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中 国 试 剂 网 3.8.8.16 流 式 细 胞 仪 在 睡 眠 性 阵 发 性 血 红 蛋 白 尿 的 诊 断 中 的 应 用 一. 睡 眠 性 阵 发 性 血 红 蛋 白 尿 PNH 睡 眠 性 阵 发 性 血 红 蛋 白 尿 (PNH) 是 一 种 获 得 性 造 血 干 细 胞 异 常, 临 床 主 要 表 现 为 骨 髓 丧 失 造 血 功 能 血 栓 慢 性 溶 血 性 贫 血 急 性 发 作 PNH 的 发 病 率 很 低, 发 病 原 因 不 详, 可 能 与 再 生 障 碍 性 贫 血 有 关 系 PNH 的 临 床 表 现 不 一, 疾 病 进 程 多 变, 给 临 床 的 诊 断 治 疗 和 疾 病 研 究 带 来 很 多 困 难 最 近 15 年, 在 PNH 的 细 胞 和 分 子 生 物 学 研 究 中 取 得 了 重 要 进 展, 定 义 了 导 致 PNH 异 常 表 现 的 分 子 缺 陷 而 使 用 流 式 细 胞 仪 进 行 PNH 诊 断 分 型, 是 PNH 研 究 的 又 一 里 程 碑 ( 一 ) 历 史 回 顾 Strubing 早 在 一 个 世 纪 之 前, 就 第 一 次 报 告 了 PNH, 症 状 为 溶 血 性 贫 血, 伴 有 夜 间 血 红 蛋 白 尿 50 年 后,Ham 和 Dingle 证 明 了 PNH 患 者 的 红 细 胞 在 血 清 酸 化 条 件 下, 易 发 生 溶 血, 这 就 是 现 在 普 遍 使 用 的 Ham 实 验, 用 来 诊 断 PNH 不 久, 又 发 现 PNH 的 溶 血 是 由 于 患 者 的 红 细 胞 对 补 体 敏 感 进 而 又 发 现 PNH 患 者 的 中 性 粒 细 胞 和 血 小 板 也 有 异 常 Dacie 在 1963 年 提 出 了 PNH 是 由 于 干 细 胞 突 变 造 成 的 获 得 性 克 隆 异 常 的 假 说 后 来, 通 过 对 两 位 患 有 PNH 的 妇 女 的 异 构 酶 葡 萄 糖 6 磷 酸 脱 氢 酶 的 研 究, 证 实 了 这 一 假 说 PNH 红 细 胞 中 只 含 有 一 种 异 构 酶, 而 病 人 正 常 红 细 胞 中 含 有 两 种 异 构 酶 ( 二 ) 生 化 缺 陷 1983 年,PNH 红 细 胞 的 生 化 研 究 表 明,PNH 缺 乏 一 种 被 称 为 延 迟 加 速 因 子 DAF 的 补 体 调 控 蛋 白 这 种 蛋 白 抑 制 补 体 C3 转 换 酶 的 形 成, 并 通 过 glycophosphatidylinositol(gpi) 的 锚 定 作 用 ( 翻 译 后 处 理 步 骤 ) 固 定 在 细 胞 膜 上 进 一 步 研 究 表 明,PNH 细 胞 缺 少 这 种 通 过 GPI 与 细 胞 膜 的 正 常 连 接 这 意 味 着, GPI 锚 定 蛋 白 的 合 成 异 常, 是 PNH 的 起 因 PNH 细 胞 系 的 GPI 合 成 的 生 化 通 路 也 异 常, 这 种 异 常 发 生 在 通 路 的 第 一 阶 段 的 N-acetylglucosamine 到 phosphatidylinositol 的 转 移 过 程 中 ( 三 ) 分 子 缺 陷 1993 年 Miyata 等 发 现 了 PHN 的 基 因 缺 陷 通 过 对 一 系 列 复 杂 的 补 体 和 转 染 研 究, 证 实 了 PNH 细 胞 系 的 phosphatidylinositol glycan complementation class A (pig-a) 基 因 表 达 了 错 误 的 GPI 相 关 的 抗 原 对 pig-a 基 因 进 行 序 列 分 析, 发 现

