Elabscience 6th Edition, revised in June, 2014 ( 本 试 剂 盒 仅 供 体 外 研 究 使 用, 不 用 于 临 床 诊 断!) 猪 神 经 营 养 因 子 3(NT-3) 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 试 剂 盒 使 用 说 明 书 Porcine NT-3 (Neurotrophin-3) ELISA Kit 产 品 货 号 :E-EL-P0212c 使 用 前 请 仔 细 阅 读 说 明 书 如 果 有 任 何 问 题, 请 通 过 以 下 方 式 联 系 我 们 : 全 国 免 费 电 话 400-660-4808 销 售 部 电 话 027-87879180 技 术 部 电 话 027-87645690 电 子 邮 箱 ( 销 售 ) Perry@elabscience.cn 电 子 邮 箱 ( 技 术 ) techsupport@elabscience.cn QQ 客 服 1037150941 网 址 联 系 时 请 提 供 产 品 货 号 ( 见 试 剂 盒 标 签 ), 以 便 我 们 更 高 效 地 为 您 服 务 Copyright 2012 Elabscience Biotechnology Co.,Ltd All Rights Reserved
猪 神 经 营 养 因 子 3(NT-3) 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 试 剂 盒 使 用 说 明 书 产 品 货 号 :E-EL-P0212c ( 本 试 剂 盒 仅 供 体 外 研 究 使 用 不 用 于 临 床 诊 断!) 声 明 : 尊 敬 的 客 户, 感 谢 您 选 用 本 公 司 的 产 品 本 产 品 适 用 于 体 外 定 量 检 测 猪 血 清 血 浆 或 其 它 相 关 生 物 液 体 中 天 然 和 重 组 NT-3 浓 度 使 用 前 请 仔 细 阅 读 说 明 书 并 检 查 试 剂 组 分! 如 有 疑 问, 请 及 时 联 系 伊 莱 瑞 特 生 物 科 技 有 限 公 司 试 剂 盒 组 成 : 中 文 名 称 英 文 名 称 规 格 保 存 条 件 ELISA 酶 标 板 ( 可 拆 卸 ) Micro ELISA Plate(Dismountable) 8 12 / 8 6 * 4 /-20 # 冻 干 标 准 品 Reference Standard 2/1 支 * 4 /-20 # 标 准 品 & 样 品 稀 释 液 Reference Standard & Sample Diluent 1 瓶 20mL/12mL * 4 浓 缩 生 物 素 化 抗 体 Concentrated Biotinylated Detection Ab 1 支 120μL/70μL * 4 /-20 # 生 物 素 化 抗 体 稀 释 液 Biotinylated Detection Ab Diluent 1 瓶 10mL/6mL * 4 浓 缩 HRP 酶 结 合 物 Concentrated HRP Conjugate 1 支 120μL/70μL * 4 ( 避 光 ) 酶 结 合 物 稀 释 液 HRP Conjugate Diluent 1 瓶 10mL/6mL * 4 浓 缩 洗 涤 液 (25 ) Concentrated Wash Buffer (25 ) 1 瓶 30mL/16mL * 4 底 物 溶 液 (TMB) Substrate Reagent 1 瓶 10mL/6mL * 4 ( 避 光 ) 反 应 终 止 液 Stop Solution 1 瓶 10mL/6mL * 4 封 板 覆 膜 Plate Sealer 5/3 张 * 产 品 说 明 书 Product Description 1 份 质 检 报 告 Certificate of Analysis 1 份 特 别 说 明 : *: [96T/48T]( 打 开 包 装 后 请 及 时 检 查 所 有 物 品 是 否 齐 全 完 整 ) #: 一 周 内 使 用 可 存 于 4, 需 长 时 间 存 放 或 多 次 使 用 建 议 存 于 -20. 相 关 试 剂 在 分 装 时 会 比 标 签 上 标 明 的 体 积 稍 多 一 些, 请 在 使 用 时 量 取 而 非 直 接 倒 出! 检 测 原 理 : 本 试 剂 盒 采 用 双 抗 体 夹 心 ELISA 法 用 抗 猪 NT-3 抗 体 包 被 于 酶 标 板 上, 实 验 时 样 品 或 标 准 品 中 的 猪 NT-3 会 与 包 被 抗 体 结 合, 游 离 的 成 分 被 洗 去 依 次 加 入 生 物 素 化 的 抗 猪 NT-3 抗 体 和 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 亲 和 素 抗 猪 NT-3 抗 体 与 结 合 在 包 被 抗 体 上 的 猪 NT-3 结 合 生 物 素 与 亲 和 素 特 异 性 结 合 而 形 成 免 疫 复 合 物, 游 离 的 成 分 被 洗 去 加 入 显 色 底 物 (TMB),TMB 在 辣 根 过 氧 化 物 酶 的 催 化 下 呈 现 蓝 色, 加 终 止 液 后 变 成 黄 色 用 酶 标 仪 在 450nm 波 长 处 测 OD 值,NT-3 浓 度 与 OD 450 值 之 间 呈 正 比, 通 过 绘 制 标 准 曲 线 计 算 出 样 品 中 NT-3 的 浓 度
样 品 收 集 : 1. 血 清 : 全 血 样 品 于 室 温 放 置 2 小 时 或 4 过 夜 后 于 1000 g 离 心 20 分 钟, 取 上 清 即 可 检 测, 收 集 血 液 的 试 管 应 为 一 次 性 的 无 热 原, 无 内 毒 素 试 管 2. 血 浆 : 抗 凝 剂 推 荐 使 用 EDTA-Na2, 样 品 采 集 后 30 分 钟 内 于 1000 g 离 心 15 分 钟, 取 上 清 即 可 检 测 避 免 使 用 溶 血, 高 血 脂 样 品 3. 组 织 匀 浆 : 用 预 冷 的 PBS (0.01M, ph=7.4) 冲 洗 组 织, 去 除 残 留 血 液 ( 匀 浆 中 裂 解 的 红 细 胞 会 影 响 测 量 结 果 ), 称 重 后 将 组 织 剪 碎 将 剪 碎 的 组 织 与 对 应 体 积 的 PBS( 一 般 按 1:9 的 重 量 体 积 比, 比 如 1g 的 组 织 样 品 对 应 9mL 的 PBS, 具 体 体 积 可 根 据 实 验 需 要 适 当 调 整, 并 做 好 记 录 推 荐 在 PBS 中 加 入 蛋 白 酶 抑 制 剂 ) 加 入 玻 璃 匀 浆 器 中, 于 冰 上 充 分 研 磨 为 了 进 一 步 裂 解 组 织 细 胞, 可 以 对 匀 浆 液 进 行 超 声 破 碎, 或 反 复 冻 融 最 后 将 匀 浆 液 于 5000 g 离 心 5~10 分 钟, 取 上 清 检 测 4. 细 胞 培 养 上 清 : 取 细 胞 培 养 上 清 于 1000 g 离 心 20 分 钟, 除 去 杂 质 及 细 胞 碎 片 取 上 清 检 测 5. 其 它 生 物 样 品 :1000 g 离 心 20 分 钟, 取 上 清 即 可 检 测 具 体 处 理 方 法 可 参 考 :http:///index.php/resources/view/aid/17671.jsp 6. 样 品 应 清 澈 透 明, 悬 浮 物 应 离 心 去 除 7. 样 品 收 集 后 若 在 1 周 内 进 行 检 测 的 可 保 存 于 4, 若 不 能 及 时 检 测, 请 按 一 次 使 用 量 分 装, 冻 存 于 -20 (1 个 月 内 检 测 ), 或 -80 (6 个 月 内 检 测 ), 避 免 反 复 冻 融 8. 