第 卷 第 期 过 程 工 程 学 报 Vol. No. 年 月 The Chinese Journal of Process Engineering June 乙 肝 表 面 抗 原 在 微 球 表 面 的 吸 附 行 为 活 性 和 结 构 变 化 李 娜,,,, 王 连 艳, 吴 有 斌, 曾 烨 婧, 马 光 辉, 苏 志 国 (. 中 国 科 学 院 过 程 工 程 研 究 所 生 化 工 程 国 家 重 点 实 验 室, 北 京 9;. 中 国 科 学 院 研 究 生 院, 北 京 9;. 北 京 化 工 大 学 生 命 科 学 与 技 术 学 院, 北 京 9) 摘 要 : 采 用 快 速 膜 乳 化 技 术 结 合 溶 剂 挥 发 法 制 备 了 尺 寸 均 一 的 聚 乳 酸 (PLA) 微 球, 平 均 粒 径 为 8 nm 左 右, 并 采 用 PLA 微 球 对 乙 肝 表 面 抗 原 (HBsAg) 进 行 了 吸 附 研 究, 考 察 了 ph 值 盐 浓 度 微 球 用 量 HBsAg 浓 度 及 吸 附 温 度 对 HBsAg 吸 附 率 活 性 和 结 构 的 影 响. 结 果 表 明, 在 ph. 的 磷 酸 缓 冲 溶 液 中,NaCl 浓 度 为 g/l 微 球 用 量 为 mg/ml HBsAg 浓 度 为 µg/ml 吸 附 温 度 为 7 的 条 件 下,HBsAg 吸 附 率 可 达 % 左 右. 下,pH 值 为 8. 及 NaCl 浓 度 为 g/l 微 球 用 量 为 mg/ml 及 HBsAg 浓 度 为 µg/ml 时,HBsAg 活 性 保 留 可 达 98% 以 上. 关 键 词 : 聚 乳 酸 微 球 ; 乙 肝 表 面 抗 原 ; 吸 附 ; 生 物 活 性 ; 结 构 中 图 分 类 号 :R9. 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :9 X() 9 9 前 言 随 着 基 因 工 程 技 术 的 发 展, 很 多 蛋 白 质 药 物 通 过 基 因 重 组 技 术 得 到 有 效 开 发. 由 于 蛋 白 质 药 物 在 体 内 易 被 酶 降 解 [ ], 目 前 绝 大 多 数 都 采 用 注 射 给 药, 但 存 在 半 衰 期 短 药 代 动 力 学 性 质 差 需 频 繁 注 射 给 药 等 缺 点, 不 仅 给 患 者 带 来 痛 苦 和 不 便, 且 体 内 血 药 浓 度 易 产 生 明 显 的 峰 谷 现 象 导 致 药 效 降 低 或 毒 副 作 用. 用 生 物 可 降 解 高 分 子 微 球 包 埋 蛋 白 质 药 物 制 备 成 缓 释 制 剂, 不 仅 可 通 过 缓 控 释 作 用 实 现 长 效 皮 下 注 射 给 药, 且 可 通 过 微 球 表 面 和 粒 径 的 设 计, 实 现 口 服 粘 膜 吸 入 等 新 的 给 药 途 径, 是 国 内 外 研 究 的 热 点 [ 7] [8]. Miyata 等 制 备 的 口 服 壳 聚 糖 载 胰 岛 素 毫 微 球 具 有 缓 释 作 用, 有 效 防 止 了 药 物 [9] 在 胃 肠 道 降 解, 使 降 糖 效 果 长 达 h 以 上 ;Vila 等 用 壳 聚 糖 修 饰 聚 ( 乳 酸 乙 醇 酸 ) (PLGA) 微 球, 有 效 提 高 [] 了 药 物 的 抗 酶 解 能 力 和 穿 过 鼻 腔 粘 膜 的 能 力 ;Li 等 制 备 的 聚 乙 二 醇 聚 乳 酸 共 聚 物 (PELA) 疫 苗 微 球 利 用 微 球 自 身 降 解, 实 现 了 二 次 突 释, 有 效 模 拟 了 铝 吸 附 佐 剂 多 次 注 射 的 脉 冲 模 式 释 放, 取 得 了 很 好 的 体 液 免 疫 效 [] 果 ;Weissenböck 等 在 药 物 载 体 PLGA 表 面 接 枝 血 凝 素, 不 仅 能 提 高 载 体 与 病 灶 组 织 的 粘 附 时 间, 而 且 提 高 了 细 胞 的 药 物 吸 收 量. 但 目 前 有 关 微 球 载 药 的 研 究 多 集 中 在 从 体 内 或 细 胞 的 角 度 考 察 蛋 白 质 药 物 的 缓 释 效 果, 而 蛋 白 质 药 物 包 埋 过 程 活 性 保 持 非 常 关 键, 直 接 影 响 体 内 的 药 效 行 为, 但 目 前 这 方 面 的 研 究 因 手 段 缺 乏 而 较 少. 蛋 白 质 药 物 分 子 量 大 结 构 复 杂, 在 用 高 分 子 微 球 包 埋 过 程 中 很 易 发 生 变 性 失 活. 蛋 白 质 包 埋 失 活 与 其 在 微 球 固 体 内 表 面 的 吸 附 相 关, 蛋 白 质 在 微 球 固 体 内 表 面 因 吸 附 会 发 生 一 系 列 相 互 作 用 及 变 化, 是 否 会 导 致 蛋 白 质 结 构 和 活 性 变 化, 目 前 国 内 外 还 没 有 系 统 研 究, 难 以 获 得 高 效 的 蛋 白 质 药 物 制 剂. 主 要 原 因 之 一 可 能 是 包 埋 后 蛋 白 质 活 性 及 结 构 变 化 的 检 测 较 困 难. 包 埋 后 蛋 白 质 与 固 体 球 内 表 面 相 互 作 用 和 其 与 空 白 微 球 外 表 面 的 作 用 规 律 相 似, 因 此, 本 研 究 采 用 空 白 微 球 吸 附 蛋 白 质 的 作 用 方 式, 以 可 生 物 降 解 聚 乳 酸 [Poly(lactic acid), PLA] 微 球 为 模 型 微 球, 以 乙 肝 表 面 抗 原 (Hepatitis B Surface Antigen, HBsAg) 为 模 型 蛋 白 质, 系 统 研 究 HBsAg 在 微 球 表 面 的 吸 附 行 为 活 性 和 结 构 变 化 规 律, 期 望 从 根 本 上 探 索 蛋 白 质 微 包 埋 过 程 中 的 抗 失 活 策 略. 