5 10 15 20 25 30 35 制 药 用 水 微 生 物 检 测 方 法 研 究 颜 若 曦 ( 北 京 紫 竹 药 业 有 限 公 司, 北 京 100024) 摘 要 : 制 药 用 水 是 药 品 生 产 企 业 应 用 最 广 泛 的 原 料 和 清 洗 剂, 尤 其 是 纯 化 水 和 注 射 用 水 其 中 微 生 物 指 标 是 最 重 要 的 控 制 指 标 当 前, 各 国 药 典 对 纯 化 水 和 注 射 用 水 的 微 生 物 检 测 方 法 基 本 一 致, 仅 限 度 标 准 不 同 但 各 国 药 典 之 间 对 制 药 用 水 的 微 生 物 检 测 方 法 却 存 在 差 异 本 文 以 纯 化 水 作 为 制 药 用 水 的 代 表, 对 欧 洲 药 典 及 美 国 药 典 制 药 用 水 微 生 物 检 测 方 法 进 行 对 比 分 析, 分 别 按 欧 洲 药 典 及 美 国 药 典 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 检 测 纯 化 水 中 的 各 典 型 微 生 物, 通 过 对 实 验 数 据 的 方 差 分 析, 判 断 欧 美 药 典 微 生 物 检 测 方 法 对 各 典 型 微 生 物 是 否 存 在 显 著 性 差 异, 进 而 确 认 最 优 检 测 方 法 并 对 此 方 法 进 行 验 证, 检 测 此 方 法 对 各 类 微 生 物 的 回 收 率, 保 证 此 方 法 的 准 确 性 在 此 基 础 上, 同 时 使 用 上 述 试 验 获 得 的 最 优 检 测 方 法 与 中 国 药 典 制 药 用 水 微 生 物 检 测 方 法 对 一 组 纯 化 水 系 统 的 关 键 使 用 点 实 施 同 步 监 测, 考 察 两 种 方 法 检 测 结 果 的 差 异 性 为 制 药 用 水 微 生 物 检 测 提 供 依 据, 指 导 制 药 企 业 在 制 水 系 统 日 常 监 测 及 验 证 中 进 行 微 生 物 检 测 方 法 的 选 择, 为 制 药 企 业 建 立 同 时 符 合 中 美 欧 药 典 要 求 的 制 水 系 统 提 供 微 生 物 检 测 方 法 参 考, 降 低 质 量 成 本 关 键 词 : 药 品 检 测 ; 纯 化 水 ; 制 药 用 水 ; 微 生 物 ; 显 著 性 分 析 ; 方 法 验 证 中 图 分 类 号 :TQ The analysis of microbial test method of pharmaceutical water Yan Ruoxi (Beijing zizhu pharmaceutical, Beijing 100024) Abstract: Pharmaceutical water is the most widely applied materials and cleaning agents in pharmaceutical companies especially purified water and water for injection. Microbiology is the most important control conten for pharmaceutical water. Current, the microbial test methods of purified water and water for injection in one national pharmacopoeia are basically the same, but among the different national pharmacopoeia, the methods are different. In this paper, it uses three different microbial test method of purified water which come from USP and Ph.Eur to test many typical microbial. According to experiment data, using variance analysis to judgement that whether there are significant differences among these methods. Based on it, finding the best method. Then, validated the method. At last, testing the same key use point of one purified water system by the above method and the method of Chinese pharmacopoeia toevaluate differences between two methods. The paper not only provides the basis for the micro-organic test on the pharmaceutical water, but aslo gives guidelines on water system validation and daily monitoring. Keywords: Pharmaceutical testing; Purified water; Pharmaceutical water; Microorganism; Remarkable analysis; Method validation * 0 引 言 40 45 水 是 制 药 工 业 中 应 用 最 广 泛 的 工 艺 原 料, 常 用 做 药 品 的 组 成 成 分 溶 剂 稀 释 剂 等 