如 果 您 的 样 品 中 检 测 物 浓 度 高 于 标 准 品 最 高 值, 请 根 据 实 际 情 况, 做 适 当 倍 数 稀 释 ( 建 议 先 做 预 实 验, 以 确 定 稀 释 倍 数 ) 试 验 所 需 自 备 物 品 : 1. 酶 标 仪 (450nm 波 长 滤 光 片 ) 2. 高 精 度 移 液 器,EP 管 及 一 次 性 吸 头 :0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 3. 37 恒 温 箱, 双 蒸 水 或 去 离 子 水 4. 吸 水 纸 检 测 前 准 备 工 作 : 1. 请 提 前 20 分 钟 从 冰 箱 中 取 出 试 剂 盒, 平 衡 至 室 温 2. 将 浓 缩 洗 涤 液 用 双 蒸 水 稀 释 (1:25) 未 用 完 的 放 回 4 从 冰 箱 中 取 出 的 浓 缩 洗 涤 液 可 能 有 结 晶, 属 于 正 常 现 象, 可 用 40 水 浴 微 加 热 使 结 晶 完 全 溶 解 后 再 配 制 洗 涤 液 ( 加 热 温 度 不 要 超 过 50, 使 用 时 洗 涤 液 应 为 室 温 ) 当 日 使 用 3. 标 准 品 : 于 10000 g 离 心 1 分 钟, 加 入 标 准 品 & 样 品 稀 释 液 1.0mL 至 冻 干 标 准 品 中, 旋 紧 管 盖, 静 置 10 分 钟, 上 下 颠 倒 数 次, 待 其 充 分 溶 解 后, 轻 轻 混 匀 ( 浓 度 为 30ng/mL) 然 后 根 据 需 要 进 行 倍 比 稀 释 ( 注 : 不 要 直 接 在 反 应 孔 中 进 行 倍 比 稀 释 ) 建 议 配 制 成 以 下 浓 度 :30 15 7.5 3.75 1.875 0.938 0.469 0ng/mL, 标 准 品 & 样 品 稀 释 液 直 接 作 为 空 白 孔 0ng/mL 如 配 制 15ng/mL 标 准 品 : 取 0.5mL30ng/mL 的 上 述 标 准 品 加 入 含 有 0.5mL 标 准 品 & 样 品 稀 释 液 的 EP 管 中, 混 匀 即 可, 其 余 浓 度 依 此 类 推 3
4. 生 物 素 化 抗 体 工 作 液 : 实 验 前 计 算 当 次 实 验 所 需 用 量 ( 以 100μL/ 孔 计 ), 实 际 配 制 时 应 多 配 制 100-200μL 使 用 前 15 分 钟, 以 生 物 素 化 抗 体 稀 释 液 稀 释 浓 缩 生 物 素 化 抗 体 (1:100) 成 工 作 浓 度 当 日 使 用 5. 酶 结 合 物 工 作 液 : 实 验 前 计 算 当 次 实 验 所 需 用 量 ( 以 100μL/ 孔 计 ), 实 际 配 制 时 应 多 配 制 100-200μL 使 用 前 15 分 钟, 以 酶 结 合 物 稀 释 液 稀 释 浓 缩 HRP 酶 结 合 物 (1:100) 成 工 作 浓 度 当 日 使 用 标 准 品 稀 释 方 法 图 例 :( 以 500μL/ 管 为 例, 也 可 根 据 实 际 用 量 来 稀 释, 如 200μL/ 管 ) 1 2 3 4 5 6 7 8 Tube 30 15 7.5 3.75 1.875 0.938 0.469 0 ng/ml 洗 涤 方 法 : 1. 自 动 洗 板 机 : 每 孔 加 入 洗 涤 液 350μL, 注 入 与 吸 出 间 隔 60 秒 2. 手 工 洗 板 : 甩 尽 孔 内 液 体, 在 洁 净 的 吸 水 纸 上 拍 干, 每 孔 加 洗 涤 液 350μL, 浸 泡 1-2 分 钟, 吸 去 ( 不 可 触 及 板 壁 ) 或 甩 掉 酶 标 板 内 的 液 体, 在 厚 的 吸 水 纸 上 拍 干 操 作 步 骤 : 实 验 开 始 前, 各 试 剂 均 应 平 衡 至 室 温 ; 试 剂 或 样 品 配 制 时, 均 需 充 分 混 匀, 并 尽 量 避 免 起 泡 1. 加 样 : 分 别 设 空 白 孔 标 准 孔 待 测 样 品 孔 空 白 孔 加 标 准 品 & 样 品 稀 释 液 100μL, 余 孔 分 别 加 标 准 品 或 待 测 样 品 100μL, 注 意 不 要 有 气 泡, 加 样 时 将 样 品 加 于 酶 标 板 底 部, 尽 量 不 触 及 孔 壁, 轻 轻 晃 动 混 匀 给 酶 标 板 覆 膜,37 孵 育 90 分 钟 为 保 证 实 验 结 果 有 效 性, 每 次 实 验 请 使 用 新 的 标 准 品 溶 液 2. 弃 去 液 体, 甩 干, 不 用 洗 涤 每 个 孔 中 加 入 生 物 素 化 抗 体 工 作 液 100μL( 在 使 用 前 15 分 钟 内 配 制 ), 酶 标 板 加 上 覆 膜,37 温 育 1 小 时 3. 弃 去 孔 内 液 体, 甩 干, 洗 板 3 次, 每 次 浸 泡 1-2 分 钟, 大 约 350μL/ 每 孔, 甩 干 并 在 吸 水 纸 上 轻 拍 将 孔 内 液 体 拍 干 4. 每 孔 加 酶 结 合 物 工 作 液 ( 临 用 前 15 分 钟 内 配 制 )100μL, 加 上 覆 膜,37 温 育 30 分 钟 5. 弃 去 孔 内 液 体, 甩 干, 洗 板 5 次, 方 法 同 步 骤 3 4
6. 每 孔 加 底 物 溶 液 (TMB)90μL, 酶 标 板 加 上 覆 膜 37 避 光 孵 育 15 分 钟 左 右 ( 根 据 实 际 显 色 情 况 酌 情 缩 短 或 延 长, 但 不 可 超 过 30 分 钟 当 标 准 孔 出 现 明 显 梯 度 时, 即 可 终 止 ) 7. 每 孔 加 终 止 液 50μL, 终 止 反 应, 此 时 蓝 色 立 转 黄 色 终 止 液 的 加 入 顺 序 应 尽 量 与 底 物 溶 液 的 加 入 顺 序 相 同 8. 立 即 用 酶 标 仪 在 450nm 波 长 测 量 各 孔 的 光 密 度 (OD 值 ) 应 提 前 打 开 酶 标 仪 电 源, 预 热 仪 器, 设 置 好 检 测 程 序 9. 实 验 完 毕 后 将 未 用 完 的 试 剂 按 规 定 的 保 存 温 度 放 回 冰 箱 保 存 注 意 事 项 : 1. 保 存 : 试 剂 盒 中 各 试 剂 请 按 说 明 书 提 示 合 理 存 放 在 储 存 及 温 育 过 程 中 避 免 将 试 剂 暴 露 在 强 光 中 所 有 试 剂 瓶 盖 须 旋 紧 以 防 止 蒸 发 和 微 生 物 的 污 染, 否 则 可 能 会 出 现 错 误 的 结 果 2. 酶 标 板 : 刚 开 启 的 酶 标 板 孔 中 可 能 会 有 少 许 水 样 物 质, 此 为 正 常 现 象, 不 会 对 实 验 结 果 造 成 任 何 影 响 暂 时 不 用 的 板 条 应 拆 卸 后 放 入 备 用 铝 箔 袋, 按 推 荐 温 度 存 放! 3. 加 样 : 加 样 或 加 试 剂 时, 第 一 个 孔 与 最 后 一 个 孔 的 加 样 时 间 间 隔 如 果 太 大, 将 会 导 致 不 同 的 预 温 育 时 间, 从 而 明 显 地 影 响 到 测 量 值 的 准 确 性 及 重 复 性 每 次 的 加 样 时 间 最 好 控 制 在 10 分 钟 内 推 荐 设 置 复 孔 4. 温 育 : 为 防 止 样 品 蒸 发, 实 验 时 必 须 给 酶 标 板 覆 膜 ; 洗 板 后 应 尽 快 进 行 下 步 操 作, 避 免 酶 标 板 处 于 干 燥 状 态 ; 严 格 遵 守 给 定 的 温 育 时 间 和 温 度 5. 洗 涤 : 洗 涤 过 程 中 反 应 孔 中 残 留 的 洗 涤 液 应 在 吸 水 纸 上 拍 干, 勿 将 滤 纸 直 接 放 入 反 应 孔 中 吸 水 在 读 数 前 要 注 意 清 除 底 部 残 留 的 液 体 和 手 指 印, 以 免 影 响 酶 标 仪 读 数 6. 