本 研 究 选 择 的 HBsAg 是 由 多 个 亚 基 靠 非 共 价 键 作 用 形 成 的 大 分 子 蛋 白 质, 分 子 量 超 过 kda, 密 度 为. g/ml, 水 合 半 径 nm 左 右 [ ]. HBsAg 分 子 量 大, 其 结 构 变 化 对 活 性 影 响 较 大, 其 结 构 和 活 性 表 征 相 对 容 易 且 手 段 多, 所 以, 选 择 HBsAg 作 为 模 型 蛋 白 质 有 一 定 代 表 性. HBsAg 颗 粒 大 小 与 其 生 物 活 性 息 息 相 关,HBsAg 的 聚 集 会 一 定 程 度 上 降 低 其 生 物 活 性 [,], 而 其 聚 集 主 要 是 由 其 四 级 结 构 变 化 引 起 的, 因 此 本 研 究 重 点 考 察 HBsAg 的 四 级 结 构 变 化, 即 HBsAg 的 聚 集 行 为. PLA 微 球 具 有 优 良 的 生 物 相 容 性 和 生 物 降 解 性 [7], 是 美 国 食 品 与 药 品 管 理 局 正 式 批 准 的 药 物 辅 料 [8], 同 时 也 是 目 前 微 包 埋 常 用 的 微 球 材 料 之 一, 因 此, 研 究 PLA 微 球 表 面 对 HBsAg 的 吸 附 行 为 活 性 和 结 构 的 影 响 具 有 实 际 意 义. 由 于 溶 液 ph 值 等 溶 液 环 境 因 素 会 影 响 微 球 表 面 性 质 及 HBsAg 与 微 球 表 面 作 用 方 式, 进 而 影 响 HBsAg 的 活 性 和 结 构, 因 此, 以 PLA 微 球 吸 附 HBsAg 为 模 型, 系 统 考 察 了 ph 值 盐 浓 度 微 球 及 其 用 量 收 稿 日 期 :, 修 回 日 期 : 8 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 青 年 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 :7); 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 (8) 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 :7AA9Z9) 作 者 简 介 : 李 娜 (98 ), 女, 内 蒙 古 包 头 市 人, 硕 士 研 究 生, 生 物 化 工 专 业 ; 王 连 艳, 通 讯 联 系 人,Tel: -79, E-mail: wanglianyan@home.ipe.ac.cn.
过 程 工 程 学 报 第 卷 抗 原 浓 度 和 温 度 对 HBsAg 在 PLA 微 球 表 面 的 吸 附 率 体 外 生 物 活 性 和 结 构 的 影 响, 以 期 能 深 入 了 解 微 球 载 药 制 备 过 程 中 固 体 表 面 对 蛋 白 结 构 影 响 的 微 观 规 律, 为 蛋 白 质 药 物 在 生 产 及 应 用 过 程 中 的 结 构 完 全 性 和 活 性 保 持 策 略 的 提 出 提 供 理 论 依 据. 实 验. 材 料 与 试 剂 D,L- 聚 乳 酸 (D,L-PLA, 平 均 分 子 量 kda, 购 自 山 东 医 疗 器 械 研 究 所 ); 汉 逊 酵 母 (Hansenular polymorpha) 表 达 的 乙 肝 表 面 抗 原 (adw 亚 型, 浓 度 µg/ml) 为 市 售 商 品, 经 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 测 定 纯 度 大 于 99.%, 采 用 鲎 试 剂 法 测 定 细 菌 内 毒 素, 结 果 低 于 EU/mL ( µg). 测 定 蛋 白 浓 度 的 BCA 和 Micro-BCA 试 剂 盒 购 于 美 国 Pierce 公 司, 测 定 HBsAg 生 物 活 性 的 ELISA 试 剂 盒 购 于 上 海 科 华 生 物 工 程 股 份 有 限 公 司. 异 硫 氰 酸 荧 光 素 (Fluorescein Isothiocynate, FITC, 德 国 Sigma-Aldrich 公 司 ), 二 氯 甲 烷 (MC, 北 京 化 学 试 剂 公 司 ), 聚 乙 烯 醇 (PVA-7, 聚 合 度 7, 水 解 度 88.%, 日 本 Kuraray 公 司 ), 其 他 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 试 剂, 所 用 纯 水 由 Q-plus 超 纯 水 机 (Millipore, USA) 制 备.. 实 验 装 置 与 分 析 仪 器 快 速 膜 乳 化 装 置 及 膜 孔 径.8 µm 的 微 孔 玻 璃 膜 购 自 日 本 SPG Technology 公 司, 表 征 微 球 形 貌 采 用 JEM-7F 扫 描 电 镜 ( 日 本 JEOL SEM 公 司 ), 微 球 粒 径 及 其 分 布 表 面 电 荷 表 征 采 用 Zeta 电 位 仪 ( 美 国 Brookhaven Instruments 公 司 ), FITC 标 记 的 HBsAg 在 微 球 表 面 吸 附 的 直 观 表 征 采 用 TCS SP 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 ( 德 国 Leica 公 司 ), HBsAg 在 微 球 表 面 吸 附 后 的 形 貌 表 征 采 用 MultiMode V 原 子 力 显 微 镜 ( 美 国 Veeco 公 司 ), 精 确 称 量 采 用 BS S 型 电 子 天 平 ( 德 国 Sartorius 公 司 ), 微 球 离 心 洗 涤 采 用 高 速 离 心 机 ( 美 国 Sigma 公 司 ), 抗 原 吸 附 在 恒 温 振 荡 器 SKY-B( 上 海 苏 坤 实 验 仪 器 厂 ) 中 进 行, 微 球 冻 干 采 用 Free-Zone 冻 干 机 ( 美 国 Labconco 公 司 ), 吸 附 前 后 HBsAg 结 构 变 化 采 用 高 效 液 相 分 子 排 阻 色 谱 液 相 系 统 Agilent ( 美 国 Agilent 公 司 ), 色 谱 柱 TSK G PW 及 保 护 柱 TSK GPW guardcolumn ( 日 本 Tosohaas 公 司 ). 