病 毒 学 检 验 实 验 讲 义 实 验 一 细 胞 的 传 代 培 养 与 病 毒 接 种 一 实 验 目 的 1 熟 悉 单 层 细 胞 培 养 技 术 的 操 作 步 骤 会 判 断 培 养 液 的 酸 碱 度, 识 别 细 胞 的 生 长 情 况 2 掌 握 单 层 细 胞 培 养 上 接 种 病 毒 的 方 法 二 实 验 原 理 细 胞 株 长 成 单 层 后 可 用 酶 消 化 下 来 形 成 单 个 细 胞, 分 装 后 在 一 定 条 件 下 培 养 又 繁 殖 形 成 单 层, 从 而 不 断 扩 大 细 胞 培 养 物 供 试 验 用 病 毒 接 种 细 胞, 感 染 细 胞 后, 在 细 胞 内 增 殖, 大 多 数 能 引 起 细 胞 病 变, 无 需 染 色 即 可 直 接 在 普 通 光 学 显 微 镜 下 观 察 有 的 细 胞 不 产 生 病 变, 但 能 改 变 培 养 液 的 ph 值, 或 出 现 红 细 胞 吸 附 及 血 凝 现 象 ( 如 流 感 病 毒 和 副 流 感 病 毒 ), 有 时 还 可 用 免 疫 荧 光 技 术 检 查 细 胞 中 的 病 毒 和 细 胞 变 化 三 仪 器 与 试 剂 病 毒 ( 肠 道 病 毒 悬 液 ) 细 胞 培 养 液 (RPMI-1640,10% 小 牛 血 清 ) 细 胞 生 长 液 (RPMI-1640, 含 10% 小 牛 血 清 及 100u/ml 双 抗 ) Hanks 液 2.5g/L 胰 酶 0.1g/L 中 性 红 无 菌 蒸 馏 水 培 养 瓶 各 种 无 菌 吸 管 滴 管 无 菌 小 试 管 试 管 架 水 浴 箱 CO2 培 养 箱 倒 置 显 微 镜 等 四 实 验 方 法 1. 细 胞 培 养 器 材 处 理 细 胞 培 养 所 用 器 材 处 理 得 好 坏 是 决 定 细 胞 培 养 成 败 的 首 要 问 题, 故 必 须 认 真, 切 不 可 有 丝 毫 疏 忽 (1) 玻 璃 器 材 处 理 法 1) 未 使 用 过 的 玻 璃 器 材 先 用 自 来 水 冲 洗 干 净, 再 以 热 碱 水 (1g/L~5g/L) 煮 沸 15min 后, 用 自 来 水 冲 洗 干 净, 置 清 洁 液 中 泡 1d~2d, 取 出 后 经 自 来 水 冲 洗 10 次, 再 用 去 离 子 水 冲 洗 3 次, 晾 干 后 包 装,160 2h 干 热 灭 菌 2) 已 使 用 过 的 玻 璃 器 材 如 未 污 染, 则 按 上 述 方 法 处 理 ; 如 污 染 者, 则 需 用 1%HCl 浸 泡 24h 或 煮 沸 20min~30min 后, 再 按 上 述 方 法 处 理 (2) 橡 皮 塞 处 理 法 未 污 染 的 塞 子 用 自 来 水 冲 洗 干 净 ( 污 染 塞 子 先 用 自 来 水 煮 沸 消 毒 ), 再 用 去 离 子 水 浸 泡 数 天, 换 新 鲜 去 离 子 水 煮 沸 5min, 晾 干 后 包 装, 最 后 以 103.43kPa 高 压 灭 菌 20min~30min 2. 选 生 长 良 好 的 Hela 细 胞 一 瓶, 轻 轻 摇 动 使 细 胞 表 面 的 碎 片 等 浮 起, 连 同 生 长 液 一 起 倒 入 废 液 瓶 内, 再 用 Hanks 液 洗 涤 一 次 3. 从 无 细 胞 面 一 侧 加 入 适 量 ( 能 覆 盖 细 胞 面 ) 的 2.5g/L 的 胰 酶 溶 液, 翻 转 培 养 瓶, 使 消 化