试 剂 配 制 :Concentrated BiotinylatedDetection Ab 及 Concentrated HRP Conjugate 体 积 较 小, 运 输 过 程 会 使 液 体 沾 到 管 壁 或 瓶 盖, 因 此 使 用 前 1000 转 / 分 离 心 1min, 以 使 附 着 管 壁 或 瓶 盖 的 液 体 沉 积 到 管 底 取 用 前, 请 用 移 液 器 小 心 吹 打 4-5 次 使 溶 液 混 匀 标 准 品 生 物 素 化 抗 体 工 作 液 酶 结 合 物 工 作 液 请 根 据 所 需 用 量 配 制, 并 使 用 相 应 的 稀 释 液 配 制, 不 能 混 淆 请 精 确 配 制 标 准 品 及 工 作 液, 尽 量 不 要 微 量 配 制 ( 如 吸 取 Concentrated BiotinylatedDetection Ab 时, 一 次 不 要 小 于 10μL), 以 避 免 由 于 不 准 确 稀 释 而 造 成 浓 度 误 差 ; 请 勿 重 复 使 用 已 稀 释 过 的 标 准 品 生 物 素 化 抗 体 工 作 液 酶 结 合 物 工 作 液 若 需 要 分 次 使 用 标 准 品 应 按 照 每 一 次 用 量 分 装, 将 其 放 在 -20~-80 贮 存 避 免 反 复 冻 融 7. 显 色 时 间 的 控 制 : 加 入 底 物 后 请 定 时 观 察 反 应 孔 的 颜 色 变 化 ( 比 如 每 隔 5 分 钟 ), 如 梯 度 已 很 明 显, 请 提 前 加 入 终 止 液 终 止 反 应, 避 免 颜 色 过 深 影 响 酶 标 仪 读 数 8. 底 物 : 底 物 请 避 光 保 存, 在 储 存 和 温 育 时 避 免 强 光 直 接 照 射 9. 混 匀 : 充 分 轻 微 混 匀 对 反 应 结 果 尤 为 重 要, 最 好 使 用 微 量 振 荡 器 ( 使 用 最 低 频 率 ), 如 无 微 量 振 荡 器, 可 在 反 应 前 手 工 轻 轻 敲 击 酶 标 板 框 混 匀 10. 安 全 : 试 验 中 请 穿 着 实 验 服 并 带 乳 胶 手 套 做 好 防 护 工 作 特 别 是 检 测 血 液 或 者 其 他 体 液 样 品 时, 请 按 国 家 生 物 试 验 室 安 全 防 护 条 例 执 行 11. 不 同 批 号 的 试 剂 盒 组 份 不 能 混 用 ( 洗 涤 液 和 反 应 终 止 液 除 外 ) 12. 试 验 中 所 用 的 EP 管 和 吸 头 均 为 一 次 性 使 用, 严 禁 混 用, 否 则 将 影 响 试 验 结 果! 5
结 果 判 断 : 1. 每 个 标 准 品 的 OD 值 减 去 空 白 孔 的 OD 值 后 作 图, 如 设 置 复 孔, 则 应 取 其 平 均 值 计 算 以 标 准 品 的 浓 度 为 横 坐 标,OD 值 为 纵 坐 标, 绘 出 标 准 曲 线 亦 可 以 OD 值 为 横 坐 标, 标 准 品 的 浓 度 为 纵 坐 标, 绘 出 标 准 曲 线 2. 推 荐 使 用 专 业 的 曲 线 制 作 软 件, 如 curve expert 1.3 或 1.4, 在 软 件 界 面 既 可 根 据 样 品 OD 值, 由 标 准 曲 线 查 出 相 应 的 浓 度, 乘 以 稀 释 倍 数 ; 亦 可 将 样 品 的 OD 值 代 入 标 准 曲 线 的 拟 合 方 程 式, 计 算 出 样 品 浓 度, 再 乘 以 稀 释 倍 数, 即 为 样 品 的 实 际 浓 度 3. 若 样 品 OD 值 高 于 标 准 曲 线 上 限, 应 适 当 稀 释 后 重 测, 计 算 浓 度 时 应 乘 以 稀 释 倍 数 灵 敏 度 检 测 范 围 特 异 性 和 重 复 性 : 灵 敏 度 : 最 小 可 测 0.281ng/mL 检 测 范 围 :0.469 30ng/mL 特 异 性 : 可 检 测 重 组 或 天 然 的 猪 NT-3, 且 与 其 它 相 关 蛋 白 无 交 叉 反 应 重 复 性 : 板 内, 板 间 变 异 系 数 均 <10% 操 作 概 要 1. 在 各 孔 中 加 入 标 准 品 或 样 品 各 100μL,37 孵 育 90 分 钟 2. 倒 去 孔 内 液 体, 加 入 100μL 生 物 素 化 抗 体 工 作 液,37 孵 育 60 分 钟 3. 洗 涤 3 次 4. 加 入 100μL 酶 结 合 物 工 作 液, 37 孵 育 30 分 钟 5. 洗 涤 5 次 6. 加 入 90μL 底 物 溶 液, 37 孵 育 15 分 钟 左 右 7. 加 入 50μL 终 止 液, 立 即 在 450nm 波 长 处 测 量 OD 值 8. 结 果 计 算
问 题 分 析 若 实 验 效 果 不 好, 请 及 时 对 显 色 结 果 拍 照, 保 留 所 用 板 条 及 未 使 用 试 剂, 并 妥 善 保 存, 然 后 联 系 我 公 司 技 术 支 持 为 您 解 决 问 题 同 时 您 也 可 以 参 考 以 下 资 料 : 问 题 描 述 可 能 原 因 相 应 对 策 标 准 曲 线 梯 度 差 显 色 很 弱 或 无 色 读 数 数 值 低 吸 液 或 加 液 不 准 标 准 品 稀 释 不 正 确 洗 涤 不 完 全 孵 育 时 间 太 短 实 验 温 度 不 正 确 试 剂 体 积 不 够 或 漏 加 稀 释 不 正 确 酶 标 仪 设 置 不 正 确 检 查 移 液 器 及 吸 头 溶 解 标 准 品 时 稍 微 旋 转 瓶 身, 轻 轻 混 匀 使 粉 末 完 全 溶 解 保 证 洗 涤 时 间 和 洗 涤 次 数 及 每 孔 的 加 液 量 保 证 充 足 的 孵 育 时 间 使 用 推 荐 的 实 验 温 度 检 查 吸 液 及 加 液 过 程, 保 证 所 有 试 剂 按 顺 序 足 量 添 加 在 酶 标 仪 上 检 查 波 长 及 滤 光 片 设 置 提 前 打 开 酶 标 仪 预 热 变 异 系 数 大 加 液 不 正 确 检 查 加 液 情 况 背 景 值 高 灵 敏 度 低 检 测 抗 体 的 工 作 浓 度 过 高 酶 标 板 洗 涤 不 完 全 洗 液 有 污 染 ELISA 试 剂 盒 保 存 不 当 读 数 前 未 终 止 使 用 推 荐 的 稀 释 倍 数 重 新 阅 读 操 作 手 册, 保 证 清 洗 完 全 ; 如 果 用 自 动 洗 板 机, 请 检 查 所 有 的 出 口 是 否 有 堵 塞 配 制 新 鲜 的 洗 液 按 说 明 书 要 求 保 存 相 关 试 剂 OD 读 数 前 应 在 每 孔 中 加 入 终 止 液 声 明 1. 限 于 现 有 条 件 及 科 学 技 术 水 平, 尚 不 能 对 所 有 原 料 进 行 全 面 的 鉴 定 分 析, 本 产 品 可 能 存 在 一 定 的 质 量 技 术 风 险 2. 最 终 的 实 验 结 果 与 试 剂 的 有 效 性 实 验 者 的 相 关 操 作 以 及 当 时 的 实 验 环 境 密 切 相 关, 请 务 必 准 备 充 足 的 待 测 样 品 3. 只 有 全 部 使 用 试 剂 盒 内 的 试 剂 才 能 保 证 检 测 效 果, 不 能 混 用 其 他 制 造 商 的 产 品 只 有 严 格 遵 守 Elabscience 的 实 验 说 明 才 会 得 到 最 佳 的 检 测 结 果 4. 有 效 期 :6 个 月 5. 本 操 作 说 明 同 样 适 用 于 48T 试 剂 盒