抗 原 溶 液 定 量 检 测 采 用 酶 标 仪 ( 美 国 Bio-Rad 公 司 ).. 实 验 方 法.. PLA 空 白 微 球 制 备 采 用 快 速 膜 乳 化 结 合 溶 剂 挥 发 法 制 备 PLA 空 白 微 球, 即 先 用 快 速 膜 乳 化 技 术 制 备 粒 径 均 一 的 O/W 乳 液, 然 后 采 用 溶 剂 挥 发 法 将 膜 材 中 的 油 相 去 除, 使 微 球 固 化, 得 到 粒 径 均 一 的 PLA 微 球 产 品. 具 体 过 程 如 下 : 将 mg PLA 溶 于 ml MC 中 作 为 油 相 (O), 将 油 相 倒 入 ml 含 g/l PVA 的 水 溶 液 ( 水 相 W) 中 以 磁 力 搅 拌 进 行 预 复 乳 化 ( r/min 搅 拌 s), 得 到 O/W 预 乳 液, 将 其 倒 入 快 速 膜 乳 化 装 置 [ 图 (a)] 的 储 存 罐 中, 以 适 当 的 氮 气 压 力 将 预 乳 液 反 复 次 压 过 孔 径 为.8 µm 的 微 孔 膜 [ 图 (b)], 得 到 粒 径 均 一 的 O/W 乳 液. 所 得 乳 液 在 常 温 下 磁 力 搅 拌 h( r/min) 去 除 有 机 溶 剂, 固 化 后 的 微 球 用 去 离 子 水 离 心 ( r/min, min) 洗 涤 次, 最 后 冷 冻 干 燥 制 成 成 品. (a) Premix membrane emulsification apparatus (b) Premix membrane emulsification principle [9] 图 快 速 膜 乳 化 装 置 及 其 乳 液 制 备 示 意 图 Fig. Schematic diagram of premix membrane emulsification apparatus and principle [9].. 空 白 微 球 形 貌 的 表 征 将 空 白 PLA 微 球 悬 浮 液 滴 在 铝 箔 上, 均 匀 摊 开 并 自 然 晾 干, 将 铝 箔 用 导 电 胶 贴 于 样 品 台 上, 真 空 条 件 下 mv 喷 金 s, 用 扫 描 电 子 显 微 镜 观 察... 微 球 粒 径 及 其 分 布 测 定 微 球 粒 径 及 其 分 布 采 用 带 亚 微 米 型 微 球 粒 径 分 析 功 能 的 Zeta 电 位 仪 测 定, 具 体 过 程 如 下 : 将 PLA 微 球 悬 浮 于 蒸 馏 水 中, 超 声 使 其 均 匀 分 散, 取 ml 悬 浮 液 加 入 样 品 池 中, 放 入 Zeta 电 位 仪 中 测 定. PLA 微 球 均 一 性 由 多 分 散 性 指 数 表 示, 指 数 越 小 说 明 粒 径 分 布 越 窄, 粒 径 均 一 性 越 好... PLA 空 白 微 球 对 HBsAg 的 吸 附
第 期 李 娜 等 : 乙 肝 表 面 抗 原 在 微 球 表 面 的 吸 附 行 为 活 性 和 结 构 变 化 将 HBsAg 原 液 用 一 定 ph 值 的 磷 酸 缓 冲 液 稀 释 到 一 定 浓 度, 取 ml 稀 释 后 的 HBsAg 溶 液, 加 入 一 定 量 NaCl, 保 证 抗 原 溶 液 有 一 定 盐 浓 度, 再 向 ml 抗 原 溶 液 中 加 入 固 定 量 的 PLA 微 球, 使 微 球 充 分 悬 浮 在 HBsAg 溶 液 中, 在 一 定 温 度 下 振 荡 吸 附 h, 振 荡 频 率 r/min... 微 球 吸 附 HBsAg 的 表 征 () 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 (LSCM) 表 征 配 制 mg/ml FITC 溶 液, 加 入 HBsAg 原 液, 在 下 避 光 反 应 h 后, 通 过 超 滤 将 未 结 合 的 FITC 除 去, 得 到 FITC 标 记 的 HBsAg. 一 定 条 件 下 将 FITC-HBsAg 吸 附 于 空 白 PLA 微 球 表 面, 采 用 TCS SP 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 对 标 记 抗 原 在 微 球 表 面 的 吸 附 进 行 直 观 定 性 表 征, 即 在 88 nm 处 激 发, 在 nm 范 围 内 采 集 荧 光 图 像. () 原 子 力 显 微 镜 (AFM) 表 征 用 蒸 馏 水 将 吸 附 前 后 的 PLA 微 球 溶 液 分 别 稀 释 倍, 得 到 AFM 成 像 样 品, 将 样 品 滴 在 新 劈 开 的 洁 净 云 母 表 面, 使 其 均 匀 摊 开, 常 温 常 压 下 晾 干. 采 用 原 子 力 显 微 镜 中 的 轻 敲 成 像 模 式 (Tapping mode) 表 征 吸 附 前 后 微 球 的 表 面 形 貌 变 化, 以 二 维 微 球 的 高 度 图 (Height) 和 相 位 图 (Phase) 进 行 表 征... HBsAg 吸 附 率 的 测 定 取 振 荡 吸 附 后 的 抗 原 微 球 混 合 溶 液, r/min 离 心 min, 吸 出 上 清, 采 用 BCA 试 剂 盒 和 Micro-BCA 试 剂 盒 测 定 其 中 HBsAg 含 量. 微 球 对 抗 原 的 吸 附 率 (Adsorption Efficiency, AE) 按 下 式 计 算 : 吸 附 前 抗 原 质 量 吸 附 后 上 清 中 抗 原 质 量 AE= %. 吸 附 前 抗 原 质 量..7 吸 附 后 HBsAg 活 性 保 留 的 测 定 用 ELISA 法 测 定 吸 附 后 HBsAg 的 生 物 活 性. 