迄 今 为 止, 所 有 报 导 过 的 PNH 病 人 都 有 pig-a 基 因 的 突 变 由 于 这 种 突 变 发 生 在 体 细 胞, 所 以 表 现 不 一 致, 并 且 在 整 个 pig-a 编 码 区 域 中, 都 有 发 生 突 变 的 可 能 这 些 突 变 包 括 缺 失 插 入 和 点 突 变 所 有 的 缺 失 和 插 入 部 分 都 很 小 ( 只 有 一 到 二 个 ), 导 致 漂 移 突 变, 产 生 了 无 功 能 产 物 漂 移 突 变 导 致 了 细 胞 完 全 缺 乏 GPI 锚 蛋 白 (III 类 细 胞 ) 另 一 部 分 突 变 是 点 突 变, 保 留 部 分 活 性, 可 以 合 成 少 部 分 的 GPI 锚 蛋 白 这 种 突 变 细 胞 表 达 部 分 GPI 锚 蛋 白 (II 类 细 胞 ) 由 于 pig-a 基 因 位 于 X 染 色 体, 每 个 细 胞 只 有 一 个 功 能 性 pig-a 基 因 ( 女 性 X 染 色 体 失 活 ), 因 此, 单 一 突 变 会 造 成 GPI 缺 失 表 型 相 反, 每 个 细 胞 中 都 有 两 个 具 有 活 性 的 常 染 色 体 pig 基 因, 只 有 常 染 色 体 上 两 个 等 位 基 因 都 发 生 突 变, 才 会 产 生 PNH 症 状 ( 四 ) 流 式 细 胞 仪 分 析 使 用 分 子 生 物 学 已 经 成 功 发 现 了 PNH 的 基 因 缺 陷, 而 使 用 单 克 隆 抗 体 和 流 式 细 胞 仪 技 术 则 是 发 现 诊 断 PNH 表 型 异 常 的 重 要 手 段, 具 有 同 样 的 重 要 意 义 1985 年, 两 个 各 自 独 立 的 小 组 使 用 流 式 细 胞 仪 和 DAF(CD55) 抗 体, 调 查 PNH 患 者, 发 现 了 缺 乏 DAF 的 红 细 胞 粒 细 胞 单 核 细 胞 淋 巴 细 胞 和 血 小 板 这 都 证 明 PNH 的 多 系 特 征, 有 力 支 持 PHN 是 克 隆 性 干 细 胞 疾 病 的 学 说 进 一 步 分 析 PNH 病 人 骨 髓 造 血 干 细 胞, 发 现 也 缺 乏 DAF 的 表 达 之 后, 随 着 新 的 GPI 锚 蛋 白 单 克 隆 抗 体 的 出 现,PNH 的 研 究 又 进 一 步 深 入 Van der Schoot 等 发 现 PNH 患 者 中 性 粒 细 胞 缺 乏 CD16 CD24 和 CD67( 后 来 有 更 名 为 CD66b) 同 时, 他 们 第 一 次 证 明 在 PNH 诊 断 中, 流 式 细 胞 仪 检 测 优 于 Ham 实 验 在 研 究 中, 他 们 分 析 了 16 例 再 生 障 碍 性 贫 血 的 病 人, 在 3 例 病 人 的 粒 细 胞 中 发 现 了 少 量 PNH 克 隆, 而 这 3 例 病 人 Ham 实 验 均 阴 性 后 来 有 人 又 进 一 步 证 实 了 一 些 严 重 再 生 障 碍 性 贫 血 的 病 人 有 GPI 缺 乏 的 粒 细 胞 和 单 核 细 胞, 而 红 细 胞 可 以 正 常 于 是, 流 式 细 胞 仪 诊 断 PNH 的 可 靠 方 法 很 快 建 立 起 来, 同 时, 还 用 来 判 断 PNH 的 疾 病 程 度 和 PNH 克 隆 的 造 血 细 胞 系 别 来 源 现 在, 尽 管 