同 时 水 广 泛 应 用 于 制 药 设 备 和 系 统 的 清 洗 而 水 却 极 易 滋 生 微 生 物 并 助 其 生 长, 微 生 物 指 标 是 其 最 重 要 的 指 标 [1] 制 药 用 水 通 常 包 括 饮 用 水 纯 化 水 注 射 用 水 和 灭 菌 注 射 用 水 当 前, 各 国 药 典 对 纯 化 水 和 注 射 用 水 的 微 生 物 检 测 方 法 基 本 是 一 致 的, 仅 微 生 物 限 度 标 准 不 同 但 各 国 药 典 之 间 对 制 药 用 水 的 微 生 物 检 测 方 法 却 存 在 差 异 [2-5] 其 后 果 是 : 仅 按 一 部 药 典 进 行 微 生 物 检 测 获 得 的 数 据 很 难 被 其 他 药 典 标 准 认 同, 进 而 导 致 对 制 水 系 统 制 药 用 水, 乃 至 产 品 质 量 受 到 的 质 疑 本 文 拟 确 认 一 种 各 国 药 典 均 认 同 的 制 药 用 水 微 生 物 检 测 方 法, 为 制 药 企 作 者 简 介 : 颜 若 曦,(1983-), 男, 工 程 师, 主 要 研 究 方 向 : 药 品 质 量 控 制 E-mail: sssyrx@163.com - 1 -
50 55 业 解 决 此 问 题 提 供 思 路 实 验 以 纯 化 水 作 为 制 药 用 水 的 代 表, 对 欧 洲 药 典 及 美 国 药 典 制 药 用 水 微 生 物 检 测 方 法 进 行 对 比 分 析, 分 别 在 纯 化 水 中 加 入 各 类 代 表 性 微 生 物, 同 时 按 欧 洲 药 典 美 国 药 典 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 进 行 检 测, 通 过 对 检 测 数 据 的 方 差 分 析, 判 断 欧 洲 药 典 与 美 国 药 典 微 生 物 检 测 方 法 是 否 存 在 显 著 性 差 异, 根 据 各 典 型 微 生 物 回 收 率 情 况 确 认 最 优 检 测 方 法 同 时 按 欧 美 药 典 要 求 对 此 方 法 进 行 验 证, 检 测 对 各 类 微 生 物 的 回 收 率, 进 一 步 保 证 此 方 法 的 准 确 性 在 此 基 础 上, 使 用 此 最 优 检 测 方 法 与 中 国 药 典 制 药 用 水 微 生 物 检 测 方 法 对 纯 化 水 系 统 的 关 键 使 用 点 实 施 同 步 监 测, 考 察 检 测 结 果 差 异 性 指 导 制 药 企 业 在 制 水 系 统 日 常 监 测 及 验 证 中 选 择 微 生 物 检 测 方 法, 并 为 各 制 药 企 业 建 立 一 种 同 时 符 合 中 国 药 典 欧 洲 药 典 及 美 国 药 典 要 求 的 制 药 用 水 微 生 物 检 测 方 法 提 供 参 考 进 而 在 保 证 制 药 用 水 微 生 物 检 测 结 果 有 效 性 的 同 时, 降 低 检 测 成 本 1 实 验 试 剂 与 仪 器 1.1 实 验 试 剂 及 培 养 基 60 65 1.1.1 培 养 基 平 板 计 数 琼 脂 培 养 基 干 粉 试 剂 胰 蛋 白 胨 大 豆 琼 脂 培 养 基 干 粉 试 剂 胰 蛋 白 胨 大 豆 肉 汤 培 养 基 干 粉 试 剂 沙 氏 葡 萄 糖 肉 汤 培 养 基 干 粉 试 剂 沙 氏 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 干 粉 试 剂 :BD 公 司 ; R2A 琼 脂 培 养 基 干 粉 :OXOID; 营 养 琼 脂 培 养 基 干 粉 试 剂 玫 瑰 红 钠 琼 脂 培 养 基 干 粉 试 剂 沙 氏 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 干 粉 试 剂 ph7.0 无 菌 氯 化 钠 - 蛋 白 胨 缓 冲 液 干 粉 试 剂 : 北 京 三 药 科 技 开 发 公 司 1.1.2 试 剂 实 验 用 水 及 耗 材 0.9% 无 菌 氯 化 钠 溶 液 :OXOID; 纯 化 水 : 北 京 紫 竹 药 业 有 限 公 司 ;0.45µm 无 菌 纤 维 滤 膜 :Sartorius Stedim Biotech 70 75 1.2 实 验 菌 种 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (CMCC 号 :26003), 大 肠 埃 希 菌 (CMCC 号 :44102), 枯 草 芽 孢 杆 菌 (CMCC 号 :63501), 铜 绿 假 单 孢 菌 (CMCC 号 :10104), 白 色 念 珠 菌 (CMCC 号 : 98001), 黑 曲 霉 (CMCC 号 :98003) 实 验 用 菌 种 均 按 药 典 规 定, 取 3-5 代 菌 种 的 新 鲜 培 养 物 制 备 菌 悬 液,2 ~8 保 存 24h 内 使 用 1.3 实 验 仪 器 生 化 培 养 箱 : 海 尔 集 团 ; 超 净 工 作 台 : 北 京 昌 平 长 城 空 气 净 化 工 程 公 司 ; 生 物 安 全 柜 : 北 京 东 联 哈 尔 仪 器 厂 ; 普 通 卧 式 压 力 蒸 汽 灭 菌 器 : 山 东 新 华 医 疗 器 械 厂 ;ph 计 : 梅 特 勒 托 利 多 - 2 -