向 商 品 化 的 已 包 被 纯 化 抗 体 的 微 孔 中 加 入 µl 吸 附 后 游 离 HBsAg 溶 液 和 不 同 浓 度 (,,,,,, ng/ml) HBsAg 标 准 品 溶 液, 并 设 阴 阳 性 对 照 各 孔, 每 孔 加 入 酶 结 合 物 µl, 7 孵 育 min. 洗 板 次 后, 每 孔 加 显 色 剂 A 液 ( 多 克 隆 抗 -HBs-HRP) 和 B 液 (TMB 底 物 ) 各 µl, 7 避 光 显 色 min, 向 每 孔 中 各 加 入 终 止 液 µl, 在 双 波 长 下 ( 测 定 波 长 nm, 参 考 波 长 nm) 用 酶 标 仪 测 定 反 应 后 溶 液 的 吸 光 度 (OD), 以 HBsAg 标 准 品 的 吸 光 度 作 为 对 照, 作 标 准 浓 度 OD 值 标 准 曲 线, 计 算 HBsAg 的 相 对 生 物 活 性 保 留 率...8 HPSEC 对 吸 附 后 HBsAg 四 级 结 构 变 化 的 检 测 HPSEC 为 高 效 液 相 分 子 排 阻 色 谱,HBsAg 样 品 经 分 子 排 阻 色 谱 柱 后 得 到 不 同 洗 脱 峰, 通 过 计 算 抗 原 出 峰 时 间 推 测 抗 原 的 四 级 结 构 变 化, 即 是 否 产 生 抗 原 聚 集 体. 液 相 系 统 为 Agilent, 色 谱 柱 为 TSK G PW ( mm 7. mm, I.D.), 预 柱 为 TSK GPW guardcolumn ( mm. mm, I.D.), 流 动 相 为 mmol/l PBS, ph.8, 流 速. ml/min, 温 度 为 室 温, 上 样 量 为 µl. 结 果 与 讨 论. PLA 空 白 微 球 的 形 貌 粒 径 及 粒 径 分 布 结 合 快 速 膜 乳 化 技 术 和 溶 剂 挥 发 法 制 备 PLA 空 白 微 球, 结 果 如 图 所 示. 所 制 PLA 微 球 表 面 光 滑 球 形 度 好 且 分 散 性 佳 微 球 粒 径 均 一, 其 平 均 粒 径 为 8. nm, 多 分 散 性 (Polydispersity) 指 数 为., 表 明 用 于 抗 原 吸 附 研 究 的 微 球 批 次 之 间 具 有 良 好 的 重 复 性, 这 为 其 吸 附 行 为 和 结 构 变 化 研 究 的 重 复 性 奠 定 了 良 好 的 基 础. Intensity distribution (%) 图 PLA 微 球 的 扫 描 电 镜 照 片 和 粒 径 分 布 Fig. SEM image and size distribution of PLA microspheres 9 8 7 8 Diameter (nm). PLA 微 球 吸 附 HBsAg 后 的 表 面 形 貌 变 化 采 用 LSCM 观 察 标 记 的 HBsAg 在 PLA 微 球 表 面 的 分 布, 结 果 如 图 所 示, 表 明 HBsAg 主 要 吸 附 在 疏 水 PLA 微 球 表 面. 如 图 所 示,AFM 表 征 的 吸 附 前 后 微 球 表 面 形 貌 表 明, 吸 附 前 后 PLA 微 球 表 面 形 貌 发 生 很 大 变 化. 吸
过 程 工 程 学 报 第 卷 (a) Before adsorption (b) After adsorption 图 PLA 微 球 对 荧 光 标 记 HBsAg 吸 附 前 后 的 激 光 共 聚 焦 照 片 Fig. LSCM images of PLA microspheres before and after FITC-HBsAg adsorption (a) Before adsorption (b) After adsorption 图 PLA 微 球 吸 附 HBsAg 前 后 的 原 子 力 显 微 镜 照 片 Fig. AFM images of PLA microspheres before and after HBsAg adsorption 附 前 PLA 表 面 较 光 滑, 而 吸 附 后 微 球 表 面 粗 糙 度 明 显 增 加, 表 面 分 布 一 些 与 微 球 表 面 性 质 截 然 不 同 的 物 质, 这 些 物 质 呈 高 约 nm 的 岛 屿 结 构, 高 度 正 好 与 HBsAg 的 水 合 半 径 吻 合, 由 此 也 可 以 确 定 HBsAg 确 实 吸 附 在 了 PLA 微 球 表 面.. 影 响 HBsAg 在 微 球 表 面 吸 附 活 性 及 结 构 的 因 素 汉 逊 酵 母 表 达 的 HBsAg 属 复 杂 的 多 聚 亚 基 蛋 白, 亚 基 之 间 主 要 靠 非 共 价 键 相 互 作 用, 分 子 量 超 过 kda, 免 疫 原 性 强. 蛋 白 质 分 子 体 积 越 大, 其 柔 性 和 可 变 性 就 越 大. 所 以 HBsAg 在 微 球 表 面 吸 附 过 程 中, 缓 冲 液 ph 值 盐 浓 度 微 球 量 HBsAg 浓 度 和 吸 附 温 度 等 因 素 都 会 对 其 在 微 球 表 面 的 吸 附 解 吸 过 程 产 生 影 响, 从 而 对 吸 附 率 HBsAg 活 性 和 结 构 产 生 影 响... 缓 冲 液 ph 值 的 影 响 影 响 蛋 白 质 稳 定 性 最 重 要 的 因 素 是 ph 值. 缓 冲 液 ph 值 会 影 响 HBsAg 的 荷 电 性 疏 水 性 及 构 象, 从 而 影 响 HBsAg 的 吸 附 行 为 及 活 性 和 结 构. HBsAg 的 等 电 点 在.7 左 右, 在 偏 离 蛋 白 质 等 电 点 的 极 端 ph 下, 蛋 白 质 中 同 性 电 荷 的 斥 力 增 加, 同 时 分 子 内 形 成 盐 桥 的 能 力 降 低, 使 蛋 白 质 易 变 性 失 活 [,]. 所 以 ph 值 对 HBsAg 在 微 球 表 面 的 吸 附 活 性 和 结 构 有 重 要 影 响. 因 此, 详 细 考 察 了 ph. 8. 时,HBsAg 吸 附 率 吸 附 后 HBsAg 的 生 物 活 性 保 留 及 其 结 构 变 化 ( 聚 集 体 ), 结 果 分 别 如 图 和 所 示.