目 前 使 用 的 流 式 细 胞 仪 检 测 技 术 在 方 法 学 和 抗 体 选 择 上 还 没 有 统 一, 但 它 已 经 取 代 了 Ham 实 验, 成 为 了 PNH 诊 断 的 金 标 准 使 用 流 式 细 胞 仪 可 以 发 现 Ham 实 验 阴 性 的 再 生 障 碍 性 贫 血 病 人 中 存 在 的 少 量 PNH 细 胞, 这 可 以 将 PNH 分 为 两 种 情 况 :(1) 溶 血 性 PNH, 特 征 是 显 性 溶 血 性 贫 血, 同 时 有 血 红 蛋 白 尿 值 得 注 意 的 是, 这 组 病 人 中, 有 50% 发 生 静 脉 血 栓, 这 是 导 致 病 人 死 亡 的 主 要 原 因 (2) 再 生 不 良 性 PNH, 可 以

检 出 GPI 缺 乏 的 造 血 细 胞, 没 有 显 性 溶 血, 但 可 能 有 其 它 症 状, 如 再 生 障 碍 性 贫 血 白 细 胞 减 少 症 或 血 小 板 减 少 症 这 组 病 人 中, 有 10% 死 于 再 生 障 碍 性 贫 血 很 多 病 人 由 于 同 时 具 有 以 上 两 组 的 症 状, 而 不 能 单 纯 分 类 归 于 某 一 组 有 一 部 分 病 人 有 再 生 不 良 性 PNH, 然 后 进 展 为 溶 血 性 PNH 另 一 小 部 分 病 人 但 在 临 床 上 很 重 要 首 先 就 有 血 栓 形 成, 临 床 上 却 没 有 溶 血 症 状 而 且, 发 现 及 少 数 病 人 有 先 天 性 ( 非 pig-a 突 变 )GPI 缺 乏 一 些 研 究 小 组 也 报 导 了 Budd-Chiari 综 合 症 ( 肝 静 脉 栓 塞 ) 病 人 伴 有 PNH 高 发 很 明 显, 遇 到 病 人 血 栓 形 成 ( 如 肝 静 脉 和 脑 静 脉 ) 无 法 解 释 时, 应 该 排 除 PNH 的 可 能 二.PNH 的 实 验 室 诊 断 基 于 红 细 胞 补 体 敏 感 性 的 实 验 在 有 流 式 细 胞 术 之 前,PNH 检 查 主 要 依 靠 溶 血 实 验 Ham 实 验 蔗 糖 溶 血 实 验 和 改 进 的 Ham 实 验 的 原 理 是 :PNH 红 细 胞 对 溶 血 的 敏 感 性 与 正 常 细 胞 不 同 这 些 实 验 虽 然 对 溶 血 性 PNH 有 效, 但 既 不 能 有 效 检 测 出 PNH 红 细 胞 含 量 少 的 样 本, 也 不 能 区 分 部 分 缺 失 和 完 全 缺 失 的 细 胞 另 外, 由 于 输 血 原 因, 且 PNH 红 细 胞 的 寿 命 较 短, 以 上 这 些 实 验 都 不 能 对 PNH 克 隆 给 予 准 确 判 断 研 究 表 明, 通 过 流 式 细 胞 仪 分 析 发 现 GPI 缺 乏 的 中 性 粒 细 胞, 可 以 更 加 准 确 地 判 断 PNH 克 隆 的 情 况 Ross 及 其 同 事 于 1906 年 代 创 建 了 补 体 溶 血 敏 感 实 验 (CLS), 这 个 实 验 可 以 对 PNH 红 细 胞 的 类 型 和 比 例 给 予 更 准 确 的 判 断 但 是,CLS 实 验 及 费 时 费 力, 难 于 操 作, 不 适 合 常 规 诊 断 近 来 又 改 进 方 法, 发 展 了 DiaMed 单 克 隆 抗 体 胶 技 术, 用 于 PNH 筛 查, 它 克 服 了 一 些 CLS 方 法 的 技 术 难 点 这 一 方 法 可 以 在 血 液 病 实 验 室 常 规 使 用, 但 是 与 流 式 细 胞 仪 方 法 比 较, 其 灵 敏 度 