Porcine NT-3 (Neurotrophin-3) ELISA Kit Product Description Catalog No: E-EL-P0212c (FOR RESEARCH USE ONLY. DO NOT USE IT IN CLINICAL DIAGONOSIS!) Dear customer, Thank you for choosing our products. Please read the instructions carefully before use and check all the reagent compositions! If in doubt, please contact Elabscience. Kit Components: Item Specifications Storage Micro ELISA Plate(Dismountable) 8 12 or 8 6 * 4 C/-20 # Reference Standard 2/1vial * 4 C/-20 # Reference Standard & Sample Diluent 1vial 20mL/12mL * 4 C Concentrated Biotinylated Detection Ab 1vial 120μL /70μL* 4 C/-20 # Biotinylated Detection Ab Diluent 1vial 10mL/6mL* 4 C Concentrated HRP Conjugate 1vial 120μL/70μL * 4 C(shading light) HRP Conjugate Diluent 1vial 10mL/6mL * 4 C Concentrated Wash Buffer (25 ) 1vial 30mL/16mL * 4 C Substrate Reagent 1vial 10mL/6mL * 4 C(shading light) Stop Solution 1vial 10mL/6mL * 4 C Plate Sealer 5/3pieces * Product Description 1 copy Certificate of Analysis 1 copy Note: *: [96T/48T] #: It s OK to keep the kit in 4, if the kit is scheduled to be used up in one week. Please keep the reagent in -20 for long-term storage or repeated use. The reagent in each vial is slightly more that its volume written on label, please take out the required volume by certain tools (such as transferpettor, measuring cylinder), rather than pouring directly. Test principle This ELISA kit uses Sandwich-ELISA as the method. The micro ELISA plate provided in this kit has been pre-coated with an antibody specific to PorcineNT-3. Standards or samples are then added to the appropriate micro ELISA plate wells and combined to the specific antibody. Then a biotinylated detection antibody specific for PorcineNT-3 and Avidin-Horseradish Peroxidase (HRP) conjugate is added to each micro plate well and incubated. Free components are washed away. The substrate solution is added to each well. Only those wells that contain PorcineNT-3, biotinylated detection antibody and Avidin-HRP conjugate will appear blue in color. The enzyme-substrate reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color turn yellow. The optical density (OD) is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm ± 2 nm. The OD value is
proportional to the concentration of PorcineNT-3. You can calculate the concentration of NT-3 in the samples by comparing the OD of the samples to the standard curve. Sample collection and storage Serum - Allow samples to clot for 2 hours at room temperature or overnight at 4 C before centrifugation for 20 minutes at approximately 1000 g. Collect the supernatant and carry out the assay immediately. Blood collection tubes should be disposable, non-pyrogenic, and non-endotoxin. Plasma - Collect plasma using EDTA-Na2 or heparin as an anticoagulant. Centrifuge samples for 15 minutes at 1000 g at 2-8 C within 30 minutes of collection. Collect the supernatant and carry out the assay immediately. Avoid hemolysis, high cholesterol samples. Tissue homogenates For general information, hemolysis blood may affect the result, so you should rinse the tissues with ice-cold PBS (0.01M, ph=7.4) to remove excess blood thoroughly. Tissue pieces should be weighed and then minced to small pieces which will be homogenized in PBS (the volume depends on the weight of the tissue. 