 鉴 定 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 指 标 之 一 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 浊 度 随 时 间 变 化 趋 势 均 呈 S 型 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 其 浓 度 远 大 于 I 型 胶 原 蛋 白 浓 度 的 情 况 下, 放 置 一 段 时 间 后, 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 会 形 成 不 规 则 的 絮 状 聚 集 体 而 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 并 未 出 现 推 测 连 接 于 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 分 子 结 构 上 的 糖 链 阻 碍 了 分 子 聚 集 而 使 得 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 溶 液 稳 定 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 温 度 受 分 子 结 构 和 环 境 条 件 的 影 响, 连 接 糖 链 的 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 比 不 连 接 糖 链 的 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 和 热 变 性 温 度 高, 具 有 相 对 稳 定 的 分 子 结 构 基 础 ; 无 论 含 有 糖 链 或 不 含 有 糖 链 的 胶 原 蛋 白 其 热 变

70 性 温 度 受 高 价 金 属 离 子 的 影 响 比 低 价 金 属 离 子 的 影 响 大, 金 属 离 子 对 不 含 有 糖 链 的 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 温 度 的 影 响 比 含 有 糖 链 的 胶 原 蛋 白 的 影 响 大 ;I 型 胶 原 蛋 白 在 强 酸 强 碱 处 理 后, 蛋 白 的 吸 热 变 性 峰 变 小 甚 至 消 失 酸 碱 环 境 使 蛋 白 的 分 子 结 构 和 功 能 性 质 发 生 一 定 变 化 ; 外 界 环 境 条 件 对 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 要 通 过 胶 原 蛋 白 分 子 结 构 的 变 化 发 挥 作 用 参 考 文 献 : [1] 鸿 巢 章 二, 桥 本 用 久. 水 产 利 用 化 学 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社, 1994: 50. [2] 姚 理 荣, 林 红, 陈 宇 岳. 胶 原 蛋 白 纤 维 的 性 能 与 应 用 [J]. 纺 织 学 报, 2006, 27(9): 106-107. [3] 李 国 英, 张 忠 楷. 胶 原 的 形 态 分 类 及 其 生 理 机 能 [J]. 陕 西 科 技 大 学 学 报, 2004, 22(3): 80-83. [4] von HIPPEL P H, WONG K Y. The effect of ions on the kinetics of formation and the stability of the collagen-fold[j]. Biochemistry, 1962, 1(4): 664-674. [5] REGINA K P, RUMIANA K. Thermal stability of calf skin collagen type I in salt solutions[j]. Biochimica et Biophysica Acta, 1996, 1297 (2): 171-181. [6] 钟 朝 辉, 李 广 美. 草 鱼 鱼 鳞 酶 溶 性 胶 原 蛋 白 粘 度 特 性 及 变 性 温 度 研 究 [J]. 食 品 与 发 酵 工 业, 2006, 32(6): 64-67. [7] EVA S C, VLADIMIR V F, GALVEZ A, et al. The denaturation of circular enterocin AS-48 by urea and guanidinium hydrochloride[j]. Biochimica ET Biophysica Acta, 2002, 1598: 98-107. [8] TAKASHI N, TOMOHIRO M, KAORI S, et al. New Index for the stability of a type I collagen affected by hydrophobic environment[j]. Detal Materials, 2007, 26(3): 373-381. [9] 吴 文 惠, 姝 亚, 包 斌, 等. 温 和 条 件 下 分 离 马 胶 鲨 皮 胶 原 蛋 白 的 方 法 及 其 部 分 特 性 研 究 [J]. 中 华 航 海 医 学 与 高 气 压 医 学 杂 志, 2007, 14 (3): 133-136. [10] 王 彦 宏, 朱 平, 冷 南, 等. Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 提 取 纯 化 和 鉴 定 [J]. 第 四 军 医 大 学 学 报, 2002, 23(19): 1820-1821. [11] 李 卫 林, 曹 健, 汤 克 勇. 胶 原 蛋 白 结 构 和 稳 定 性 关 系 研 究 [J]. 中 国 皮 革, 2005, 34(23): 14-16. [12] LIU H Y, LI D, GUO S D. Studies on collagen from the skin of channel catfish(ictalurus punctaus)[j]. Food Chemistry, 2007, 101: 621-625. [13] THORARINSDOTTIR K A, ARASON S, GEIRSDOTTIR M B, et a1. Changes in myofibrillar proteins dsuring processing of salted cod (Gadus morhua) as determined by electrophoresis and differential scanning calorimetry[j]. Food Chemistry, 2002, 77(3): 377-385. [14] SAI K P, BABU M. Studies on Rana tigerina skin collagen[j]. Comparative Biochemistry and Part and Molecular Biology, 2001, 128: 81-90. [15] SIVAKUMAR P, CHANDRAKASAN G. Occurrence of a novel collagen with three distinct chains in the cranial cartilage of the squid Sepia officinalis: comparison with shark cartilage collagen[j]. Biochimica et Biophysica Acta, 1998, 1381(2): 161-169. [16] TAKAKI K, DAISUKE LH, SHINICHI A, et al. Self-complementary peptides for the formation of collagen-like triple belical supramolecules [J]. Bioorganic Medicinal Chemistry, 2005, 23(15): 5230-5233. [17] 陈 慧, 王 亚 娟, 单 志 华. 氧 化 乳 糖 - 金 属 配 合 物 提 高 胶 原 的 稳 定 性 [J]. 皮 革 科 学 与 工 程, 2007, 17(5): 81-90. [18] 李 兴, 林 哲 甫. 多 元 醇 和 糖 类 对 菠 萝 蛋 白 酶 热 稳 定 性 的 影 响 [J]. 中 国 生 物 制 品 学 杂 志, 2001, 14(4): 243-244. [19] OOBATAKE M, OOI T. Hydration and heat stability effects on protein unfolding[j]. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 59 (3): 237-284. [20] HORDUR G K, HERBERT O H. Changes in conformation and subunit assembly of cod myosin at low and high ph and subsequent refolding [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(24): 7187-7196. [21] 付 湘 晋, 许 时 婴. 酸 碱 处 理 对 鲢 鱼 肌 原 纤 维 蛋 白 热 变 性 聚 集 胶 凝 性 质 的 影 响 [J]. 食 品 科 学, 2008, 29(6): 100-103.