液 浸 没 细 胞 1min 左 右, 再 翻 转 培 养 瓶 使 细 胞 层 向 上, 让 残 存 胰 酶 继 续 作 用 5min~10min, 至 肉 眼 能 看 到 细 胞 面 出 现 布 纹 状 网 孔 为 止 4. 倒 掉 胰 酶, 沿 细 胞 面 加 入 原 培 养 液 2 倍 量 不 含 小 牛 血 清 的 培 养 液 洗 下 细 胞, 并 用 吸 管 用 力 吹 打 被 消 化 的 细 胞, 使 其 脱 壁 分 散, 成 为 均 匀 的 细 胞 悬 液, 补 加 10% 的 小 牛 血 清, 按 1 传 2 分 装 培 养 瓶 5. 将 培 养 瓶 平 放 于 37,5%CO2 培 养 箱 内 培 养, 于 分 装 后 30min 细 胞 便 可 贴 壁, 于 48h 可 换 生 长 液 1 次, 一 般 3d~4d 可 形 成 单 层 细 胞 6. 细 胞 病 变 效 应 (CPE) 的 观 察 (1) 接 种 病 毒 取 已 生 长 成 单 层 细 胞 培 养 瓶 2 只, 弃 去 瓶 中 液 体, 一 瓶 作 为 对 照 ( 不 加 病 毒 液 ), 另 一 瓶 滴 加 肠 道 病 毒 悬 液 1 滴, 然 后 在 两 瓶 中 均 按 原 量 加 入 培 养 液 ( 含 10% 小 牛 血 清 的 RPMI-1640 液 ), 盖 紧,37 培 养 1~2 天 (2) 观 察 结 果 于 培 养 后 18h 24h 36h 96h 在 显 微 镜 下 观 察 细 胞 病 变 效 应 (CPE), 对 照 瓶 无 细 胞 病 变, 试 验 瓶 中 病 毒 可 引 起 细 胞 圆 缩 堆 聚 及 脱 落 现 象 五 结 果 意 义 在 显 微 镜 下 观 察 到 试 验 瓶 中 单 层 细 胞 病 变 效 应 为 有 病 毒 生 长 六 注 意 事 项 1. 培 养 液 量 不 要 太 多, 应 有 足 够 的 空 间 以 保 证 细 胞 对 氧 的 需 要 2. 若 用 普 通 孵 箱 培 养, 必 须 盖 紧 盖 子 或 塞 紧 橡 皮 塞, 或 贴 紧 胶 纸, 以 防 培 养 基 碱 化, 如 用 CO2 培 养 箱 培 养 则 不 要 盖 紧 瓶 盖, 并 将 CO2 浓 度 控 制 在 5% 3. 一 般 2d 换 一 次 液, 细 胞 长 成 单 层 要 及 时 进 行 细 胞 传 代 4. 传 代 是 保 持 细 胞 在 体 外 良 好 生 长 和 建 成 永 久 性 细 胞 系 的 关 键, 应 在 对 数 期 进 行 细 胞 传 代 ; 对 贴 壁 细 胞, 酶 消 化 一 定 要 充 分 ; 传 代 培 养 时 要 严 格 无 菌 操 作 并 防 止 细 胞 之 间 交 叉 污 染 实 验 二 鸡 胚 的 培 养 与 病 毒 接 种 一 实 验 目 的 1 掌 握 鸡 胚 发 育 情 况 的 判 断 绒 毛 膜 尿 囊 腔 的 接 种 方 法 以 及 接 种 物 的 收 获 2 通 过 此 实 验, 进 一 步 规 范 无 菌 操 作 技 术 二 实 验 原 理 鸡 胚 培 养 法 为 常 用 的 病 毒 培 养 方 法 之 一, 操 作 简 单, 来 源 容 易, 对 粘 病 毒 痘 病 毒 脑 炎 病 毒 等 都 很 敏 感 鸡 胚 培 养 的 接 种 方 法, 常 用 的 有 尿 囊 腔 绒 毛 尿 囊 膜 卵 黄 囊 羊 膜 腔 接 种 法 四 种 尿 囊 腔 接 种 法 广 泛 应 用 于 流 感 病 毒 的 适 应 和 传 代 培 养, 这 些 病 毒 被 注 射 到 尿 囊 腔 后, 可 在 内 皮 细 胞 中 复 制, 复 制 的 病 毒 被 释 放 到 尿 囊 液 中, 因 此, 在 尿 囊 液 中 含 有 大 量 的 病 毒