9mL PBS would be appropriate to 1 gram tissue pieces. Some protease inhibitor is recommended to add into the PBS.) with a glass homogenizer on ice. To further break the cells, you can sonicate the suspension with an ultrasonic cell disrupter or subject it to freeze-thaw cycles. The homogenates are then centrifugated for 5minutes at 5000 g to get the supernate. Cell culture supernate Centrifuge supernate for 20 minutes to remove insoluble impurity and cell debris at 1000 g at 2-8 C. Collect the clear supernate and carry out the assay immediately. Other biological fluids Centrifuge samples for 20 minutes at 1000 g at 2-8 C. Collect the supernatant and carry out the assay immediately. (You can refer to our website for detailed processing method: http:///index.php/resources/view/aid/17671.jsp) Sample preparation Samples should be clear and transparent and be centrifuged to remove suspended solids. Note: Serum and plasma to be used within 7 days when stored at 2-8 C, otherwise samples must be divided and stored at -20 C ( 1 month) or -80 C ( 6 months) to avoid loss of bioactivity and contamination. Avoid freeze-thaw cycles. When performing the assay slowly bring samples to room temperature. If the sample concentration is higher than the maximum standard value, please dilute it with appropriate factor according to the actual situation. (A pre-test is recommended to determine the dilute factor). 9
Other supplies required Microplate reader with 450nm wavelength filter High-precision transferpettor, EP tubes and disposable pipette tips 37 C Incubator, Deionized or distilled water Absorbent paper Reagent preparation Bring all reagents to room temperature before use. Wash Buffer - Dilute 30mL of Concentrated Wash Buffer into 750 ml of Wash Buffer with deionized or distilled water. Put unused solution back at 4 C. If crystals have formed in the concentrate, you can warm it with 40 Cwater bath (Heating temperature should not exceed 50 C ) and mix it gently until the crystals have completely dissolved. The solution should be cooled to room temperature before use. Standard - Centrifuge at 10,000 g for 1 minute, and reconstitute the Standard with 1.0mL of Reference Standard &Sample Diluent. Tighten the lid, let it stand for 10 minutes and turn it upside down for several times. After it dissolves fully, mix it thoroughly with a pipette. This reconstitution produces a stock solution of 30ng/mL. Then make serial dilutions as needed (Making serial dilution in the wells directly is not permitted). The recommended concentrations are as follows:30 15 7.5 3.75 1.875 0.938 0.469 0ng/mL. As if you want to make standard solution at the concentration of 15ng/mL, you can take0.5ml the standard at 30ng/mL, add it to an EP tube with 0.5mL Reference Standard &Sample Diluent, and mix it. The procedures of making the remaining concentrations are all the same. The undiluted standard serves as the highest standard (30ng/mL). The Reference Standard &Sample Diluent serves as the zero (0ng/mL). (500μL/tube,for example. Can also be diluted according to the actual amount,such as 200μL/tube) 1 2 3 4 5 6 7 8 Tube 30 15 7.5 3.75 1.875 0.938 0.469 0 ng/ml 10
Biotinylated Detection Ab Calculate the required amount before experiment (100μL/well). In actual preparation you should prepare 100~200μL more. Dilute the concentrated Biotinylated Detection Ab to the working concentration using Biotinylated Detection Ab Diluent(1:100). Concentrated HRP Conjugate Calculate the required amount before experiment (100μL/well). In actual preparation you should prepare 100~200μL more. Dilute the Concentrated HRP Conjugate to the working concentration using Concentrated HRP Conjugate Diluent(1:100). Washing Procedure: 1. Automated washer: add 350μL wash buffer into each well, the interval between injection and suction should be set about 60s. 2.Manual wash: add 350μL wash buffer into each well, soak it for 1~2minutes, suck(no inside wall touching) or get rid of liquid within the micro ELISA plate and pat it dry on thick clean absorbent paper. Assay procedure Allow all reagents to reach room temperature All the reagents should be mixed thoroughly by gently swirling before pipetting. Avoid foaming. 