特 异 性 都 要 差 一 些 而 且 DiaMed 方 法 仍 然 需 要 做 大 量 的 临 床 实 验, 来 验 证 方 法 的 可 靠 性 ( 一 ) 流 式 细 胞 仪 使 用 流 式 细 胞 仪 分 析 血 细 胞 GPI 锚 蛋 白, 需 要 考 虑 设 门 的 策 略 和 抗 体 的 选 择 而 且, 对 于 PNH 检 测 的 结 果 的 解 释, 有 赖 于 对 GPI 相 关 抗 原 在 细 胞 上 的 分 布 和 在 造 血 细 胞 分 化 的 不 同 阶 段 有 不 同 表 达 ( 见 下 表 ) 的 相 关 知 识 的 了 解 用 流 式 细 胞 仪 检 测 PNH, 并 不 是 说 在 PNH 细 胞 上, 所 有 的 诊 断 用 抗 原 全 都 不 表 达 因 此, 应 该 所 有 细 胞 类 型 上 筛 查 至 少 两 种 GPI 抗 原, 以 排 除 先 天 性 单 一 抗 原 缺 乏 的 可 能, 同 时 排 除 技 术 原 因 造 成 的 误 差 另 外, 应 该 使 用 跨 膜 抗 原 检 测 做 为 阳

性 对 照 1. 红 细 胞 分 析 : 早 期 的 研 究 检 测 集 中 在 红 细 胞 GPI 相 关 抗 原 的 表 达 上 原 因 有 二 第 一, 疾 病 主 要 的 临 床 症 状 是 溶 血 第 二, 以 往 的 PNH 筛 查 实 验, 如 Ham 实 验 和 蔗 糖 溶 血 实 验, 是 红 细 胞 检 查 PNH 以 前 属 于 于 获 得 性 溶 血 性 贫 血, 但 是 现 在 发 现 是 属 于 干 细 胞 异 常 尽 管 目 前 还 没 有 一 致 的 设 门 策 略, 我 们 倾 向 于 前 向 角 散 射 光 (FSC) 和 侧 向 角 散 射 光 (SSC) 使 用 对 数 放 大 模 式, 并 根 据 红 细 胞 的 物 理 特 性,FSC/SSC 设 门 同 时, 检 测 一 个 已 知 在 所 有 红 细 胞 上 都 表 达 的 非 GPI 相 关 的 糖 蛋 白 抗 原, 计 算 阳 性 百 分 率, 用 来 判 断 FSC/SSC 设 门 的 纯 度 与 分 析 淋 巴 细 胞 白 细 胞 或 干 细 胞 的 Boolean 设 门 策 略 相 比, 这 种 设 门 方 法 不 够 理 想 在 做 红 细 胞 多 色 分 析 时, 应 该 考 虑 红 细 胞 聚 集 造 成 的 影 响 细 胞 洗 液 和 单 抗 试 剂 中 有 少 量 蛋 白 成 分, 容 易 使 结 合 了 抗 体 的 红 细 胞 发 生 聚 集 因 此, 我 们 选 择 做 单 色 分 析 在 PNH 红 细 胞 常 规 筛 查 实 验 中, 建 议 使 用 直 标 抗 体, 检 测 两 种 GPI 相 关 抗 原 CD55 和 CD59 如 果 检 测 到 阴 性 或 部 分 缺 失 的 细 胞, 一 定 是 两 种 GPI 相 关 抗 原 同 时 缺 失, 才 可 以 诊 断 PNH 这 是 因 为, 有 一 些 少 见 的 遗 传 性 缺 失 的 病 人 可 以 缺 少 CD55 或 CD59 之 一 分 析 未 输 血 的 PNH 病 人, 发 现 细 胞 可 以 明 显 分 为 三 种 类 型 :III 型 细 胞 ( 完 全 缺 失 ) II 型 细 胞 ( 部 分 缺 失 ) 和 I 型 细 胞 ( 正 常 表 达 ) 不 同 病 人 的 三 型 细 胞 的 Mark 设 定 可 能 会 有 所 不 同, 有 时 三 群 细 胞 可 能 不 能 清 楚 地 分 开 大 多 数 PNH 病 人 的 粒 细 胞 异 常 克 隆 比 例 大 于 红 