蛋白质分离介质的选择

蛋 白 质 分 离 介 质 的 选 择 ( 二 配 基 及 基 质 的 选 择 ) 蛋 白 质 分 离 介 质 选 择 要 同 时 考 虑 两 方 面, 一 是 配 基, 也 就 是 选 择 色 谱 模 式 ; 二 是 选 择 基 质, 包 括 基 质 的 种 类 和 排 阻 极 限 的 选 择 根 据 目 标 产 品 与 杂 质 的 性 质 差 异 选 择 介 质 是 介 质 选 择 的 主 要 依 据 选 择 了 介 质 也 就 是 选 择 了 分 离 模 式 目 标 产 品 与 杂 质 在 分 子 大 小 等 电 点 pi 不 失 活 或 可 逆 失 活 条 件 下 的 疏 水 性 与 亲 和 配 基 的 作 用 四 种 性 质 上 的 差 异 是 介 质 选 择 的 主 要 依 据 之 一 产 品 与 杂 质 某 方 面 的 性 质 有 大 的 差 异, 就 可 用 来 做 为 分 离 方 法 选 择 的 依 据 目 标 产 品 与 杂 质 分 子 大 小 差 异 大 可 用 凝 胶 色 谱 分 离 ; 等 电 点 pi 差 异 大 可 用 离 子 交 换 色 谱 分 离 ; 不 失 活 或 可 逆 失 活 条 件 下 的 疏 水 性 差 异 大 可 用 疏 水 色 谱 分 离 ; 与 某 个 亲 和 配 基 有 特 异 作 用 的 可 用 亲 和 色 谱 分 离 在 凝 胶 色 谱 离 子 交 换 疏 水 和 反 相 亲 和 类 色 谱 中, 反 相 色 谱 一 般 容 易 使 样 品 失 活, 常 用 于 定 性 定 量 分 析 和 氨 基 酸 序 列 分 析, 不 太 用 于 制 备 ; 其 他 的 色 谱 方 法, 只 要 条 件 选 择 合 适, 都 可 以 得 到 高 的 活 性 回 收 率, 可 以 用 于 制 备 分 离 基 质 主 要 有 3 大 类 : 聚 多 糖, 如 交 联 琼 脂 糖 葡 聚 糖 基 质 ; 硅 胶 和 多 孔 玻 璃 ; 有 机 聚 合 物 ( 聚 苯 乙 烯 等 ) 由 于 目 标 产 品 限 定 在 蛋 白 质, 分 子 量 比 较 大, 用 于 小 分 子 的 小 孔 填 料 肯 定 不 能 用 因 为, 多 孔 填 料 的 总 的 表 面 积, 有 90~95% 是 在 孔 内, 球 型 填 料 的 球 面 上 的 面 积 只 占 有 5~10% 小 孔 填 料 的 柱 容 量 太 小 大 孔 硅 胶 和 多 孔 玻 璃, 与 蛋 白 质 生 物 相 容 性 差, 大 孔 硅 胶 价 格 贵, 表 面 活 性 基 团 少, 制 备 的 填 料 会 残 留 酸 性 的 硅 羟 基, 造 成 非 特 异 性 吸 附 大 孔 有 机 聚 合 物 疏 水 性 强, 与 蛋 白 质 生 物 相 容 性 太 差, 不 作 亲 水 性 处 理 无 法 用 于 蛋 白 质 分 离 交 联 琼 脂 糖 葡 聚 糖 基 质 是 最 适 合 用 于 蛋 白 质 分 离 的 基 质 材 料, 这 两 类 材 料 生 物 相 容 性 好, 无 非 特 异 性 吸 附, 表 面 有 大 量 羟 基, 可 用 于 连 接 配 基, 制 得 各 种 填 料 琼 脂 糖 介 质 利 用 琼 脂 糖 热 溶 液 冷 却 可 凝 胶 化 的 特 点 制 备 成 微 球, 热 溶 液 在 冷 却 时 先 形 成 螺 旋 状 纤 维 束, 最 后 形 成 纤 维 束 网 状 结 构, 形 成 的 孔 的 大 小 ( 也 就 是 排 阻 极 限 ) 取 决 于 糖 浓 度 见 下 图 下 图 是 琼 脂 糖 微 球 的 电 镜 图, 显 示 了 其 微 观 结 构 特 征