1. Add Sample: Add 100μL of Standard, Blank, or Sample per well. The blank well is added with Reference Standard &Sample Diluent. Solutions are added to the bottom of micro ELISA plate well, avoid inside wall touching and foaming to the best of your ability. Mix it gently. Cover the plate with sealer we provided. Incubate for 90 minutes at 37 C. 2. Biotinylated Detection Ab: Remove the liquid of each well, don't wash. Immediately add 100μL of Biotinylated Detection Ab working solution to each well. Cover with the Plate sealer. Gently tap the plate to ensure thorough mixing. Incubate for 1 hour at 37 C. 3. Wash: Aspirate each well and wash, repeating the process three times. Wash by filling each well with Wash Buffer (approximately 350μL) using a squirt bottle, multi-channel pipette, manifold dispenser or automated washer. Complete removal of liquid at each step is essential to good performance. After the last wash, remove any remaining Wash Buffer by aspirating or decanting. Invert the plate and pat it against thick clean absorbent paper. 4. HRP Conjugate: Add 100μL of HRP Conjugate working solution to each well. Cover with the Plate sealer. Incubate for 30 minutes at 37 C. 5. Wash: Repeat the wash process for five times as conducted in step 3. 6. Substrate: Add 90μL of Substrate Solution to each well. Cover with a new Plate sealer. Incubate for about 15 minutes at 37 C. Protect the plate from light. The reaction time can be shortened or extended according to the actual color change, but not more than 30minutes. When apparent gradient appeared in standard wells, you can terminate the reaction. 7. Stop: Add 50μL of Stop Solution to each well. Color turn to yellow immediately. The adding 11
order of stop solution should be as the same as the substrate solution. 8. OD Measurement: Determine the optical density (OD value) of each well at once, using a microplate reader set to 450nm. You should open the microplate reader ahead, preheat the instrument, and set the testing parameters. 9. After experiment, put all the unused reagents back into the refrigerator according to the specified storage temperature respectively until their expiry. Important Note: 1. Storage: All the reagents in the kit should be stored following the instructions. Exposure of reagents to strong light should be avoided in the process of incubation and storage. All the taps of reagents should be tightened to prevent evaporation and microbial contamination, or erroneous results may occur. 2. ELISA Plate: Little water-like substance may appear in the ELISA Plate just opened, this is normal and will not have any impact on the experiment results. Keep the remaining plates in spare aluminum foil bag, and keep it in temperature suggested before. 3. Add Sample: The interval of sample adding between the first well and the last well should not be too long, otherwise will cause different pre-incubation time, which will significantly affect the experiment s accuracy and repeatability. The interval controlled within 10minutes is good. Parallel measurement is recommended. 