细 胞 异 常 克 隆 这 是 由 于 与 正 常 红 细 胞 相 比,PNH 红 细 胞 的 寿 命 较 短, 且 输 血 后, 比 例 减 少 近 年 来 的 研 究 表 明,III 型 红 细 胞 的 寿 命 为 17-60 天,II 型 红 细 胞 (CD59 至 少 为 正 常 细 胞 表 达 量 的 15%) 可 以 较 少 产 生 补 体 介 导 的 溶 血 反 应 有 趣 的 是, 使 用 噻 唑 橙 和 CD59 分 析 PNH 患 者 的 网 织 红 细 胞, 发 现 PNH 网 织 红 细 胞 的 比 例 与 中 性 粒 细 胞 克 隆 的 比 例 相 近 这 说 明, 在 PNH 中, 红 细 胞 和 中 性 粒 细 胞 的 骨 髓 前 体 具 有 相 似 的 增 殖 能 力, 检 测 PNH 患 者 的 网 织 红 细 胞 可 以 提 供 有 关 红 细 胞 生 成 率 的 重 要 信 息 很 显 然, 未 来 的 流 式 细 胞 仪 检 测 趋 势 是 利 用 物 理 信 号 和 荧 光 信 号, 建 立 一 个 更 加 有 效 的 红 细 胞 设 门 策 略 2. 粒 细 胞 分 析 : 以 前 对 PNH 粒 细 胞 的 研 究 主 要 是 FSC/SSC 设 门 的 单 色 或 双

色 研 究 尽 管 用 此 方 法 做 单 抗 原 分 析 是 可 行 的, 但 是 只 利 用 粒 细 胞 的 物 理 特 征 进 行 设 门 可 能 会 导 致 某 些 误 差 在 许 多 PNH 病 历 中, 普 遍 认 为 位 于 粒 细 胞 门 中 的 中 性 粒 细 胞 占 绝 大 多 数 但 是, 有 时 也 会 存 在 有 相 当 数 量 的 嗜 碱 性 粒 细 胞 在 使 用 CD16 单 色 分 析 含 量 较 少 的 粒 细 胞 PNH 克 隆 时, 误 差 就 暴 露 了, 因 为 中 性 粒 细 胞 CD16+, 但 正 常 嗜 碱 性 粒 细 胞 CD16- FSC/SSC 设 门 的 另 一 个 问 题 是, 骨 髓 增 生 异 常 综 合 症 时, 会 有 许 多 无 颗 粒 中 性 粒 细 胞, 这 时, 只 使 用 物 理 特 征 就 无 法 设 定 粒 细 胞 门 了, 这 时 必 须 使 用 系 列 标 志 /SSC 设 门 最 好 使 用 三 色 分 析 检 测 PNH 粒 细 胞 检 测 时, 应 该 保 证 在 操 作 过 程 中 减 少 细 胞 丢 失, 同 时 使 用 SSC/ 非 GPI 相 关 蛋 白 的 系 列 抗 原 ( 如 CD15 CD33 CD45) 设 定 粒 细 胞 门, 另 外 两 个 荧 光 通 道 用 来 检 测 GPI 相 关 抗 原 染 色 方 法 不 完 全 一 样, 如 先 染 色 后 溶 血, 或 先 溶 血 后 染 色 先 染 色 CD55 CD59 时, 比 较 难 建 立 正 确 的 抗 体 滴 度, 因 为 要 同 时 染 红 细 胞 和 其 它 血 细 胞 使 用 氯 化 铵 或 其 他 溶 血 素 先 溶 血 的 样 本,CD55 和 CD59 抗 体 的 滴 度 容 易 确 定 CD16 CD24 CD66 也 是 如 此 同 时 使 用 CD16 和 CD66 可 以 很 清 楚 地 区 分 出 中 性 粒 细 胞 和 嗜 碱 性 粒 细 胞 红 细 胞 可 以 在 C 4 条 件 下 保 存 25 天, 仍 可 以 做 实 验, 而 粒 细 胞 分 析 则 必 须 在 样 本 采 集 后 几 小 时 内 进 行 CD59 是 分 辨 I 型 II 型 III 型 细 胞 的 最 好 标 志 但 是, 粒 