80 2 美 国 药 典 与 欧 洲 药 典 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 分 析 2.1 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 描 述 2.1.1 美 国 药 典 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 及 质 量 标 准 85 90 95 100 美 国 药 典 在 第 1231 章 < 制 药 用 水 > 中 推 荐 使 用 0.45µm 滤 膜 采 用 薄 膜 过 滤 法, 并 建 议 同 时 使 用 高 营 养 培 养 基 和 低 营 养 培 养 基 检 测 制 药 用 水 中 的 微 生 物 高 营 养 培 养 基 ( 例 如 : 标 准 方 法 平 板 计 数 琼 脂 ) 在 30 ~35 培 养 72 小 时 以 上, 低 营 养 培 养 基 ( 例 如 :R2A 琼 脂 ) 在 20 ~25 培 养 96 小 时 以 上 质 量 标 准 : 100cfu/mL [3] 检 测 操 作 详 述 ( 可 根 据 实 际 情 况 调 整 ): 量 取 10ml 充 分 混 匀 的 水 样, 以 无 菌 操 作 加 入 安 装 好 的 薄 膜 过 滤 器 内, 过 滤 并 用 ph7.0 的 无 菌 氯 化 钠 - 蛋 白 胨 缓 冲 液 冲 洗 滤 膜, 每 张 滤 膜 每 次 冲 洗 量 为 100ml, 共 冲 洗 1 次 过 滤 后, 取 出 滤 膜, 正 面 朝 上 贴 于 琼 脂 平 板 上 共 制 备 2 张 滤 膜, 一 张 滤 膜 贴 于 平 板 计 数 琼 脂 培 养 基 平 板 ( 高 营 养 培 养 基 ), 置 30 ~35 生 化 培 养 箱 中 倒 置 培 养 2~3 天, 计 数 另 一 张 滤 膜 贴 于 R2A 琼 脂 平 板 ( 低 营 养 培 养 基 ), 置 20 ~ 25 生 化 培 养 箱 倒 置 培 养 5~7 天, 计 数 以 培 养 基 平 板 上 菌 落 数 生 长 较 多 者 作 为 检 测 结 果, 按 比 例 折 算 为 1ml 纯 化 水 中 的 微 生 物 数 量 后 报 告 2.1.2 欧 洲 药 典 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 及 质 量 标 准 欧 洲 药 典 纯 化 水 各 论 微 生 物 检 测 方 法 : 使 用 薄 膜 过 滤 法 (0.45µm 孔 径 滤 膜 ), 使 用 R2A 琼 脂 培 养 基 在 30 ~35 培 养 5 天 以 上 质 量 标 准 : 100cfu/mL [4] 检 测 操 作 详 述 ( 可 根 据 实 际 情 况 调 整 ): 量 取 10ml 充 分 混 匀 的 水 样, 以 无 菌 操 作 加 入 安 装 好 的 薄 膜 过 滤 器 内, 过 滤 并 用 ph7.0 的 无 菌 氯 化 钠 - 蛋 白 胨 缓 冲 液 冲 洗 滤 膜, 每 张 滤 膜 每 次 冲 洗 量 为 100ml, 共 冲 洗 1 次 过 滤 后, 取 出 滤 膜, 正 面 朝 上 贴 于 R2A 琼 脂 平 板 上, 置 30 ~35 生 化 培 养 箱 中 倒 置 培 养 5 天, 计 数 按 比 例 折 算 为 1ml 纯 化 水 中 的 微 生 物 数 量 后 报 告 2.1.3 美 国 药 典 与 欧 洲 药 典 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 对 比 105 110 如 上, 欧 洲 药 典 和 美 国 药 典 对 纯 化 水 微 生 物 的 检 测 操 作 基 本 相 同, 均 采 用 薄 膜 过 滤 法, 但 在 检 测 用 培 养 基 培 养 条 件 及 培 养 时 间 方 面 有 所 区 别, 具 体 见 表 1 表 1 欧 洲 药 典 与 美 国 药 典 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 对 比 药 典 名 称 微 生 物 检 测 方 法 培 养 基 培 养 温 度 培 养 时 间 欧 洲 药 典 7.0 薄 膜 过 滤 法 R2A 琼 脂 培 养 基 30 ~35 5 天 美 国 药 典 薄 膜 过 滤 法 R2A 琼 脂 培 养 基 ( 低 营 养 培 养 基 ) 20 ~25 5 天 (USP35-NF30) 薄 膜 过 滤 法 平 板 计 数 琼 脂 培 养 基 ( 高 营 养 培 养 基 ) 30 ~35 3 天 注 : 培 养 时 间 可 根 据 实 际 培 养 情 况 适 当 延 长 2.2 美 国 药 典 与 欧 洲 药 典 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 差 异 分 析 根 据 本 文 表 1, 欧 洲 药 典 与 美 国 药 典 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 的 区 别 主 要 包 括 检 测 培 养 基 培 养 温 度 和 培 养 时 间, 概 括 起 来 有 3 种 不 同 条 件 为 考 察 此 3 种 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 实 际 检 测 能 力 之 间 的 关 系, 拟 使 用 常 见 微 生 物 的 典 型 菌 株 ( 表 3) 分 别 按 检 测 方 法 的 3 种 不 - 3 -