4. Incubation: To prevent evaporation, proper adhesion of plate sealers during incubation steps is necessary. Do not allow wells to sit uncovered for extended periods between incubation steps. Do not let the strips dry at any time during the assay. Strict compliance with the given incubation time and temperature. 5. Washing: The wash procedure is critical. Insufficient washing will result in poor precision and falsely elevated absorbance readings Residual liquid in the reaction wells should be pat dry against absorbent paper in the washing process. But don't put absorbent paper into reaction wells directly. Note that clear the residual liquid and fingerprint in the bottom before measurement, so as not to affect the microtiter plate reader. 6. Reagent Preparation: As the volume of Concentrated Biotinylated Detection Ab and Concentrated HRP Conjugate is very small, liquid may adhere to the tube wall or tube cap when being transported. You better hand-throw it or centrifugal it for 1 minute at 1000rpm. Please pipette the solution for 4-5 times before pippeting. Please carefully reconstitute Standards, working solutions of Biotinylated Detection Ab and HRP Conjugate according to the instructions. To minimize imprecision caused by pipetting, ensure that pipettors are calibrated. It is recommended to suck more than 10μL for once pipetting. Do not reuse standard solution, working solution of Biotinylated Detection Ab and HRP Conjugate, which have been diluted. If you need to use standard repeatedly, you can divide the standard into small pack according to the amount of each assay, keep them at -20~-80 C and avoid repeated freezing and thawing 12
7. Reaction Time Control: Please control reaction time strictly following this product description! 8. Substrate: Substrate Solution is easily contaminated. Please protect it from light. 9. Mixing: You d better use microoscillator at the lowest frequency, as sufficient and gentle mixing is particularly important to reaction result. If there is no microsocillator available, you can knock the ELISA plate frame gently with your finger before reaction. 10. Security: Please wear lab coats and latex gloves for protection. Especially detecting samples of blood or other body fluid, please perform following the national security columns of biological laboratories. 11. Do not use component from different batches of kit(washing buffer and stop solution can be an exception) 12. To avoid cross-contamination, change pipette tips between adding of each standard level, between sample adding, and between reagent adding. Also, use separate reservoirs for each reagent. Otherwise, the results will be inaccurate! 13
Calculation of results Average the duplicate readings for each standard and samples and subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve by plotting the mean OD value for each standard on the y-axis or x-axis against the concentration on the x-axis or y-axis and draw a best fit curve through the points on the graph. It is recommended to use some professional software to do this calculation, such as curve expert 1.3 or 1.4. In the software interface, a best fitting equation of standard curve will be calculated using OD values and concentrations of standard sample. The software will calculate the