三 实 验 材 料 1. 病 毒 液 减 毒 流 行 性 感 冒 病 毒 悬 液 2. 鸡 胚 来 亨 鸡 受 精 卵 3. 其 他 1ml 注 射 器 及 针 头 无 菌 生 理 盐 水 卵 架 检 卵 灯 碘 酒 和 酒 精 棉 球 无 菌 镊 子 无 菌 手 术 刀 剪 刀 平 皿 齿 锯 透 明 胶 带 等 四 实 验 方 法 1. 鸡 胚 准 备 选 择 健 康 来 亨 鸡 的 受 精 卵, 表 面 光 滑 干 净, 最 好 是 白 色 蛋 皮 在 培 养 前 应 保 存 于 10 左 右, 保 存 期 不 超 过 产 后 10 天 培 养 时 放 入 38 ~39 孵 卵 器 内 培 养, 相 对 湿 度 40%~70% 培 养 3 天 后, 鸡 卵 每 日 作 180 翻 动 2 次, 以 免 粘 壳 第 4 天, 用 检 卵 灯 检 查 鸡 胚 发 育 情 况, 未 受 精 卵 只 见 模 糊 的 卵 黄 黑 影, 不 见 鸡 胚 形 迹, 应 予 淘 汰 ; 受 精 卵 可 见 到 清 晰 的 血 管 和 胚 动, 且 蛋 白 一 边 和 胚 胎 一 边 界 限 分 明, 蛋 白 一 边 较 亮, 胚 胎 一 边 暗 红 色 随 后 每 天 观 察 一 次, 若 出 现 胚 动 吊 滞 或 胚 影 固 定 于 卵 壳, 或 血 管 昏 暗 模 糊, 或 胚 胎 一 边 变 黑 或 变 苍 白, 说 明 鸡 胚 将 要 死 去 或 已 死 亡, 需 随 时 淘 汰 生 长 良 好 的 鸡 胚 一 直 培 养 到 适 当 的 胚 龄 2. 鸡 胚 结 构 (1) 羊 膜 腔 位 于 胚 胎 的 外 面, 其 中 有 羊 水, 具 有 保 护 鸡 胚 不 受 创 伤 及 粘 连 的 影 响 (2) 尿 囊 腔 为 鸡 胚 的 肾 脏, 大 量 排 泄 物 集 中 在 尿 囊 腔, 培 养 第 二 天, 尿 囊 腔 分 布 于 整 个 蛋 的 大 部, 一 般 6 天 时 尿 囊 液 1ml,11 天 为 6ml,13 天 达 10ml (3) 绒 毛 尿 囊 膜 位 于 蛋 壳 膜 内, 在 发 育 过 程 中, 尿 囊 腔 扩 大 与 绒 毛 膜 重 叠, 形 成 绒 毛 尿 囊 膜, 此 处 有 极 丰 富 的 血 管, 是 胚 胎 与 外 界 交 换 气 体 的 场 所 (4) 卵 黄 囊 胚 胎 发 育 过 程 中 养 料 的 来 源 3. 尿 囊 腔 接 种 (1) 取 9~12 日 龄 鸡 胚, 划 出 气 室 端, 在 胚 胎 面 与 气 室 交 界 的 边 缘 上 约 1mm 处 或 在 胚 胎 的 对 侧 处, 避 开 血 管 作 一 标 记, 作 为 注 射 点, 用 碘 酒 和 酒 精 消 毒 后 用 无 菌 刀 尖 在 记 号 处 钻 一 小 孔 (2) 用 无 菌 注 射 器 吸 取 流 行 性 感 冒 病 毒 悬 液, 针 头 垂 直 或 与 卵 壳 成 30 交 角, 由 小 孔 处 刺 入 0.5ml~1ml, 注 入 病 毒 液 0.1ml~0.2ml( 见 图 2-10-1) 图 2-10-1 图 2-10-1 尿 囊 腔 接 种 法 (3) 用 透 明 胶 带 封 闭 注 射 孔, 放 卵 架 上 置 33 ~37 培 养 箱 内 培 养, 每 日 检 卵 一 次, 培 养 48h~72h, 期 间 如 在 24h 内 死 亡 者 为 非 特 异 性 死 亡, 弃 之 (4) 收 获 前 先 将 鸡 胚 放 4 冰 箱 6h 或 过 夜, 使 血 管 收 缩, 血 液 凝 固, 避 免 解 剖 时 出 血
若 鸡 胚 已 死, 则 不 需 冰 冻 待 收 获 的 鸡 胚 先 用 碘 酒 和 酒 精 消 毒 气 室 端 卵 壳, 用 无 菌 镊 子 沿 气 室 边 缘 将 蛋 壳 揭 去, 撕 去 卵 膜, 可 见 毛 尿 囊 膜 在 无 大 血 管 处 用 无 菌 小 镊 子 稍 提 起 此 膜, 以 无 菌 毛 细 吸 管 刺 破 此 膜 并 吸 取 尿 囊 液, 收 集 于 无 菌 试 管 内 一 般 可 吸 得 4ml~5ml 作 无 菌 试 验 后 将 尿 囊 液 保 存 于 低 温 冰 箱 中 备 用 也 可 直 接 将 尿 囊 液 作 血 凝 试 验 和 血 凝 抑 制 试 验 五 结 果 意 义 可 通 过 观 察 鸡 胚 是 否 死 亡 来 判 断 有 些 病 毒 是 否 生 长, 但 更 多 情 况 下 需 通 过 血 凝 试 验 血 细 胞 吸 附 或 免 疫 荧 光 等 技 术 显 示 鸡 胚 尿 囊 液 中 有 无 病 毒 存 在 六 注 意 事 项 1. 