第 期 李 娜 等 : 乙 肝 表 面 抗 原 在 微 球 表 面 的 吸 附 行 为 活 性 和 结 构 变 化 图 表 明, 随 ph 值 增 大,HBsAg 吸 附 率 逐 渐 降 低, HBsAg 活 性 保 留 却 逐 渐 增 大. 当 ph 值 为. 时,HBsAg 吸 附 率 最 高, 而 生 物 活 性 却 最 低, 不 到 原 抗 原 活 性 的 %; 而 在 ph 8. 时,HBsAg 的 生 物 活 性 最 高, 吸 附 率 却 最 小, 仅 为 % 左 右. 这 是 因 为 HBsAg 的 等 电 点 在.7 左 右,pH 值 越 大, 溶 液 中 HBsAg 单 体 的 负 电 性 越 强, 导 致 抗 原 与 带 负 电 的 PLA 微 球 之 间 的 静 电 排 斥 力 增 大, 阻 碍 了 微 球 对 抗 原 的 吸 附... 7. 7. 8. ph.. 7. 7. 8. ph 图 ph 值 对 HBsAg 的 吸 附 率 和 生 物 活 性 保 留 的 影 响 Fig. Effect of ph value on adsorption rate and bioactivity retention of HBsAg Absorbance at 8 nm (mau) ph.. 7. 7. 8. 图 ph 值 对 HBsAg 聚 集 行 为 的 影 响 (HPSEC 谱 图 ) Fig. HPSEC analysis of effect of ph value on HBsAg aggregation 图 为 HBsAg 在 不 同 ph 值 下 的 HPSEC 谱 图, min 对 应 的 峰 为 HBsAg 单 体 ( 即 nm 的 颗 粒 ),ph 从 7. 增 加 到 8., HBsAg 单 体 峰 几 乎 未 发 生 明 显 变 化 ; 而 当 ph 值 分 别 为. 和. 时, 谱 图 在 min 处 出 现 一 个 大 分 子 聚 集 体 峰, 表 明 在 酸 性 条 件 下 HBsAg 分 子 易 形 成 聚 集 体, 而 HBsAg 聚 集 体 的 ELISA 活 性 比 HBsAg 单 体 低. 这 可 能 是 因 为 酸 性 环 境 会 导 致 大 分 子 HBsAg 的 二 级 结 构 发 生 改 变, 从 而 造 成 ELISA 检 测 活 性 降 低... 盐 浓 度 的 影 响 HBsAg 含 一 定 量 疏 水 性 氨 基 酸, 通 常 情 况 下, 其 疏 水 氨 基 酸 被 包 裹 在 分 子 内 部, 盐 溶 液 会 使 蛋 白 质 水 化 层 破 坏 而 裸 露 出 疏 水 部 位, 从 而 影 响 HBsAg 在 微 球 表 面 的 吸 附 率 活 性 及 结 构. 因 此, 在 相 同 ph (7.) 值 下, 系 统 考 察 了 不 同 浓 度 NaCl 对 HBsAg 在 微 球 表 面 的 吸 附 率 活 性 和 结 构 的 影 响, 结 果 如 图 7 所 示. 图 7(a) 表 明, 随 NaCl 浓 度 增 加,HBsAg 的 吸 附 率 先 逐 渐 增 大, 在 浓 度 为 g/l 时 增 加 到 7.%, 继 续 增 加 NaCl 浓 度, HBsAg 吸 附 率 逐 渐 下 降. 这 是 因 为 在 较 低 盐 浓 度 下, 盐 影 响 静 电 屏 蔽, 即 盐 作 为 带 相 反 电 荷 的 离 子 弱 化 静 电 作 用 [], 大 大 降 低 了 HBsAg 与 微 球 间 的 静 电 排 斥 作 用, 从 而 促 进 HBsAg 的 吸 附. 在 一 定 盐 浓 度 范 围 内 ( 低 于 g/l), 盐 浓 度 越 大, 屏 蔽 效 应 越 强, 导 致 HBsAg 吸 附 率 增 加. 但 当 溶 液 中 NaCl 浓 度 提 高 至 g/l 时, 屏 蔽 效 应 达 到 饱 和,PLA 微 球 和 HBsAg 分 子 都 会 由 于 疏 水 性 增 强 而 呈 现 一 定 的 聚 集, 导 致 HBsAg 在 微 球 表 面 的 吸 附 量 降 低, 因 此 HBsAg 吸 附 率 逐 渐 降 低. HBsAg 活 性 保 留 随 盐 浓 度 增 加 而 逐 渐 降 低, 这 是 因 为 高 盐 更 易 破 坏 HBsAg 表 面 的 水 化 层, 使 HBsAg 暴 露 出 更 多 的 疏 水 位 点, 从 而 引 起 HBsAg 分 子 聚 集, 导 致 其 活 性 损 失. 不 同 盐 浓 度 下 HBsAg 的 HPSEC 分 析 [ 图 7(b)] 也 印 证 了 上 述 推 测, 即 随 NaCl 浓 度 增 加, min 处 HBsAg 单 体 的 峰 高 逐 渐 下 降, 而 min 左 右 对 应 的 HBsAg 聚 集 体 的 峰 高 逐 渐 升 高, 这 说 明 溶 液 中 HBsAg 聚 集 体 的 含 量 在 不 断 增 多, 表 明 高 盐 浓 度 确 实 引 起 了 HBsAg 严 重 聚 集, 同 时 也 导 致 HBsAg 活 性 损 失. 这 与 ELISA 活 性 检 测 结 果 一 致... 微 球 和 微 球 量 的 影 响 由 于 HBsAg 的 吸 附 主 要 发 生 在 微 球 表 面, 微 球 用 量 增 加 将 会 大 大 增 加 用 于 吸 附 HBsAg 的 表 面 积. 为 研 究 微 球 用 量 增 加 对 HBsAg 活 性 和 结 构 变 化 的 影 响, 系 统 考 察 了 微 球 用 量 对 HBsAg 吸 附 率 活 性 和 结 构 的 影 响, 结 果 分 别 如 图 8 和 9 所 示. 图 8 表 明, 随 PLA 微 球 量 增 加,HBsAg 吸 附 率 逐 渐 增 大, 但 单 位 质 量 PLA 微