concentration of samples after entering the OD value of samples. If samples have been diluted, the concentration calculated from the standard curve must be multiplied by the dilution factor. If the OD of the sample surpasses the upper limit of the standard curve, you should re-test it after appropriate dilution. The actual concentration is the calculated concentration multiplied dilution factor. Sensitivity The minimum detectable dose of PorcineNT-3is 0.281ng/mL (The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection (LLD) was defined as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero). Detection Range 0.469 30ng/mL. Specificity This kit recognizes recombinant and natural PorcineNT-3. No significant cross-reactivity orinterference was observed. Repeatability Coefficient of variation were<10% 14
SUMMARY 1. Add 100μL standard or sample to each well. Incubate 90mintues at 37 2. Remove the liquid. Add 100μLBiotinylated Detection Ab. Incubate 1 hour at 37 3. Aspirate and wash 3 times 4. Add 100μL HRP Conjugate. Incubate 30 minutes at 37 5. Aspirate and wash 5 times 6. Add 90μL Substrate Reagent. Incubate 15 minutes at 37 7. Add 50μL Stop Solution. Read at 450nm immediately 8. Calculation of results 15
Troubleshooting If the results are not good, please take pictures, keep the used plate and remaining reagents. Then contact our technical department. Meanwhile, you could refer to the following materials. Problem Causes Solutions Poor standard curve Low signal Deep color but low value Inaccurate pipetting Improper standard dilution Wells not completely aspirated Too brief incubation times Incorrect assay temperature Inadequate reagent volumes Improper dilution Plate reader settings not optimal Check pipettes Ensure briefly spin the vial of standard and dissolve the powder thoroughly by a gentle mix. Completely aspirate wells between steps. Ensure sufficient incubation time; Use recommended incubation temperature. Bring substrate to room temperature before use. Check pipettes and ensure correct preparation Verify the wavelength and filter setting in the plate reader. Open the Plate Reader ahead to pre-heat Large CV Inaccurate pipetting Check pipettes High background Concentration of detector too high Plate is insufficiently washed Contaminated wash buffer Use recommended dilution factor. Review the manual for proper wash. If using a plate washer, check that all ports are unobstructed. Make fresh wash buffer All the reagents should be stored according to the Improper storage of the ELISA kit instructions Low sensitivity Stop solution should be added to each well before Stop solution not added measurement Declaration: 1. Limited by the current conditions and scientific technology, we can't completely conduct the comprehensive identification and analysis on all the raw material provided. So there might be some qualitative and technical risks for users using the kit. 2. The final experimental results will be closely related to validity of the products, operation skills of the operators and the experimental environments. Please make sure that sufficient samples are available. 3. To get the best results, please only use the reagents supplied by the manufacturer and strictly comply with the instructions in the description! 4. Valid period: 6 months. 5. This description is also suitable for 48T kit. Copyright 2014-2015Elabscience Biotechnology Co.,Ltd All Rights Reserved