琼 脂 糖 微 球 及 其 交 联 后 的 产 品 一 般 叫 4B CL4B 4FF 6B CL6B 6FF, 这 些 产 品 再 键 合 上 不 同 基 团 得 到 离 子 交 换 疏 水 亲 和 色 谱 填 料 4B CL4B 4FF 制 备 时 的 糖 浓 度 为 4%, 排 阻 极 限 为 6 万 ~2000 万 6B CL6B 6FF 制 备 时 的 糖 浓 度 为 6%, 排 阻 极 限 为 1 万 ~400 万 4B 6B 耐 压 低 ;CL4B CL6B 耐 压 稍 高 一 点, 仍 很 低 ; 4FF 6FF 耐 压 较 高, 使 用 压 力 可 到 0.15 或 0.3MPa 葡 聚 糖 是 线 形 结 构, 用 环 氧 氯 丙 烷 交 联 成 球 因 糖 浓 度 和 交 联 度 不 同, 得 到 不 同 排 阻 极 限 的 微 球 葡 聚 糖 微 球 排 阻 极 限 范 围 小 些, 在 使 用 时 不 同 条 件 下 柱 体 积 会 有 较 大 的 变 化, 已 逐 渐 较 少 用 于 离 子 交 换 疏 水 亲 和 色 谱, 较 多 用 于 凝 胶 色 谱 1. 凝 胶 色 谱 蛋 白 质 凝 胶 色 谱 介 质 是 一 些 表 面 亲 水 性 的 多 孔 微 球, 主 要 是 使 用 无 配 基 的 交 联 琼 脂 糖 葡 聚 糖 基 质 介 质 ; 其 他 如 改 性 大 孔 硅 胶 基 质 改 性 大 孔 有 机 聚 合 物 基 质 一 般 用 于 分 析 理 想 的 凝 胶 色 谱 基 质 在 与 样 品 接 触 部 分 不 应 有 离 子 基 团, 尽 可 能 少 的 疏 水 基 团 大 家 知 道, 凝 胶 色 谱 分 离 机 理 是 分 子 量 大 的 能 进 入 胶 的 大 孔, 进 入 浅, 流 出 快 ; 分 子 小 的 进 入 胶 的 大 孔 和 较 小 的 孔, 进 入 深, 流 出 慢 选 择 凝 胶 色 谱 介 质 要 特 别 注 意 其 排 阻 极 限 下 面 为 琼 脂 糖 葡 聚 糖 基 质 凝 胶 色 谱 介 质 品 种 及 性 能 表 凝 胶 品 种 排 阻 极 限 耐 压 MPa 应 用 生 产 厂 家 琼 脂 糖 4B/CL4B/4FF 6 万 ~2000 万 0.008/0.012/0.15 大 分 子 琼 脂 糖 6B/CL6B/6FF 1 万 ~400 万 0.02/0.03/0.3 大 分 子 葡 聚 糖 25 1000~5000 0.15 脱 盐, 肽 葡 聚 糖 50 1000~30000 脱 盐, 肽, 分 子 量 测 定 葡 聚 糖 75 3000~80000 小 分 子 量 蛋 白 质 分 离, 分 子 量 测 定 Sephacryl s-100 10 3 ~10 5 0.2 肽, 小 蛋 白 美 国 GE, 保 赛 在 研 Sephacryl s-200 5 10 3 ~2.5 10 5 0.2 蛋 白 质 美 国 GE, 保 赛 在 研 Sephacryl s-300 10 4 ~1.5 10 6 0.2 蛋 白 质 美 国 GE, 保 赛 在 研 凝 胶 色 谱 上 样 量 较 小 ; 分 辨 率 较 差, 分 开 的 球 形 蛋 白 质 分 子 量 差 异 至 少 要 在 30% 以 上 多 糖 基 质 的 凝 胶 色 谱 介 质 表 面 会 有 微 量 的 羧 基, 流 动 相 中 要 加 少 量 盐 抑 制 离 子 交 换 作 用 凝 胶 色 谱 常 用 在 分 离 工 艺 的 末 尾 2. 离 子 交 换 色 谱 蛋 白 质 表 面 在 溶 液 中 一 般 都 带 电 荷, 带 电 荷 的 类 型 取 决 于 蛋 白 质 pi 和 溶 液 的 ph ph 小 于 pi 时 蛋 白 质 带 正 电,pH 大 于 pi 时 蛋 白 质 带 负 电 不 同 的 等 电 点 的 蛋 白 质 在 同 一 个 溶 液 中, 表 面 带 电 情 况 不 同 离 子 交 换 色 谱 法 就 是 利 用 不 同 的 蛋 白 质 有 不 同 的 等 电