115 同 条 件 进 行 检 测, 使 用 单 因 子 方 差 分 析 的 方 法 考 察 3 种 不 同 条 件 对 各 类 微 生 物 典 型 菌 株 检 测 能 力 之 间 是 否 存 在 显 著 性 差 异 2.2.1 实 验 设 计 以 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 为 因 子 ( 使 用 字 母 A 表 示 ), 使 用 不 同 检 测 方 法 ( 不 同 的 因 子 水 平, 见 表 2) 获 得 的 微 生 物 计 数 结 果 服 从 正 态 分 布, 检 测 结 果 之 间 相 互 独 立, 其 方 差 相 120 等 通 过 考 察 不 同 方 法 对 各 类 常 见 微 生 物 典 型 菌 株 的 检 测 结 果 之 间 是 否 存 在 显 著 性 差 异, 进 而 判 断 检 测 方 法 之 间 是 否 存 在 显 著 性 差 异 表 2 因 子 水 平 (Ai) 与 检 测 方 法 对 应 关 系 表 因 子 水 平 检 测 方 法 说 明 方 法 来 源 A 1 平 板 计 数 琼 脂 培 养 基,30 ~35, 培 养 3 天 ; USP A 2 R2A 琼 脂 培 养 基, 于 30 ~35, 培 养 5 天 ; ph.eur A 3 R2A 琼 脂 培 养 基, 于 20 ~25, 培 养 5 天 ; USP 125 表 3 常 见 微 生 物 典 型 菌 种 列 表 微 生 物 类 别 典 型 代 表 菌 种 菌 株 编 号 (CMCC) 革 兰 氏 阴 性 菌 大 肠 埃 希 菌 ; 铜 绿 假 单 胞 菌 44102;10104 革 兰 氏 阳 性 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 26003 芽 孢 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 63501 酵 母 菌 白 色 念 珠 菌 98001 霉 菌 黑 曲 霉 98003 2.2.2 实 验 方 法 1) 菌 液 制 备 接 种 铜 绿 假 单 孢 菌 大 肠 埃 希 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 新 鲜 培 养 物 至 胰 蛋 130 135 白 胨 大 豆 肉 汤 中 于 30 35, 培 养 18~24 小 时 ; 接 种 白 色 念 珠 菌 的 新 鲜 培 养 物 至 沙 氏 葡 萄 糖 琼 脂 中 于 20 25, 培 养 48~72 小 时 上 述 培 养 物 用 ph 7.0 的 氯 化 钠 - 蛋 白 胨 缓 冲 液, 采 用 10 倍 递 增 稀 释 法, 稀 释 至 10-5 ~10-7 制 成 每 1ml 含 菌 数 小 于 100cfu 的 菌 悬 液 接 种 黑 曲 霉 的 新 鲜 培 养 物 至 沙 氏 葡 萄 糖 琼 脂 表 面, 于 20 25 培 养 5~7 天, 加 入 3~ 5ml 含 0.05%(v/v) 聚 山 梨 酯 80 的 ph 7.0 的 氯 化 钠 - 蛋 白 胨 缓 冲 液, 将 孢 子 洗 脱 然 后, 取 底 部 附 有 无 菌 棉 的 漏 斗 过 滤, 用 无 菌 吸 管 吸 出 孢 子 悬 液 至 无 菌 试 管 内, 用 含 0.05%(v/v) 聚 山 梨 酯 80 的 ph 7.0 的 氯 化 钠 - 蛋 白 胨 缓 冲 液 采 用 10 倍 递 增 稀 释 法, 稀 释 至 10-4 ~10-6, 制 成 每 1ml 含 孢 子 数 小 于 100cfu 的 孢 子 悬 液 2) 对 比 试 验 A 1 水 平 试 验 : 分 别 取 表 3 中 的 各 典 型 代 表 菌 种 按 上 述 方 法 制 备 的 菌 悬 液 各 1mL, 置 于 140 90mm 的 无 菌 培 养 皿 中, 注 入 15~20ml 平 板 计 数 琼 脂 培 养 基, 摇 匀, 凝 固 后, 倒 置 于 30 ~35 培 养 72 小 时, 计 数, 每 个 典 型 代 表 菌 种 分 别 采 用 3 个 不 同 批 次 的 平 板 计 数 琼 脂 培 养 基 倾 注, 每 个 批 次 培 养 基 共 2 个 平 皿, 共 制 备 6 个 平 皿 A 2 水 平 试 验 : 分 别 取 表 3 中 的 各 典 型 代 表 菌 种 按 上 述 方 法 制 备 的 菌 悬 液 各 1mL, 置 于 90mm 的 无 菌 培 养 皿 中, 注 入 15~20mlR2A 琼 脂 培 养 基, 摇 匀, 凝 固 后, 倒 置 培 养, 145 于 30~35 培 养 5 天, 计 数, 每 个 典 型 代 表 菌 种 分 别 采 用 3 个 不 同 批 次 的 平 板 计 数 琼 脂 培 养 基 倾 注, 每 个 批 次 培 养 基 共 2 个 平 皿, 共 制 备 6 个 平 皿 - 4 -
A 3 水 平 试 验 : 分 别 取 表 3 中 的 各 典 型 代 表 菌 种 按 上 述 方 法 制 备 的 菌 悬 液 各 1mL, 置 于 90mm 的 无 菌 培 养 皿 中, 注 入 15~20mlR2A 琼 脂 培 养 基, 摇 匀, 凝 固 后, 倒 置 培 养, 于 20~25 培 养 5 天, 计 数, 每 个 典 型 代 表 菌 种 分 别 采 用 3 个 不 同 批 次 的 平 板 计 数 琼 150 脂 培 养 基 倾 注, 每 个 批 次 培 养 基 共 2 个 平 皿, 共 制 备 6 个 平 皿 2.2.3 显 著 性 差 异 分 析 ( 单 因 子 方 差 分 析 ) 155 使 用 单 因 子 方 差 分 析 判 断 不 同 水 平 的 检 测 结 果 的 影 响 是 否 显 著 表 2 中 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 有 3 个 水 平 (A i(i=1 2 3) ) 每 个 水 平 下 进 行 了 6 次 重 复 试 验, 其 结 果 分 别 表 示 为 y i1,y i2,,y i6 每 个 水 平 下 测 定 的 菌 落 数 相 互 独 立, 且 服 从 正 态 分 布, 根 据 实 验 结 果 分 别 计 算 总 离 查 平 方 和 ST, 组 间 平 方 和 SA, 组 内 平 方 和 Se, 自 由 度 (f T, f A, f e ), 