过 程 工 程 学 报 第 卷 7 - 图 7 NaCl 浓 度 对 HBsAg 的 吸 附 率 生 物 活 性 保 留 和 聚 集 行 为 (HPSEC 谱 图 ) 的 影 响 Fig.7 Effect of NaCl concentration on adsorption rate, bioactivity retention and aggregation (HPSEC analysis) of HBsAg 8 Concentration of NaCl (g/l) (a) Amount of PLA microspheres (mg) 8 9 8 7 图 8 PLA 微 球 量 对 HBsAg 吸 附 率 生 物 活 性 保 留 和 吸 附 量 的 影 响 Fig.8 Effect of amount of PLA on HBsAg adsorption rate, bioactivity retention and adsorption amounts of HBsAg Absorbance at 8 nm (mau) Adsorbed HBsAg (µg/mg) 8 8 (b) NaCl (g/l) 9 Amount of PLA microspheres (mg) Absorbance at 8 nm (mau) Without microspheres With microspheres Absorbance at 8 nm (mau) PLA (mg) 图 9 PLA 微 球 及 其 用 量 对 HBsAg 聚 集 行 为 的 影 响 (HPSEC 谱 图 ) Fig.9 HPSEC analysis of effects of PLA microspheres and amount of microspheres on HBsAg aggregation 球 吸 附 的 HBsAg 量 却 在 逐 渐 减 少, 即 mg 的 高 剂 量 微 球 虽 然 吸 附 的 总 抗 原 量 最 多, 但 单 位 微 球 上 吸 附 的 抗 原 量 却 是 最 少 的. 这 是 由 于 微 球 量 增 加 使 有 限 空 间 内 PLA 微 球 的 总 表 面 积 增 大, 从 而 促 进 了 吸 附 反 应 进 行, 但 同 时 也 大 大 降 低 了 单 个 微 球 与 HBsAg 颗 粒 碰 撞 的 机 会, 导 致 单 个 微 球 的 HBsAg 吸 附 量 降 低. HBsAg 活 性 保 留 随 微 球 量 增 加 而 逐 渐 降 低, 可 能 是 HBsAg 分 子 吸 附 于 微 球 表 面 的 过 程 中, 微 球 本 身 的 结 构 或 性 质 引 起 抗 原 结 构 改 变, 且 与 微 球 剂 量 呈 正 相 关, 即 微 球 量 越 多, 抗 原 结 构 变 化 越 显 著, 其 活 性 损 失 就 越 大. HBsAg 在 微 球 表 面 吸 附 前 后 聚 集 行 为 的 结 果 ( 图 9) 间 接 印 证 了 推 测. 与 吸 附 前 相 比, 微 球 吸 附 后 HBsAg 的 单 体 峰 与 聚 集 体 峰 面 积 比 下 降, 表 明 溶 液 中 HBsAg 聚 集 体 比 例 增 加, 且 随 微 球 量 增 加,HBsAg 聚 集 程 度 明
第 期 李 娜 等 : 乙 肝 表 面 抗 原 在 微 球 表 面 的 吸 附 行 为 活 性 和 结 构 变 化 显 增 强, 说 明 微 球 表 面 对 抗 原 结 构 的 影 响 与 微 球 量 成 正 比, 即 高 剂 量 微 球 会 引 起 抗 原 严 重 聚 集, 不 利 于 抗 原 活 性 的 保 留. 这 可 能 是 因 为 HBsAg 受 微 球 表 面 疏 水 性 的 影 响, 其 二 级 结 构 发 生 较 大 变 化, 打 破 了 暴 露 于 HBsAg 表 面 和 埋 藏 于 HBsAg 内 部 的 疏 水 残 基 的 平 衡, 使 HBsAg 分 子 暴 露 出 更 多 的 疏 水 区 域, 从 而 导 致 HBsAg 聚 集... HBsAg 浓 度 的 影 响 抗 原 浓 度 也 是 影 响 微 球 表 面 吸 附 HBsAg 的 关 键 因 素 之 一, 导 致 HBsAg 活 性 和 结 构 变 化. 在 相 同 微 球 量 条 件 下, 考 察 了 HBsAg 浓 度 对 其 在 PLA 微 球 表 面 吸 附 率 吸 附 量 体 外 活 性 和 结 构 的 影 响, 结 果 分 别 如 图 和 所 示. 图 表 明, 随 HBsAg 浓 度 增 加,HBsAg 吸 附 率 逐 渐 降 低, 而 单 位 质 量 微 球 吸 附 的 HBsAg 量 逐 渐 增 加, 但 HBsAg 浓 度 增 加 到 µg/ml 后,HBsAg 吸 附 量 增 加 趋 于 平 缓. 可 能 是 反 应 开 始 阶 段, 虽 然 HBsAg 浓 度 增 大 可 暂 时 增 加 单 位 质 量 微 球 吸 附 的 抗 原 量, 但 达 到 一 定 浓 度 后, 每 个 PLA 微 球 表 面 对 HBsAg 的 吸 附 达 到 饱 和, 即 HBsAg 的 吸 附 速 率 和 解 吸 速 率 相 等, 导 致 单 个 微 球 的 HBsAg 吸 附 量 不 再 增 加 ; 表 面 吸 附 的 HBsAg 分 子 可 能 也 会 对 溶 液 中 的 HBsAg 有 静 电 排 斥 或 空 间 位 阻 作 用, 从 而 阻 止 游 离 HBsAg 进 一 步 在 微 球 表 面 吸 附. 随 HBsAg 浓 度 增 加,HBsAg 活 性 保 留 也 增 大. 这 可 能 是 由 于 HBsAg 在 PLA 微 球 疏 水 表 面 上 吸 附 时, 其 聚 集 程 度 与 浓 度 呈 负 相 关, 即 高 浓 度 HBsAg 具 有 一 定 的 抵 抗 界 面 吸 附 导 致 的 HBsAg 聚 集 和 失 活 的 能 力. 8 Concentration of HBsAg (µg/ml) Concentration of HBsAg (µg/ml) 图 HBsAg 浓 度 对 其 在 PLA 微 球 表 面 吸 附 率 生 物 活 性 保 留 和 吸 附 量 的 影 响 Fig. Effect of HBsAg concentration on adsorption rate, bioactivity retention and adsorption amounts on surface of PLA microspheres Adsorbed HBsAg (µg/mg) Absorbance at 8 nm (mau) (a) Before adsorption HBsAg (µg/ml) 8 图 HBsAg 浓 度 对 其 在 PLA 微 球 表 面 吸 附 前 后 聚 集 行 为 的 影 响 (HPSEC 谱 图 ) Fig. Effect of HBsAg concentration on HBsAg aggregation before and after adsorption on surface of PLA microspheres (HPSEC analysis) Absorbance at 8 nm (mau) 7 (b) After adsorption HBsAg (µg/ml) 8 不 同 HBsAg 浓 度 下 对 抗 原 的 HPSEC 分 析 结 果 ( 如 图 所 示 ) 也 证 实 了 上 述 推 测. 由 图 (a) 可 以 看 出, 无 微 球 时, 抗 原 浓 度 从 µg/ml 增 加 到 µg/ml, 其 聚 集 体 峰 所 占 比 例 几 乎 没 有 变 化, 即 单 纯 的 HBsAg 溶 液 中 HBsAg 浓 度 对 其 聚 集 几 乎 没 有 影 响 ; 而 当 不 同 浓 度 HBsAg 经 微 球 吸 附 后, 其 色 谱 峰 形 发 生 较 大 变 化, 表 明 微 球 表 面 确 实 会 对 HBsAg 结 构 产 生 影 响. 如 图 (b) 所 示, 当 抗 原 浓 度 为 µg/ml 时,HBsAg 单 体 峰 与 聚 集 体 峰 面 积 比 很 小, 说 明 低 浓 度 HBsAg 与 微 球 吸 附 后, 导 致 HBsAg 严 重 聚