点 在 同 一 个 溶 液 中 表 面 带 电 情 况 不 同 实 现 分 离 在 近 似 处 理 中, 将 蛋 白 质 分 子 和 交 换 基 团 看 作 点 电 荷, 它 们 之 间 的 作 用 力 F 为 : F=q 1 q 2 /εr 2 q 1,q 2 分 别 为 蛋 白 质 分 子 和 交 换 基 团 两 个 点 电 荷 的 电 量 ;ε 为 介 质 介 电 常 数 ;r 为 两 点 电 荷 间 的 距 离 在 离 子 交 换 色 谱 中 交 换 基 团 的 电 荷 和 大 小 是 不 变 的, 而 样 品 的 电 荷 ( 表 面 带 电 情 况 ) 和 大 小 是 不 同 的, 受 到 交 换 基 团 的 作 用 力 也 不 同, 从 而 实 现 分 离 与 凝 胶 色 谱 基 质 一 样, 离 子 交 换 介 质 的 基 质 也 有 3 类 : 交 联 多 糖 如 交 联 琼 脂 糖 交 联 葡 聚 糖, 大 孔 硅 胶 和 多 孔 玻 璃, 大 孔 有 机 聚 合 物 ( 聚 苯 乙 烯 等 ) 在 蛋 白 质 的 离 子 交 换 分 离 中 主 要 使 用 交 联 多 糖, 特 别 是 交 联 琼 脂 糖 基 质 介 质, 有 强 阴 弱 阴 强 阳 弱 阳 4 种, 下 面 为 国 内 外 离 子 交 换 色 谱 介 质 的 名 称 基 质 交 换 基 团 等 性 质 的 表 格 名 称 交 换 基 团 基 质 应 用 生 产 公 司 强 阴 (Q) CH 2 N + (CH 3 ) 3 交 联 琼 脂 糖 CL6B/6FF 蛋 白 质 分 离, 除 内 毒 素 弱 阴 (DEAE) CH 2 CH 2 N(C 2 H 5 ) 2 交 联 琼 脂 糖 CL6B/6FF 蛋 白 质 分 离, 强 阳 (SP) - (CH 2 ) 3 SO 4 交 联 琼 脂 糖 CL6B/6FF 蛋 白 质 分 离 弱 阳 (CM) CH 2 COOH 交 联 琼 脂 糖 CL6B/6FF 蛋 白 质 分 离 离 子 交 换 填 料 吸 附 量 大 ( 见 下 表 ), 分 辨 率 好, 可 用 在 工 艺 的 任 何 一 步 但 是 上 样 时 样 品 溶 液 中 盐 浓 度 ( 即 离 子 强 度 ) 不 能 太 大, 否 则 会 不 保 留 或 分 辨 率 差 现 在 有 一 些 新 的 介 质 产 品, 可 以 允 许 样 品 溶 液 有 较 大 的 盐 浓 度 名 称 交 换 基 团 最 大 吸 附 量 (mg/ml) ph 工 作 范 围 生 产 公 司 强 阴 (Q) CH 2 N + (CH 3 ) 3 120HSA 2~12 弱 阴 (DEAE) CH 2 CH 2 N(C 2 H 5 ) 2 110HSA 2~9 强 阳 (SP) - (CH 2 ) 3 SO 4 70RNase 4~13 弱 阳 (CM) CH 2 COOH 50RNase 5~10 离 子 交 换 填 料 配 基 只 有 带 电 荷 才 能 对 蛋 白 质 有 吸 附 强 阴 (Q) 和 强 阳 (SP) 介 质 的 离 解 度 很 大, 所 以 ph 工 作 范 围 很 宽 ; 但 弱 阴 (DEAE) 和 弱 阳 (CM) 填 料 在 一 定 的 ph 范 围 内 离 解,pH 工 作 范 围 有 较 大 的 局 限 ( 见 上 表 和 下 式 ) DEAE H + R-CH 2 CH 2 N(C 2 H 5 ) 2 H + R-CH 2 CH 2 N(C 2 H 5 ) 2 CM R-CH 2 COOH H + + R-CH 2 COO - 弱 阴 (DEAE) 在 较 小 ph 值 时 离 解 度 较 大 ; 而 弱 阳 (CM) 在 较 大 ph 值 时 离 解 度 较 大