进 而 计 算 F 比, 将 计 算 结 果 与 F 1-α (f A,f e ) 值 进 行 比 较,F> F 1-α (f A,f e ) 时 认 为 因 子 A 在 显 著 性 水 平 α( 取 5%) 时 的 影 响 是 显 著 的, 否 则 认 为 是 不 显 著 的 [6] 2.3 纯 化 水 微 生 物 计 数 最 优 方 法 选 择 160 根 据 单 因 子 方 差 分 析 结 果 判 断, 若 不 同 水 平 ( 方 法 ) 对 各 典 型 代 表 菌 种 检 测 均 无 显 著 性 影 响, 则 三 种 检 测 方 法 均 可 使 用, 三 种 方 法 检 测 能 力 是 一 致 的 若 3 种 方 法 对 其 中 一 种 或 多 种 典 型 代 表 菌 种 检 测 存 在 显 著 性 影 响 时, 三 种 方 法 检 测 能 力 是 不 一 致 的, 应 根 据 实 验 数 据, 选 择 检 出 能 力 较 高 的 方 法 作 为 最 优 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 3 欧 美 药 典 最 优 纯 化 水 微 生 物 计 数 方 法 验 证 165 参 考 USP,ph.Eur 及 Ch.P 对 微 生 物 检 测 方 法 验 证 要 求 对 上 述 实 验 确 认 的 最 优 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 进 行 回 收 率 验 证, 使 用 表 3 中 各 典 型 代 表 菌, 分 别 进 行 3 次 独 立 平 行 试 验 3.1 方 法 描 述 170 175 180 试 验 组 : 取 10ml 纯 化 水 样 品, 以 无 菌 操 作 加 入 安 装 好 的 薄 膜 过 滤 器 内, 过 滤 加 入 100mlpH7.0 的 无 菌 氯 化 钠 - 蛋 白 胨 缓 冲 液 至 滤 器 内, 再 加 入 1mL 含 菌 数 约 50-100cfu/mL 的 菌 液, 滤 干 后 取 滤 膜 按 待 验 证 微 生 物 检 测 方 法 进 行 操 作, 检 测 计 数 重 复 此 操 作, 确 保 表 3 中 的 每 一 典 型 菌 落 均 制 备 一 试 验 组 平 皿 菌 液 组 : 分 别 取 铜 绿 假 单 孢 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 大 肠 埃 希 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 验 证 用 菌 液 各 1ml, 置 于 90mm 的 无 菌 培 养 皿 中, 注 入 15~20mlR2A 琼 脂 培 养 基, 摇 匀, 凝 固 后, 置 30~35 培 养 72 小 时, 计 数, 每 种 菌 做 2 个 平 皿, 其 平 均 值 为 最 终 检 测 结 果 2 取 白 色 念 珠 菌 黑 曲 霉 菌 液 验 证 用 菌 液 各 1ml, 置 于 90mm 的 无 菌 培 养 皿 中, 注 入 15~20mlR2A 琼 脂 培 养 基, 摇 匀, 凝 固 后, 置 30~35 培 养 120 小 时, 计 数, 每 种 菌 做 2 个 平 皿, 其 平 均 值 为 最 终 检 测 结 果 [7] 供 试 品 对 照 组 : 取 10ml 纯 化 水 样 品, 以 无 菌 操 作 加 入 安 装 好 的 薄 膜 过 滤 器 内, 过 滤 加 入 100mlpH7.0 的 无 菌 氯 化 钠 - 蛋 白 胨 缓 冲 液 至 滤 器 内, 滤 干 后 取 滤 膜 按 待 验 证 微 生 物 检 测 方 法 进 行 操 作, 检 测 计 数 [3,4 ] 稀 释 剂 对 照 组 : 使 用 ph7.0 的 无 菌 氯 化 钠 - 蛋 白 胨 缓 冲 液 代 替 试 验 组 中 的 纯 化 水 样 品 按 试 验 组 操 作 进 行 检 测 计 数 [2] 3.2 判 定 标 准 根 据 试 验 结 果, 计 算 试 验 组 回 收 率 及 稀 释 剂 对 照 组 回 收 率, 均 应 70% - 5 -
计 算 公 式 如 下 : 185 试 验 组 的 菌 落 数 供 试 品 对 照 组 菌 落 数 试 验 组 回 收 率 = 100% 菌 液 组 平 菌 菌 落 数 190 稀 释 剂 对 照 组 菌 落 数 稀 释 剂 对 照 组 回 收 率 = 100% 菌 液 组 平 菌 菌 落 数 4 中 国 药 典 与 欧 美 药 典 纯 化 水 微 生 物 计 数 方 法 检 测 结 果 差 异 考 察 同 时 使 用 上 述 实 验 确 认 的 最 优 检 测 方 法 与 中 国 药 典 检 测 方 法 对 纯 化 水 系 统 的 回 水 口 实 195 施 同 步 持 续 检 测, 连 续 检 测 至 获 取 10 个 批 次 的 检 测 数 据, 使 用 单 因 子 方 差 分 析 对 检 测 数 据 进 行 分 析, 评 估 4.1 中 国 药 典 纯 化 水 微 生 物 计 数 方 法 中 国 药 典 (2010 版 ) 二 部 纯 化 水 各 论 微 生 物 检 测 方 法 : 使 用 薄 膜 过 滤 法 (0.45µm 孔 径 滤 膜 ), [8] 使 用 营 养 琼 脂 培 养 基 在 30 ~35 培 养 3 天, 检 测 细 菌 数 ; 使 用 玫 瑰 红 钠 琼 脂 培 200 养 基 在 23 ~28 培 养 5 天 霉 菌 和 酵 母 菌 数 ; 合 并 计 数 质 量 标 准 : 100cfu/mL [2] 检 测 操 作 详 述 : 量 取 10ml 充 分 混 匀 的 水 样, 以 无 菌 操 作 加 入 安 装 好 的 薄 膜 过 滤 器 内, 过 滤 并 用 ph7.0 的 无 菌 氯 化 钠 - 蛋 白 胨 缓 冲 液 冲 洗 滤 膜, 每 张 滤 膜 每 次 冲 洗 量 为 100ml, 共 冲 洗 1 次 过 滤 后, 取 出 滤 膜, 正 面 朝 上 贴 于 营 养 琼 脂 平 板 上, 置 30 ~35 生 化 培 养 箱 中 205 倒 置 培 养 3 天, 逐 日 计 数 同 法 操 作, 将 另 一 滤 膜 正 面 朝 上 贴 于 玫 瑰 红 钠 琼 脂 平 板 上, 置 23 ~28 生 化 培 养 箱 中 倒 置 培 养 5 天, 逐 日 计 数 4.2 中 国 药 典 与 欧 美 药 典 纯 化 水 检 测 结 果 差 异 分 析 使 用 单 因 子 方 差 分 析, 不 同 检 测 方 法 为 不 同 水 平, 设 :B 1 经 验 证 的 中 国 药 典 方 法, B 2 经 验 证 的 最 优 检 测 方 法 ( 欧 美 药 典 ), 根 据 实 验 数 据, 计 算 F 比 210 5 实 验 数 据 与 分 析 5.1 美 国 药 典 与 欧 洲 药 典 纯 化 水 微 生 物 计 数 方 法 显 著 性 分 析 实 验 5.1.1 革 兰 氏 阴 性 菌 ( 大 肠 埃 希 菌, 铜 绿 假 单 胞 菌 ) 检 测 结 果 方 差 分 析 215 表 4 不 同 水 平 (Ai) 下 大 肠 埃 希 菌 检 测 结 果 列 表 A 1 78 72 75 74 77 78 A 2 73 75 76 76 75 73 A 3 77 75 74 72 77 72 注 : 按 横 排 顺 序,6 次 试 验 数 据,2 个 为 1 组, 对 应 3 个 不 同 批 次 培 养 基 的 检 测 结 果 表 5 大 肠 埃 希 菌 单 因 子 方 差 分 析 表 因 子 A S A =4.78 f A =3-1=2 MS A =S A /f A =2.39 F=MS A /MS e =0.56 误 差 e S e =64.17 f e =17-2=15 MS e =S e /f e =4.28 总 计 T S T =68.94 f T =18-1=17-6 -
220 225 表 6 不 同 水 平 (Ai) 下 铜 绿 假 单 胞 菌 检 测 结 果 列 表 A 1 106 110 107 109 95 95 A 2 85 86 96 103 104 96 A 3 92 93 96 104 97 105 注 : 按 横 排 顺 序,6 次 试 验 数 据,2 个 为 1 组, 对 应 3 个 不 同 批 次 培 养 基 的 检 测 结 果 表 7 铜 绿 假 单 胞 菌 单 因 子 方 差 分 析 表 因 子 A S A =234.33 f A =2 MS A =117.17 F=2.46 误 差 e S e =714.17 f e =15 MS e =47.61 总 计 T S T =948.50 f T =17 分 析 结 论 : 在 显 著 性 水 平 α=0.05 上 查 F 表,F 0.95 (2, 15)=3.68 因 0.56<3.68;2.46<3.68 所 以 在 显 著 性 水 平 α=0.05 上, 三 种 检 测 方 法 对 以 大 肠 埃 希 菌 和 铜 绿 假 单 胞 菌 为 代 表 的 革 兰 氏 阴 性 菌 无 显 著 性 差 异 5.1.2 革 兰 氏 阳 性 菌 ( 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ) 检 测 结 果 方 差 分 析 230 235 表 8 不 同 水 平 (Ai) 下 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检 测 结 果 列 表 A1 56 60 56 54 58 52 A2 55 57 54 60 56 60 A3 59 56 54 57 55 56 注 : 按 横 排 顺 序,6 次 试 验 数 据,2 个 为 1 组, 对 应 3 个 不 同 批 次 培 养 基 的 检 测 结 果 表 9 金 黄 色 葡 萄 球 菌 单 因 子 方 差 分 析 表 因 子 A S A =3.44 f A =2 MS A =1.72 F=0.30 误 差 e S e =86.83 f e =15 MS e =5.79 总 计 T S T =90.28 f T =17 分 析 结 论 : 在 显 著 性 水 平 α=0.05 上 查 F 表,F 0.95 (2, 15)=3.68 0.30<3.68 所 以 在 显 著 性 水 平 α=0.05 上, 三 种 检 测 方 法 对 以 大 金 黄 色 葡 萄 球 菌 为 代 表 的 革 兰 氏 阳 性 菌 无 显 著 性 差 异 5.1.3 芽 孢 菌 ( 枯 草 芽 孢 杆 菌 ) 检 测 结 果 方 差 分 析 240 表 10 不 同 水 平 (Ai) 下 枯 草 芽 孢 杆 菌 检 测 结 果 列 表 A 1 60 53 63 56 61 61 A 2 58 61 62 65 63 64 A 3 54 57 55 52 56 52 注 : 按 横 排 顺 序,6 次 试 验 数 据,2 个 为 1 组, 对 应 3 个 不 同 批 次 培 养 基 的 检 测 结 果 ; A 1 均 值 为 59.00,A 2 均 值 为 62.17, A 3 均 值 为 54.33 表 11 枯 草 芽 孢 杆 菌 单 因 子 方 差 分 析 表 因 子 A S A =186.33 f A =2 MS A = 93.17 F=11.44 误 差 e S e =122.17 f e =15 MS e = 8.14 总 计 T S T =308.50 f T = 17 分 析 结 论 : 245 1) 在 显 著 性 水 平 α=0.05 上 查 F 表,F 0.95 (2, 15)=3.68 11.44>3.68 所 以 在 显 - 7 -