细 胞 的 区 分 程 度 不 如 红 细 胞 明 显, 而 在 许 多 PNH 中 性 粒 细 胞 上,CD16 表 达 很 弱 粒 细 胞 在 体 外 环 境 中 放 置, 随 着 细 胞 存 活 率 的 下 降, 细 胞 的 非 特 异 染 色 增 强, 自 发 荧 光 增 强 虽 然 阴 性 同 型 对 照 在 PNH 检 测 中 不 是 必 须 的, 但 是, 这 对 于 分 析 粒 细 胞, 尤 其 是 陈 旧 样 本 来 讲, 是 非 常 重 要 的 对 于 大 多 数 PNH 病 例 来 讲, 样 本 中 残 留 的 少 数 正 常 中 性 粒 细 胞 可 以 作 为 GPI 缺 失 的 PNH 克 隆 的 内 参 对 照 另 外, 需 要 注 意 的 是, 在 一 些 病 例 中, 粒 细 胞 和 红 细 胞 GPI 表 型 不 一 致, 粒 细 胞 部 分 缺 失, 而 红 细 胞 完 全 缺 失 或 者 是 II 型 细 胞 和 III 型 细 胞 的 混 合 表 型 3. 单 核 细 胞 分 析 : 有 一 些 研 究 小 组 分 析 了 PNH 病 人 的 外 周 血 单 核 细 胞, 发 现 散 射 光 门 内 的 PNH 单 核 细 胞 缺 少 CD14 CD55 CD59 或 CD48 其 中 CD14 和 CD55 是 比 较 多 见 的 检 测 抗 体 由 于 细 胞 起 源 相 同,PNH 单 核 细 胞 克 隆 和 PNH 粒 细 胞 克 隆 的 一 致 性 很 好 但 是,Alfinito 等 报 告, 与 PNH 粒 细 胞 相 比,CD14- 的 单 核 细 胞 比 例 较 高 而 且,CD14+ 单 核 细 胞 ( 正 常 细 胞 ) 的 百 分 含 量 与 血 红 蛋 白 和 血 小 板 含 量 正 相 关, 而 且 CD14+ 细 胞 <10% 的 病 人 有 活 动 期 症 状 检 测 GPI

相 关 抗 原 部 分 缺 失 的 单 核 细 胞 很 困 难, 只 有 CD48 可 以 有 中 间 状 态 的 染 色 由 于 PNH 病 人 的 单 核 细 胞 的 数 量 通 常 都 比 较 低, 在 检 测 时 很 难 获 取 到 足 够 量 的 单 核 细 胞 做 PNH 单 核 细 胞 分 析 时, 可 以 使 用 系 列 标 记 /SSC 设 门 由 于 CD14 是 GPI 锚 抗 原, 所 以 不 能 用 于 设 门 ;CD64(RIγFc) CD33 和 CD4 可 以 用 来 设 门 在 多 色 分 析 时, 可 以 使 用 CD14 dim/ssc low 或 CD33 bright/ SSC low 设 定 单 核 细 胞 门, 然 后 分 析 门 内 细 胞 的 CD14 CD55 CD59 和 CD52 的 表 达 使 用 这 种 方 法, 可 以 清 楚 地 分 析 出 单 核 细 胞 PNH 克 隆 的 CD14 表 达 缺 失 分 析 表 明, 单 核 细 胞 PNH 克 隆 与 粒 细 胞 PHN 克 隆 相 近 4. 淋 巴 细 胞 分 析 : 使 用 流 式 细 胞 仪 多 色 分 析, 发 现 很 多 PNH 病 人 有 缺 乏 GPI 的 淋 巴 细 胞, 尤 其 是 病 程 较 长 的 病 人 与 粒 细 胞 PNH 克 隆 相 比,PNH T B NK 细 胞 一 般 含 量 很 少 这 可 能 是 因 为 PNH 发 病 前 就 生 成 的 正 常 T B 淋 巴 细 胞 的 寿 命 较 长 在 诊 断 PNH 时, 不 建 议 只 检 测 淋 巴 细 胞 上 GPI 相 关 蛋 白 的 表 达 在 正 常 T 淋 巴 细 胞 中,CD55 和 CD59 的 表 达 水 平 不 一 致 使 用 CD48, 可 以 明 显 区 分 正 常 细 胞 和 PNH T B NK 细 胞 5. 