强 阴 (Q) 和 强 阳 (SP) 在 溶 液 中 几 乎 完 全 离 解, 与 ph 关 系 不 大 蛋 白 质 的 保 留 与 其 pi 及 溶 液 的 ph 值 有 关 t R pi 蛋 白 质 的 保 留 值 t R 与 ph 值 的 关 系 从 以 上 两 点 看, 使 用 弱 阴 (DEAE) 时 较 小 ph 值 离 解 度 较 大, 但 要 大 于 蛋 白 质 等 电 点 才 有 保 留, 而 弱 阳 (CM) 较 大 ph 值 离 解 度 较 大, 但 要 小 于 蛋 白 质 等 电 点 才 有 保 留 要 兼 顾 离 解 度 和 保 留 值 对 溶 液 ph 的 要 求 弱 阳 (CM) 常 在 酸 性 下 如 ph5.0 使 用, 此 时 适 合 pi 大 于 5.0 的 蛋 白 质 样 品,pI 越 大 保 留 值 越 大 弱 阴 (DEAE) 常 在 碱 性 如 ph8.0 使 用, 此 时 适 合 pi 小 于 8.0 的 蛋 白 质 样 品,pI 越 小 保 留 值 越 大 强 阴 (Q) 和 强 阳 (SP) 的 ph 使 用 范 围 更 大 3. 疏 水 色 谱 蛋 白 质 表 面 有 些 疏 水 基 团, 在 裂 隙 内 部 疏 水 基 团 更 多, 在 较 大 浓 度 的 盐 水 体 系 中 与 疏 水 填 料 配 基 会 有 疏 水 作 用 而 保 留, 在 稀 盐 溶 液 中 蛋 白 质 被 洗 脱 疏 水 色 谱 只 能 用 于 生 物 大 分 子 的 分 离, 不 能 用 于 小 分 子 分 离, 常 用 于 前 几 步 工 艺 的 初 步 分 离 和 蛋 白 质 复 性 中 疏 水 色 谱 上 样 量 一 般 小 于 离 子 交 换 色 谱 而 大 于 凝 胶 色 谱 ; 分 辨 率 也 是 小 于 离 子 交 换 色 谱 而 大 于 凝 胶 色 谱 其 特 别 之 处 在 于 上 样 时 盐 浓 度 可 以 很 大, 盐 浓 度 越 大, 保 留 越 大 在 以 上 所 说 疏 水 色 谱 使 用 的 盐 是 指 盐 析 性 盐, 如 (NH 4 ) 2 SO 4,Na 2 SO 4 等 在 这 些 盐 的 浓 溶 液 中 蛋 白 质 溶 解 度 减 小, 但 稳 定 性 增 加 另 一 种 盐 叫 盐 溶 性 盐, 如 盐 酸 胍 和 硫 氰 酸 盐, 在 这 些 盐 的 浓 溶 液 中 蛋 白 质 溶 解 度 增 大, 但 稳 定 性 减 小, 甚 至 可 逆 性 失 活 盐 溶 性 盐 不 能 用 于 疏 水 色 谱 流 动 相 用 于 蛋 白 质 制 备 的 疏 水 介 质 的 基 质 是 琼 脂 糖 配 基 主 要 有 丁 基 辛 基 和 苯 基 名 称 配 基 疏 水 性 应 用 生 产 公 司 丁 基 琼 脂 糖 微 球 -OC 4 H 9 (-NC 4 H 9,-SC 4 H 9 ) 弱 乙 肝 疫 苗 蛋 白 质 等 分 离 辛 基 琼 脂 糖 微 球 -OC 8 H 17 中 蛋 白 质 分 离 苯 基 琼 脂 糖 微 球 -OPh 强 蛋 白 质 分 离 ph 4. 