最 好 选 用 SPF 鸡 群 所 产 鸡 蛋, 如 果 没 有 可 用 健 康 鸡 群 所 产 的 受 精 蛋, 白 色 薄 壳 的 鸡 蛋 比 红 壳 鸡 蛋 更 容 易 观 察 胚 胎 的 生 长 情 况 2. 受 精 卵 人 孵 后 要 注 意 翻 蛋 3. 检 卵 时 注 意 避 免 照 蛋 时 间 过 长 引 起 鸡 胚 温 度 下 降 过 大 4. 接 种 鸡 胚 时 尽 可 能 避 开 血 管 丰 富 区 域 5. 对 收 获 得 尿 囊 液 要 进 行 杂 菌 实 验 6. 温 箱 底 盘 中 要 加 人 足 够 量 的 蒸 馏 水 以 保 持 一 定 的 湿 度 实 验 三 双 抗 原 夹 心 法 测 定 血 清 中 乙 肝 表 面 抗 体 一 实 验 目 的 1 掌 握 用 ELISA 方 法 检 测 病 人 血 清 乙 型 肝 炎 病 毒 的 感 染 标 志 物 的 原 理 与 方 法 2 掌 握 病 毒 抗 体 检 测 的 操 作 步 骤 试 验 结 果 的 判 断 以 及 试 验 的 注 意 事 项 通 过 实 验, 加 深 对 实 验 原 理 的 认 识 和 理 解, 对 实 验 影 响 因 素 的 认 识 二 实 验 原 理 将 已 纯 化 乙 肝 表 面 抗 原 (HBsAg) 包 被 于 微 孔 酶 标 板 上, 与 待 检 血 清 中 的 相 应 抗 体 结 合 后, 加 人 酶 标 抗 原 (HBsAg-HRP), 形 成 包 被 乙 肝 表 面 抗 原 - 待 检 乙 肝 表 面 抗 体 - 酶 标 乙 肝 表 面 抗 原, 用 洗 涤 的 方 法 将 其 与 其 他 物 质 分 开, 最 后 结 合 在 固 相 载 体 上 的 酶 量 与 标 本 中 受 检 物 质 的 量 成 一 定 的 比 例 加 入 酶 反 应 的 底 物 后, 底 物 被 酶 催 化 变 为 有 色 产 物, 产 物 的 量 与 标 本 中 受 检 物 质 的 量 直 接 相 关, 故 可 根 据 颜 色 反 应 的 深 浅 刊 物 定 性 或 定 量 分 析 由 于 酶 的 催 化 频 率 很 高, 故 可 极 大 地 地 放 大 反 应 效 果, 从 而 使 测 定 方 法 达 到 很 高 的 敏 感 度 三 仪 器 与 试 剂 酶 标 仪 微 量 加 样 枪 恒 温 水 浴 箱 乙 肝 表 面 抗 体 ELISA 试 剂 盒 ( 包 括 已 包 被 抗 原 的 固 相 载 体 酶 标 记 的 抗 原 参 考 标 准 品 和 控 制 血 清 酶 联 物 ( 结 合 物 ) 及 标 本 的 稀 释 液 洗 涤 液 酶 反 应 终 止 液 ) 待 检 血 清 四 实 验 方 法 1. 加 受 检 标 本 : 取 已 包 被 抗 原 的 固 相 载 体, 加 待 检 血 清, 一 定 温 度 下, 使 之 与 固 相 抗