血 小 板 分 析 :PNH 病 人 多 发 生 血 栓, 是 主 要 的 致 死 原 因 GPI 锚 蛋 白 与 血 管 内 溶 血 无 疑 是 相 关 联 的, 但 目 前 仍 没 有 一 个 好 的 机 理 可 以 解 释 这 种 关 系 而 且, 也 不 清 楚 为 什 么 在 某 些 解 剖 部 位 ( 如 腹 内 和 / 或 肝 静 脉 ) 多 发 生 血 栓 当 前 主 要 研 究 血 小 板 缺 乏 GPI-anchored urokinase plasminogen activator receptor(upar, CD87) 和 其 它 GPI 相 关 补 体 调 节 蛋 白 (CD55 或 CD59) 是 一 种 可 能 原 因 此 溶 血 / 血 栓 形 成 过 程 的 生 化 性 质 还 不 是 很 清 楚 同 红 细 胞 和 粒 细 胞 分 析 一 样, 文 献 报 导 中,PNH 血 小 板 分 析 没 有 获 得 一 致 意 见, 研 究 只 限 于 在 富 血 小 板 血 浆 (PRP) 中 加 入 或 不 加 入 某 些 试 剂, 抑 制 血 小 板 活 化 少 数 一 些 人 研 究 了 PNH 病 人 血 小 板 的 CD55 和 CD59 的 表 达 这 些 研 究 主 要 使 用 FSC/SSC 设 门, 同 时 使 用 非 GPI 相 关 蛋 白 的 抗 体 (CD42b 或 CD61) 评 估 设 门 效 果 正 常 血 小 板 的 CD59 和 CD55 的 表 达 比 较 弱, 正 常 血 小 板 中 约 有 10% 不 表 达 CD59 和 CD55 这 种 表 达 缺 失, 是 真 性 的, 还 是 由 于 技 术 限 制 造 成 的, 目 前 还 不 清 楚 因 此,PNH 病 人 检 测 GPI 缺 乏 的 血 小 板 不 容 易 分 辨,II 型 细 胞 与 III 型 细 胞 也 很 难 区 分 有 报 导 说 去 除 PRP 中 的 红 细 胞 可 以 提 高 实 验 的 灵 敏 度

Maciejewski 等 做 双 色 分 析, 使 用 CD42a 和 CD42b 辨 认 血 小 板, 并 分 析 了 正 常 血 小 板 和 PNH 血 小 板 的 CD55 和 CD59 样 本 放 置 保 存, 观 察 5 天, 发 现 两 种 GPI 相 关 抗 原 的 水 平 均 下 降 结 果 表 明, 大 多 数 PNH 病 人 都 可 以 检 测 到 GPI 缺 失 的 血 小 板 检 测 PNH 病 人 血 小 板 的 诊 断 用 途 和 临 床 关 系 目 前 还 没 有 明 确 结 论 可 以 推 测,PNH 血 小 板 的 含 量 可 能 与 PNH 巨 核 细 胞 的 含 量 高 度 相 关 另 外,PNH 病 人 血 栓 高 发 也 是 未 来 的 研 究 重 点 ( 二 ) 流 式 细 胞 仪 : 分 析 实 验 的 几 点 建 议 外 周 血 是 PNH 免 疫 表 型 分 析 的 最 佳 样 本 要 求 做 检 测 的 病 人 提 供 近 期 输 血 记 录 建 议 对 红 细 胞 和 粒 细 胞 都 做 筛 查 原 因 如 下 : 1. 少 数 病 人 (5%) 只 有 粒 细 胞 PNH 克 隆 2. 严 重 溶 血 期 后,GPI 缺 乏 的 红 细 胞 可 能 会 极 度 减 少, 甚 至 可 能 下 降 到 检 测 限 以 下 而 且, 如 果 病 人 在 检 测 前 有 多 次 输 血, 那 么,PNH 筛 查 可 能 受 到 输 入 血 的 影 响, 导 致 错 误 结 果 3. 