亲 和 色 谱 分 子 识 别 在 色 谱 中 的 应 用 就 是 亲 和 色 谱 生 物 大 分 子 对 亲 和 色 谱 配 体 ( 某 些 基 团 或 分 子 ) 有 特 异 性 作 用, 形 成 一 种 特 殊 的 分 子 间 作 用 这 种 作 用 是 多 种 作 用 力 ( 疏 水 力 静 电 力 氢 键 力 范 德 华 力 等 ) 的 综 合 作 用 结 果 加 上 立 体 适 配 作 用 的 集 成 配 体 对 溶 液 中 分 子 的 作 用 是 有 选 择 性 的, 只 对 一 类 或 一 种 生 物 大 分 子 起 作 用 而 使 其 保 留, 对 其 他 物 质 不 起 作 用 就 象 一 把 钥 匙 开 一 把 锁, 有 人 也 把 这 亲 和 作 用 叫 锁 钥 作 用 亲 和 色 谱 是 一 种 分 离 度 最 高 的 色 谱 法, 但 只 能 用 于 生 物 大 分 子 分 离 做 好 亲 和 色 谱 的 关 键 是 选 好 配 体 和 色 谱 条 件

亲 和 色 谱 最 常 用 的 基 质 是 琼 脂 糖 凝 胶, 根 据 目 标 蛋 白 质 的 分 子 量 大 小 选 用 凝 胶 分 子 量 在 百 万 以 上 选 用 4B(CL4B,4FF) 系 列, 分 子 量 稍 小 些 的 选 用 6B(CL6B,6FF) 系 列 CL 系 列 键 合 密 度 大,FF 系 列 耐 压 高 机 械 性 能 好 要 根 据 分 离 对 象 选 择 合 适 的 配 体, 配 体 应 对 某 一 个 样 品 或 某 一 类 样 品 有 特 异 性 吸 附 我 们 现 在 已 经 知 道 的 有 些 配 体 如 底 物 和 抑 制 剂 对 酶 抗 体 对 抗 原 有 特 异 性 吸 附 ; 有 些 配 体 对 某 一 类 样 品 有 特 异 性 吸 附, 如 刀 豆 球 蛋 白 对 糖 蛋 白 某 些 三 嗪 染 料 对 干 扰 素 及 某 些 蛋 白 对 氨 基 苯 甲 脒 对 含 丝 氨 酸 的 蛋 白 质 有 吸 附 ( 祥 见 有 关 专 著 ) 商 品 化 的 亲 和 色 谱 介 质 品 种 不 多, 见 下 表 品 种 规 格 应 用 生 产 公 司 环 氧 活 化 琼 脂 糖 微 球 环 氧 值 20~40μmol/ml 亲 和 色 谱 中 间 体, 可 偶 联 带 NH 2 SH OH 的 配 基 BrCN 活 化 琼 脂 糖 微 球 亲 和 色 谱 中 间 体, 可 偶 联 带 NH 2 的 配 基 赖 氨 酸 琼 脂 糖 微 球 4B 0.6mg 血 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 /ml 纯 化 血 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 等 肝 素 高 流 速 琼 脂 糖 微 球 3mg 凝 血 酶 /ml 纯 化 抗 凝 血 酶 Ⅲ 凝 血 酶 明 胶 琼 脂 糖 微 球 4B/4 FF 1mg 血 纤 维 结 合 蛋 白 /ml 纯 化 或 去 除 血 纤 维 结 合 蛋 白 蓝 色 染 料 琼 脂 糖 微 球 18mg HSA/ml 生 物 大 分 子 的 纯 化 分 离 金 属 螯 合 琼 脂 糖 微 球 24~30μmol/ml Zn +2 与 金 属 有 作 用 的 蛋 白 质 纯 化 亲 和 色 谱 种 类 太 多, 很 多 情 况 下 买 不 到 商 品 填 料, 要 自 己 合 成 可 以 根 据 配 基 活 性 基 团 的 种 类 选 择 购 买 活 化 琼 脂 糖 微 球 再 合 成 是 比 较 方 便 的 途 径 也 可 以 购 买 交 联 琼 脂 糖 自 己 从 头 合 成 ( 见 相 关 专 著 ) ( 常 建 华 ) 西 安 交 大 保 赛 生 物 技 术 股 份 有 限 公 司 网 址 :www.bsgf.cn 地 址 : 西 安 市 雁 翔 路 99 号 交 大 科 技 园 37 号 楼 保 赛 大 厦 邮 编 :710054 电 话 :029-83399689 传 真 :029 83399695