过 程 工 程 学 报 第 卷 集 ; 但 随 HBsAg 浓 度 增 加, 溶 液 中 HBsAg 聚 集 体 含 量 有 逐 渐 减 少 的 趋 势, 说 明 高 浓 度 HBsAg 可 减 少 HBsAg 在 吸 附 过 程 中 的 聚 集. 这 可 能 是 因 为 在 有 限 的 体 系 中, 随 HBsAg 浓 度 增 加, 单 个 HBsAg 与 微 球 的 接 触 面 积 减 小, 碰 撞 机 会 也 变 小, 同 时 HBsAg 的 结 构 变 性 会 被 微 球 表 面 高 吸 附 量 的 HBsAg 分 子 的 位 阻 效 应 阻 止, 从 而 导 致 高 浓 度 HBsAg 对 吸 附 过 程 中 聚 集 的 抑 制, 使 吸 附 后 HBsAg 的 活 性 保 留 增 加. 7 (a) (b) 8 7 Temperature ( ) 7 Temperature ( ) 图 吸 附 温 度 对 HBsAg 的 吸 附 率 和 生 物 活 性 保 留 的 影 响 Fig. Effect of adsorption temperature on adsorption rate and bioactivity retention of HBsAg.. 温 度 的 影 响 温 度 会 影 响 HBsAg 分 子 的 布 朗 运 动 行 为, 进 而 影 响 HBsAg 与 单 个 微 球 表 面 发 生 碰 撞 吸 附 的 机 会, 导 致 HBsAg 在 微 球 表 面 吸 附 行 为 的 变 化, 对 HBsAg 的 活 性 保 留 和 结 构 产 生 影 响. 因 此 固 定 其 他 条 件 (ph 7., 9 g/l NaCl, mg PLA, µg/ml HBsAg), 考 察 了 温 度 对 HBsAg 吸 附 率 体 外 活 性 和 结 构 的 影 响, 结 果 分 别 如 图 和 所 示. 图 (a) 表 明, 低 温 ( ) 时,HBsAg 吸 附 率 很 低, 仅 为 % 左 右, 但 随 吸 附 温 度 升 高,HBsAg 吸 附 率 逐 渐 增 大. 这 是 由 于 在 ph 7. 的 中 性 盐 溶 液 中, 微 球 吸 附 HBsAg 的 主 要 驱 动 力 是 疏 水 相 互 作 用 力, 通 常 情 况 下, 在 一 定 温 度 范 围 内 疏 水 相 互 作 用 力 会 随 温 度 升 高 而 增 强 [], 导 致 HBsAg 吸 附 率 增 大. 低 温 ( ) 下 HBsAg 的 活 性 最 高 [ 图 (b)], 几 乎 % 保 留, 而 随 温 度 升 高,HBsAg 活 性 逐 渐 降 低, 在 较 高 温 度 (7 ) 下 HBsAg 活 性 仅 为 原 来 的 %. 这 是 因 为, 一 方 面 吸 附 温 度 越 高,HBsAg 与 微 球 间 的 疏 水 作 用 力 增 强, 微 球 的 疏 水 作 用 对 HBsAg 结 构 破 坏 严 重 ; 另 一 方 面, 温 度 升 高, HBsAg 的 布 朗 运 动 越 激 烈, 导 致 HBsAg 分 子 间 及 其 与 微 球 的 碰 撞 概 率 增 大, 造 成 微 球 界 面 对 HBsAg 结 构 破 坏 增 加, 同 时 HBsAg 分 子 自 身 聚 集 也 导 致 其 活 性 降 低. 图 对 不 同 温 度 下 HBsAg 的 HPSEC 分 析 结 果 也 印 证 了 上 述 推 测, 图 中 min 处 的 HBsAg 单 体 峰 随 吸 附 温 度 升 高 而 降 低, 而 min 的 HBsAg 聚 集 体 峰 却 逐 渐 增 加, 说 明 溶 液 中 HBsAg 聚 集 体 含 量 在 不 断 增 多. 结 论 通 过 对 HBsAg 在 PLA 微 球 表 面 吸 附 活 性 和 结 构 Absorbance at 8 nm (mau) Temperature ( ) 7 图 吸 附 温 度 对 HBsAg 聚 集 行 为 的 影 响 (HPSEC 谱 图 ) Fig. HPSEC analysis of effect of adsorption temperature on HBsAg aggregation 变 化 影 响 的 系 统 研 究, 得 到 如 下 结 论 : () 采 用 快 速 膜 乳 化 技 术 与 溶 剂 挥 发 法 成 功 制 备 了 8 nm 左 右 粒 径 均 一 的 PLA 微 球, 微 球 表 面 圆 整 光 滑, HBsAg 分 子 能 通 过 疏 水 相 互 作 用 较 好 地 吸 附 在 其 表 面. () 偏 酸 性 溶 液 中 HBsAg 吸 附 率 最 大 但 活 性 保 留 最 小, 而 偏 碱 性 溶 液 更 有 利 于 HBsAg 活 性 保 留. 随 盐 浓 度 增 加,HBsAg 吸 附 率 先 增 大 后 减 小, 而 HBsAg 活 性 保 留 逐 渐 降 低. 高 剂 量 微 球 有 利 于 提 高 HBsAg 吸 附 率, 但 同 时 会 降 低 HBsAg 的 活 性 保 留. 在 浓 度 µg/ml 的 HBsAg 溶 液 中, 随 HBsAg 浓 度 增 加,HBsAg 吸 附 率 逐 渐 降 低, 而 单 位 质 量 微 球 吸 附 的 HBsAg 量 逐 渐 增 加, 并 在 浓 度 增 加 到 µg/ml 后, 吸 附 达 到 饱 和. 吸 附 过 程 中 高 浓 度 HBsAg 可 更 好 地 保 留 HBsAg 活 性. 吸 附 温 度 高 可 增 大 HBsAg 吸 附 率, 但 同 时 也 会 降 低 HBsAg 活 性 保 留.