著 性 水 平 α=0.05 上, 三 种 检 测 方 法 对 以 枯 草 芽 孢 杆 菌 为 代 表 的 芽 孢 菌 有 显 著 性 差 异 ; 2) 从 枯 草 芽 孢 杆 菌 检 测 结 果 平 均 值 可 知,A 2 检 测 结 果 最 大, 最 有 利 于 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 生 长,A 3 检 测 结 果 最 小, 最 不 适 用 于 检 测 纯 化 水 中 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 250 5.1.4 酵 母 菌 ( 白 色 念 珠 菌 ) 检 测 结 果 方 差 分 析 表 12 不 同 水 平 (Ai) 下 白 色 念 珠 菌 检 测 结 果 列 表 A 1 101 103 104 106 102 109 A 2 101 103 104 105 106 104 A 3 107 102 108 103 118 110 注 : 按 横 排 顺 序,6 次 试 验 数 据,2 个 为 1 组, 对 应 3 个 不 同 批 次 培 养 基 的 检 测 结 果 255 表 13 白 色 念 珠 菌 单 因 子 方 差 分 析 表 因 子 A S A =64.33 f A =2 MS A =32.17 F=2.16 误 差 e S e =223.67 f e =15 MS e =14.91 总 计 T S T =288.00 f T =17 分 析 结 论 : 在 显 著 性 水 平 α=0.05 上 查 F 表,F 0.95 (2, 15)=3.68 2.16<3.68 所 以 在 显 著 性 水 平 α=0.05 上, 三 种 检 测 方 法 对 以 白 色 念 珠 菌 为 代 表 酵 母 菌 的 无 显 著 性 差 异 260 265 5.1.5 霉 菌 ( 黑 曲 霉 ) 检 测 结 果 方 差 分 析 表 14 不 同 水 平 (Ai) 下 黑 曲 霉 检 测 结 果 列 表 A 1 64 66 64 66 62 61 A 2 67 64 62 66 63 62 A 3 59 63 60 66 62 68 注 : 按 横 排 顺 序,6 次 试 验 数 据,2 个 为 1 组, 对 应 3 个 不 同 批 次 培 养 基 的 检 测 结 果 表 15 黑 曲 霉 单 因 子 方 差 分 析 表 因 子 A S A =3.44 f A =2 MS A =1.72 F=0.25 误 差 e Se=102.83 fe=15 MS e =6.86 总 计 T ST=106.28 f T = 17 分 析 结 论 : 在 显 著 性 水 平 α=0.05 上 查 F 表,F 0.95 (2, 15)=3.68 0.25<3.68 所 以 在 显 著 性 水 平 α=0.05 上, 三 种 检 测 方 法 对 以 大 黑 曲 霉 为 代 表 的 霉 菌 无 显 著 性 差 异 5.1.6 欧 美 药 典 最 优 纯 化 水 微 生 物 计 数 方 法 270 根 据 上 述 分 析 结 果, 可 知 3 种 检 测 方 法 对 革 兰 氏 阴 性 菌 革 兰 氏 阳 性 菌 酵 母 菌 霉 菌 的 检 测 无 显 著 性 影 响, 但 对 检 测 芽 孢 菌 有 显 著 性 差 异, 可 见 表 16: 表 16 三 种 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 测 差 异 分 析 水 平 常 见 微 生 物 革 兰 氏 阴 性 菌 革 兰 氏 阳 性 菌 芽 孢 菌 酵 母 菌 霉 菌 最 优 方 法 A 1 无 显 著 差 异 无 显 著 差 异 居 中 无 显 著 差 异 无 显 著 差 异 A 2 无 显 著 差 异 无 显 著 差 异 最 优 无 显 著 差 异 无 显 著 差 异 A 2 A 3 无 显 著 差 异 无 显 著 差 异 最 差 无 显 著 差 异 无 显 著 差 异 - 8 -
275 结 论 : 在 3 个 方 法 中,A 2 水 平 对 应 的 方 法 ( 欧 洲 药 典 方 法 :R2A 琼 脂 培 养 基, 于 30 ~ 35, 培 养 5 天 ) 为 最 优 方 法 5.2 欧 美 药 典 最 优 纯 化 水 微 生 物 计 数 方 法 验 证 实 验 5.2.1 实 验 结 果 280 对 A 2 水 平 对 应 的 方 法 进 行 验 证, 根 据 实 验 数 据 计 算 试 验 组 回 收 率 及 稀 释 剂 对 照 组 回 收 率, 计 算 结 果 详 见 表 17 表 18: 表 17 欧 洲 药 典 (A2) 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 验 证 试 验 组 回 收 率 列 表 试 验 次 数 大 肠 埃 希 菌 铜 绿 假 单 孢 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 白 色 念 珠 菌 黑 曲 霉 1 91.6% 92.3% 92.8% 92.9% 100.0% 90.8% 2 96.8% 97.8% 93.8% 97.6% 101.6% 84.6% 3 96.8% 100.0% 95.9% 97.6% 98.4% 90.8% 表 18 欧 洲 药 典 (A 2 ) 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 验 证 稀 释 剂 对 照 组 回 收 率 列 表 试 验 次 数 大 肠 埃 希 菌 铜 绿 假 单 孢 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 白 色 念 珠 菌 黑 曲 霉 1 