原 接 触 反 应 一 段 时 间, 让 标 本 中 的 抗 体 与 固 相 载 体 上 的 抗 原 结 合, 形 成 固 相 抗 体 复 合 物 洗 涤 除 去 其 他 未 结 合 的 物 质 2. 加 酶 标 抗 原 : 使 固 相 免 疫 复 合 物 上 的 抗 体 与 酶 标 抗 原 结 合 彻 底 洗 涤 未 结 合 的 酶 标 抗 原 此 时 固 相 载 体 上 带 有 的 酶 量 与 标 本 中 受 检 物 质 的 量 正 相 关 3. 加 底 物 : 夹 心 式 复 合 物 中 的 酶 催 化 底 物 成 为 有 色 产 物 4. 用 酶 标 仪 进 行 测 定 : 根 据 颜 色 反 应 的 程 度 进 行 该 抗 原 的 定 性 或 定 量 5. 用 酶 标 仪 以 试 剂 空 白 孔 校 零 点, 当 标 本 吸 光 度 值 / 阴 性 对 照 吸 光 度 值 ( 即 P/N)>2.1 可 判 断 为 阳 性 ; 当 标 本 吸 光 度 值 / 阴 性 对 照 吸 光 度 值 <2.1 可 判 断 为 阴 性 阴 性 对 照 A 值 <0.1 时, 按 0.1 计 五 结 果 意 义 乙 肝 表 面 抗 体 呈 阳 性 状 态 主 要 有 以 下 三 方 面 的 意 义 : 1. 单 项 抗 -HBs 阳 性 : 接 种 乙 肝 疫 苗 成 功 的 标 志 2. 与 抗 -HBc 抗 -HBe 同 时 阳 性 : 机 体 感 染 乙 肝 病 毒 后 发 生 免 疫 应 答, 乙 肝 病 毒 被 清 除, 机 体 获 得 抵 御 乙 肝 病 毒 再 次 侵 袭 的 特 异 性 免 疫 力 3. 与 HBsAg 同 时 阳 性 相 关 的 因 素 : (1) 感 染 了 不 同 的 乙 肝 病 毒 亚 型 (2) 感 染 了 S 基 因 变 异 的 乙 肝 病 毒 (3) 免 疫 功 能 低 下, 抗 -HBs 不 能 清 除 HBsAg (4) 正 处 于 抗 原 - 抗 体 动 态 平 衡 阶 段 六 注 意 事 项 1. 载 体 的 选 择 与 处 理 : 载 体 的 吸 附 效 果 主 要 与 塑 料 的 类 型 和 表 面 类 型 有 关 目 前 应 用 最 广 的 固 相 载 体 是 聚 苯 乙 烯 微 量 反 应 板 聚 苯 乙 烯 塑 料 板 有 聚 苯 乙 烯 硬 板 (PS) 和 聚 氯 乙 烯 软 板 (PVC) 之 分, 其 中 PS 板 不 易 变 形, 容 易 洗 涤 操 作, 阴 性 背 景 好, 故 一 般 ELISA 试 验 多 选 择 微 孔 聚 苯 乙 烯 硬 板 2. 待 检 血 清 : 待 检 血 清 中 的 免 疫 球 蛋 白 与 固 相 载 体 易 出 现 非 特 异 的 吸 附 如 待 检 血 清 中 抗 体 浓 度 太 高, 抗 体 分 子 间 相 互 作 用 形 成 不 稳 定 的 多 层 吸 附, 影 响 ELISA 的 重 复 性, 若 待 测 血 清 中 免 疫 球 蛋 白 含 量 高, 则 产 生 非 特 异 性 吸 附, 最 后 结 果 的 本 底 显 色 就 深 聚 合 的 免 疫 球 蛋 白 与 固 相 载 体 结 合 的 速 度 比 不 聚 合 者 快, 易 造 成 假 阳 性 结 果, 加 热 灭 活 血 清 补 体 或 反 复 冻 融 血 清 都 易 形 成 聚 合 的 球 蛋 白, 因 此, 在 实 验 过 程 中 应 避 免 加 热 灭 活 血 清 和 对 血 清 反 复 冻 融 待 测 血 清 浓 度 过 低 也 会 影 响 抗 原 一 抗 体 之 间 的 免 疫 反 应 分 离 待 检 血 清 时 最 好 是 室 温 自 然 凝 固 析 出 后 在 吸 出, 如 放 置 在 4 以 下 凝 固, 很 容 易 丢 失 大 量 的 抗 体 3. 洗 涤 : 在 整 个 实 验 过 程 中 每 一 步 都 需 要 进 行 洗 涤, 主 要 是 将 没 有 结 合 的 抗 原 抗 体 游 离 的 酶 结 合 物 以 及 血 清 中 与 反 应 无 关 的 其 他 成 分 等 去 除, 而 且 充 分 洗 涤 可 防 止 聚
合 球 蛋 白 对 固 相 载 体 的 非 特 异 性 吸 附 常 用 的 是 含 0.05%Tween-20 的 PBS 洗 涤 液 Tween-20 的 作 用 助 溶 剂 可 减 少 表 面 的 非 特 异 性 吸 附