病 人 如 果 有 严 重 的 再 生 障 碍 性 贫 血, 可 能 导 致 粒 细 胞 数 量 减 低, 不 够 检 测 分 析 红 细 胞 检 测 时, 至 少 两 种 GPI 相 关 抗 原 (CD55 CD59 CD16 CD24 或 CD66) 缺 失, 才 能 诊 断 PNH, 在 一 些 罕 见 的 遗 传 条 件 下, 可 以 有 单 一 抗 原 缺 失 红 细 胞 分 析 中,I 型 细 胞 II 型 细 胞 和 III 型 细 胞 的 分 辨 效 果 最 清 楚 分 析 外 周 血 粒 细 胞 时, 建 议 使 用 系 列 标 记 ( 非 GPI 锚 蛋 白 )/SSC 设 门 的 方 法, 当 然, 在 多 数 病 例 中,FSC/SSC 设 门 也 是 可 以 接 受 的 ( 三 )PNH 病 人 的 临 床 管 理 PNH 的 特 征 是 血 管 内 溶 血 血 细 胞 减 少 骨 髓 造 血 功 能 障 碍 易 于 发 生 静 脉 血 栓 PNH 是 一 种 中 等 存 活 率 (10-15 年 ) 的 慢 性 疾 病 最 常 见 的 并 发 症 和 致 死 原 因 是 静 脉 血 栓 ( 部 分 影 响 肝 静 脉 ) 和 进 行 性 骨 髓 造 血 功 能 障 碍 PNH 唯 一 可 能 的 治 疗 方 案 是 异 体 骨 髓 移 植 (BMT) 但 是, 只 有 少 数 病 人 适 合 做 BMT 对 于 大 部 分 PNH 患 者 来 说,BMT 的 风 险 太 高 PNH 保 守 治 疗 可 以 缓 解 许 多 疾 病 症 状, 预 防 并 发 症 虽 然 PNH 病 情 严 重, 但 大 部 分 病 人 可 以 存 活 大 约 有 1/4 的 病 人 存 活 期 超 过 25 年, 有 约 15% 的 病 人 病 情 自 然 缓 解 现 在 还 没 有 方 法 来 判 断 哪 些 病 人 可 以

缓 解, 但 是, 初 步 证 据 显 示, 一 系 列 的 流 式 细 胞 仪 检 测 可 能 帮 助 做 预 测 三. 总 结 使 用 流 式 细 胞 仪 分 析 红 细 胞 和 粒 细 胞 的 GPI 相 关 蛋 白, 是 PNH 筛 查 和 诊 断 的 灵 敏 特 异 的 方 法 由 于 PNH 发 病 率 低, 经 常 导 致 诊 断 的 延 误 回 顾 性 研 究 显 示, 极 少 数 诊 断 延 误 可 以 达 15 年 之 久 可 以 使 用 流 式 细 胞 仪 做 快 速 筛 查 工 作, 这 种 方 法 优 于 Ham 实 验 新 诊 断 的 PNH 患 者, 需 要 预 测 临 床 进 程, 预 测 病 人 发 生 血 栓 的 危 险 性, 预 防 病 人 发 展 为 溶 血 型 或 再 生 不 良 型 判 断 病 人 是 否 发 生 自 发 缓 解 对 于 决 定 治 疗 方 案, 尤 其 是 是 否 进 行 BMT, 是 非 常 重 要 的 使 用 流 式 细 胞 仪 检 测 PNH 克 隆 大 小, 这 对 于 临 床 和 预 后 的 指 导 意 义 目 前 还 不 清 楚 数 据 表 明, 溶 血 性 PNH 病 人 细 胞 主 要 是 完 全 缺 失 (III 型 细 胞 ) 的 红 细 胞 由 于 PNH 粒 细 胞 的 百 分 含 量 最 准 确 地 反 映 了 PNH 克 隆 大 小, 理 论 上 来 说, 病 人 外 周 血 标 本 PNH 粒 细 胞 的 系 列 监 测 是 疾 病 活 动 性 的 最 准 确 的 指 示