97.9% 95.6% 96.9% 97.6% 96.8% 93.8% 2 95.8% 98.9% 92.8% 98.8% 98.4% 96.9% 3 95.8% 91.2% 94.8% 97.6% 93.5% 86.2% 285 5.2.2 实 验 结 论 A 2 水 平 所 对 应 方 法, 经 方 法 回 收 率 验 证, 符 合 中 国 药 典 美 国 药 典 及 欧 洲 药 典 要 求 5.3 中 国 药 典 与 欧 美 药 典 纯 化 水 检 测 结 果 差 异 考 察 实 验 5.3.1 实 验 数 据 290 因 子 B 水 平 中,B 1 为 中 国 药 典 方 法,B 2 为 欧 洲 药 典 方 法 ( 即 A2 水 平 对 应 方 法 ), 使 用 2 种 方 法 对 纯 化 水 系 统 送 水 口 连 续 10 次 同 步 微 生 物 检 测 数 据 见 表 19: 水 平 表 19 B1 B2 检 测 同 步 数 据 列 表 检 验 结 果 (cfu/10ml) B1 11 5 1 15 1 1 7 2 0 5 B2 16 6 8 8 3 6 15 5 1 7 5.3.2 数 据 分 析 295 根 据 表 19 中 的 数 据 进 行 单 因 方 差 分 析, 如 下 ( 表 20): 表 20 检 测 结 果 单 因 子 方 差 分 析 表 因 子 B S A =36.5 f A =1 MS A =36.5 F=1.55 误 差 e Se=424.1 fe=18 MS e = 23.6 总 计 T ST=460.5 f T = 19 300 分 析 结 论 : 在 显 著 性 水 平 0.05 上 查 F 表,F 0.95 (1, 18)=4.41 1.55<4.41 所 以 在 显 著 性 水 平 α=0.05 上, 使 用 B1 与 B2 水 平 的 两 种 方 法 对 此 纯 化 水 系 统 送 水 口 微 生 物 无 显 著 影 响 即 : 对 于 此 纯 化 水 系 统 的 送 水 口, 使 用 中 国 药 典 或 欧 洲 药 典 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 的 检 测 结 果 是 一 致 的 注 意 : 此 结 论 的 限 制 指 定 的 纯 化 水 系 统 与 指 定 的 使 用 点, 因 为 获 得 此 结 论 的 数 据 来 - 9 -
源 是 指 定 的 305 310 315 6 结 论 本 文 使 用 单 因 子 方 差 分 析 对 3 种 纯 化 水 微 生 物 检 验 方 法 进 行 差 异 显 著 性 分 析, 通 过 实 验 确 认 了 美 国 药 典 和 欧 洲 药 典 中 最 适 宜 的 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法, 并 对 此 方 法 进 行 了 回 收 率 的 验 证 为 制 药 企 业 开 展 纯 化 水 微 生 物 检 测 工 作 提 供 了 依 据, 保 证 检 测 结 果 准 确 可 靠, 同 时 降 低 了 企 业 的 质 量 检 验 成 本 制 药 企 业 可 以 参 考 本 文 中 使 用 单 因 子 方 差 分 析 对 不 同 微 生 物 检 测 方 法 差 异 进 行 分 析 的 例 子, 举 一 反 三, 考 虑 使 用 方 差 分 析 的 统 计 方 法 评 估 其 它 类 型 检 验 方 法 之 间 的 差 异 性 本 文 通 过 使 用 中 国 药 典 与 国 外 药 典 纯 化 水 微 生 物 检 测 方 法 对 纯 化 水 系 统 送 水 点 进 行 的 同 步 检 测 及 方 差 分 析, 确 认 二 种 方 法 对 此 纯 化 水 系 统 送 水 点 的 微 生 物 检 测 结 果 无 显 著 性 差 异 国 内 制 药 企 业 可 参 考 此 方 法, 评 估 已 按 中 国 药 典 微 生 物 检 测 方 法 进 行 过 PQ 验 证 的 制 药 用 水 系 统 是 否 符 合 欧 美 药 典 要 求, 进 而 避 免 因 纯 化 水 微 生 物 检 验 方 法 不 同 而 再 次 进 行 水 系 统 验 证 工 作 [ 参 考 文 献 ] (References) 320 325 [1] 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 中 心. 厂 房 设 施 与 设 备 : 药 品 GMP 指 南 [M]. 北 京 : 中 国 医 药 科 技 出 版 社,2011. [2] 国 家 药 典 委 员 会. 中 华 人 民 共 和 国 药 典 2010 版 二 部 [M]. 北 京 : 中 国 医 药 科 技 出 版 社,2010 [3] USP. USP35-NF30[M]. The United States Pharmacopeial Convention,2012 [4] EDQM. European Pharmacopoiea 7.0[M]. [5] 李 秋 菲, 王 小 亮, 绳 金 房. 现 行 版 美 国 药 典 微 生 物 实 验 室 质 量 管 理 规 范 译 介 [J]. 中 国 药 业,2010,19(18): 4-5. [6] 约 瑟 夫.M. 朱 兰. 朱 兰 质 量 手 册 ( 第 五 版 ). 北 京 : 中 国 人 民 大 学 出 版 社,2003. [7] 李 珏, 王 知 坚, 赵 嘉. 3 种 药 品 不 同 加 菌 时 机 对 菌 回 收 率 的 影 响 [J]. 药 物 分 析 杂 志,2011,31(6): 1116-1119 [8] 庄 华 玲, 李 艳 芳, 吴 国 盛. 纯 化 水 微 生 物 限 度 检 查 方 法 的 商 榷 [J]. 中 国 药 师,2006,9(10):99-100 - 10 -