第 期 李 娜 等 : 乙 肝 表 面 抗 原 在 微 球 表 面 的 吸 附 行 为 活 性 和 结 构 变 化 7 参 考 文 献 : [] Couvreur P, Blanco-Prieto M J, Puisieux F. Multiple Emulsion Technology for the Design of Microspheres Containing Peptides and Oligopeptides [J]. Adv. Drug De. Rev., 997, 8(): 8 87. [] Perugini P, Genta I, Pavanetto F. Study on Glycolic Acid Delivery by Liposomes and Microspheres [J]. Int. J. Pharm.,, 9(): l. [] 田 瑞, 王 连 艳, 吴 颉, 等. 快 速 膜 乳 化 法 制 备 粒 径 均 一 的 PLGA 微 球 和 微 囊 [J]. 过 程 工 程 学 报, 9, 9(): 7 7. [] Jintapattanakit A, Junyaprasert V B, Sitterberg J, et al. Peroral Delivery of Insulin Using Chitosan Derivatives: A Comparative Study of Polyelectrolyte Nanocomplexes and Nanoparticles [J]. Int. J. Pharm., 7, (/): 9. [] Kamei N, Morishita M, Ehara J, et al. Permeation Characteristics of Oligoarginine through Intestinal Epithelium and Its Usefulness for Intestinal Peptide Drug Delivery [J]. J. led Release, 8, (): 9 99. [] Russ V, Günther M, Halama A, et al. Oligoethylenimine-grafted Polypropylenimine Dendrimers as Degradable and Biocompatible Synthetic Vectors for Gene Delivery [J]. J. led Release, 8, ():. [7] Putney S D. Encapsulation of Proteins for Improved Delivery [J]. Curr. Opin. Chem. Biol., 998, (): 8. [8] Miyata T, Uragami T, Nakamae K. Biomolecule-sensitive Hydrogels [J]. Adv. Drug Del. Rev.,, (): 79 98. [9] Vila A, Sánchez A, Tobío M, et al. Design of Biodegradable Particles for Protein Delivery [J]. J. led Release,, 78():. [] Li X H, Zhou S B, Wu X R. Poly-DL-lactide-poly-(ethylene glycol) Microspheres as Oral and Parenteral Delivery Systems for Hepatitis B Antigen [J]. J. Appl. Polym. Sci.,, 8(): 8 8. [] Weissenböck A, Wirth M, Gabor F. WGA-grafted PLGA Nanospheres: Preparation and Association with Caco- Single Cells [J]. J. led Release,, 99(): 8 9. [] Li Y, Bi J X, Su Z G, et al. Characterization of the Large Size Aggregation of Hepatitis B Virus Surface Antigen (HBsAg) Formed in Ultrafiltration Process [J]. Process Biochem., 7, (): 9. [] Zhou W B, Bi J X, Janson J C, et al. Molecular Characterization of Recombinant Hepatitis B Surface Antigen from Chinese Hamster Ovary and Hansenula Polymorpha Cells by High-performance Size Exclusion Chromatography and Multi-angle Laser Light Scattering [J]. J. Chromatogr. B,, 88(): 7 77. [] Dreesman G R, Hollinger F B, Suriano J R, et al. Biophysical and Biochemical Heterogeneity of Purified Hepatitis B Antigen [J]. J. Virol., 97, (): 9 7. [] Diminsky D, Moav N, Gorecki M. Physical, Chemical and Immunological Stability of CHO-derived Hepatitis B Surface Antigen Particles [J]. Vaccine,, 8(/): 7. [] Tleugabulova D, Falcón V, Sewer M. Aggregation of Recombinant Hepatitis B Surface Antigen in Pichia pastoris [J]. J. Chromatogr. B, 998, 7(/): 9 9. [7] Anderson J M, Shive M S. Biodegradation and Biocompatibility of PLA and PLGA Microspheres [J]. Adv. Drug Del. Rev., 997, 8():. [8] Tamber H, Johansen P, Merkle H, et a. Formulation Aspects of Biodegradable Polymeric Microspheres for Antigen Delivery [J]. Adv. Drug De. Rev.,, 7(): 7 7. [9] Wei Q, Wei W, Lai B. Uniform-sized PLA Nanoparticles: Preparation by Premix Membrane Emulsification [J]. Int. J. Pharm., 8, 9(): 9 97. [] Pace C N, Shirley B A, McNutt M, et al. Forces Contributing to the Conformational Stability of Proteins [J]. FASEB J., 99, (): 7 8. [] Goto Y, Fink A L. Conformational States of b-lactamase: Molten-globule States at Acidic and Slkaline ph with High Salt [J]. Biochemistry, 989, 8(): 9 9. [] Kohn W D, Kay C M, Hodges R S. Salt Effects on Protein Stability: Two-stranded Alpha-Helical Coiled Coils Containing Inter- or Intrahelical Ion Pairs [J]. J. Mol. Biol., 997, 7(): 9. [] Jaenicke R. Protein Structure and Function at Low Temperatures [J]. Philos. Trans. R. Soc. London B, 99, (7):. Adsorption Behavior, Bioactivity and Structure of HBsAg on Surface of PLA Microspheres LI Na,, WANG Lian-yan, WU You-bin,, ZENG Ye-jing,, MA Guang-hui, SU Zhi-guo (. State Key Lab of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 9, China;. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 9, China;. Collage of Life Science and Technoogy, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 9, China) Abstract: Relatively uniform-sized poly(lactic acid) (PLA) microspheres with the average particle size of 8 nm were successfully prepared by premix membrane emulsification combined with solvent evaporation method. The effects of ph value, salt concentration, amount of PLA microspheres, HBsAg concentration and adsorption temperature on the adsorption efficiency, bioactivity retention and structure of HBsAg were systemically investigated. The results showed that the adsorption efficiency of HBsAg on the surface of PLA microspheres could reach more than % under the conditions of ph. phosphate buffer, g/l NaCl concentration, mg/ml PLA microspheres, µg/ml HBsAg concentration and 7 adsorption temperature. The bioactivity retention of HBsAg exceeded 98% under with the following conditions: ph value of phosphate buffer at 8., concentration of NaCl g/l, amount of microspheres mg/ml and initial HBsAg concentration µg/ml. Key words: poly(lactic acid) microspheres; HBsAg; adsorption; bioactivity; structure