基 础 研 究 食 品 科 学 2011, Vol. 32, No. 07 17 白 球 蛋 白 醇 溶 蛋 白 和 碱 溶 蛋 白 等, 发 现 白 果 中 的 蛋 白 质 主 要 以 清 蛋 白 和 球 蛋 白 为 主, 其 中 白 果 清 蛋 白 具 有 抗 氧 化 和 延 缓 衰 老 等 作

16 李 莹 莹 1, 吴 彩 娥 1, *, 杨 剑 婷 2, 范 龚 健 1 (1. 南 京 林 业 大 学 森 林 资 源 与 环 境 学 院, 江 苏 南 京 210037;2. 安 徽 科 技 学 院 食 品 药 品 学 院, 安 徽 凤 阳 233100) 对 白 果 的 主 要 过 敏 蛋 白 进 行 鉴 定, 并 对 其 过 敏 原 性 进 行 分 析 以 SDS-PAGE 和 Western-Blotting 分 析 鉴 定 白 果 蛋 白 提 取 液 中 的 蛋 白 质 组 分 和 过 敏 蛋 白, 通 过 间 接 ELISA 法 检 测 过 敏 小 鼠 血 清 中 sige 的 效 价 白 果 的 蛋 白 质 条 带 主 要 有 13 条, 其 中 以 21kD 和 32kD 含 量 最 多 Western-Blotting 分 析 结 果 表 明, 白 果 蛋 白 中 存 在 3 条 过 敏 原 蛋 白, 分 子 质 量 分 别 为 21 32 36kD 当 酶 标 二 抗 稀 释 度 为 1:1000, 白 果 蛋 白 包 被 质 量 浓 度 为 50μg/mL, 间 接 ELISA 测 得 过 敏 小 鼠 血 清 中 sige 的 效 价 为 1:6400 对 白 果 蛋 白 进 行 分 析 鉴 定, 明 确 了 白 果 中 存 在 的 过 敏 原 蛋 白 白 果 ; 过 敏 蛋 白 ;SDS-PAGE;Western-Blotting; 间 接 ELISA Identification and Allergenicity of Allergic Proteins in Ginkgo Seeds LI Ying-ying 1,WU Cai-e 1, *, YANG Jian-ting 2,FAN Gong-jian 1 (1.College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2.College of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China) Abstract :SDS-PAGE and Western-Blotting were used to identify the protein composition and allergic proteins of ginkgo seed extract, respectively. A total of 13 bands were observed in the SDS-PAGE pattern, and the fractions of 21 kd and 32 kd exhibited the highest content. Western-Blotting analysis indicated that ginkgo seeds had 3 allergic proteins, whose molecular weights were 21, 32 kd and 36 kd, respectively. When the enzyme secondary antibody concentration was 1:1000 and the ginkgo protein coating concentration was 50μg/mL, the serum IgE titer of mice allergic to ginkgo seeds was detected to be 1:6400 by indirect ELISA. Key words:ginkgo seed;allergic protein;sds-page;western-blotting;indirect ELISA 中 图 分 类 号 :Q816 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :1002-6630(2011)07-0016-05 食 物 过 敏 是 指 当 人 体 摄 入 某 种 特 定 的 食 物 后 在 体 内 发 生 的 由 E 型 抗 体 (IgE) 介 导 的 液 体 免 疫 反 应 在 过 敏 反 应 中, 有 90% 以 上 是 由 蛋 类 花 生 乳 类 大 豆 小 麦 树 生 坚 果 ( 杏 板 栗 腰 果 等 ) 贝 类 ( 包 括 甲 [1] 壳 类 和 软 体 动 物 ) 鱼 等 8 类 食 物 引 起 的 一 般 食 物 中 [2] 使 机 体 产 生 过 敏 并 与 IgE 等 抗 体 结 合 的 都 为 蛋 白 质 银 杏 为 裸 子 植 物 门 银 杏 纲 银 杏 植 物 (Gingko bilba L.), 为 一 科 一 属 一 种 的 特 殊 植 物, 是 我 国 特 有 的 古 老 珍 贵 树 [3] 种 之 一 银 杏 种 实 去 掉 肉 质 外 种 皮 后 的 部 分 俗 称 白 果 白 果 富 含 淀 粉 蛋 白 质 和 脂 肪 等 营 养 物 质 以 及 银 [4] 杏 酸 白 果 酚 五 碳 多 糖 胆 固 醇 等 功 能 成 分, 自 古 以 来 被 当 作 养 生 延 年 的 上 品 但 是, 生 食 白 果 或 进 食 太 多, 会 引 起 过 敏 反 应, 临 床 表 现 为 恶 心 呕 吐 腹 痛 腹 泻 烦 躁 不 安 昏 迷 抽 搐 呼 吸 困 难 [5] 瞳 孔 放 大 伴 随 着 对 光 反 应 迟 钝, 乃 至 死 亡 Baron- [6] Ruppert 等 研 究 认 为 导 致 白 果 过 敏 主 要 物 质 是 烷 基 酚 类 [7] 化 合 物,Arenz 等 研 究 认 为 4-O - 甲 基 吡 哆 醇 (4-O - [8] Methylpyridoxine,MPN) 可 能 有 致 敏 作 用 杨 剑 婷 等 通 过 对 白 果 过 敏 的 相 关 数 据 分 析, 认 为 白 果 中 可 能 存 在 其 他 类 型 的 致 敏 物 质 白 果 中 含 有 8.7%~13.4% 的 蛋 白 质, 其 氨 基 酸 组 成 丰 富 合 理, 属 于 优 质 蛋 白 近 年 来, 关 于 白 果 蛋 [9] 白 的 研 究 主 要 集 中 于 白 果 蛋 白 组 成 及 其 功 能 上 Uwe 等 在 1989 年 从 白 果 中 分 离 出 一 种 类 似 豆 球 蛋 白 的 物 质 牛 [10] 卫 宁 等 报 道 了 从 白 果 中 提 取 得 到 的 蛋 白 具 有 抗 菌 作 [11] 用 黄 文 等 应 用 不 同 的 提 取 方 法, 分 离 出 白 果 清 蛋 收 稿 日 期 :2010-06-30 基 金 项 目 : 教 育 部 博 士 点 基 金 项 目 (200802980004) 作 者 简 介 : 李 莹 莹 (1984 ), 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 为 经 济 植 物 资 源 加 工 利 用 及 其 安 全 控 制 E-mail:njliyingying@yahoo.com.cn * 通 信 作 者 : 吴 彩 娥 (1963 ), 女, 教 授, 博 士, 研 究 方 向 为 食 品 活 性 成 分 提 取 及 食 品 安 全 控 制 E-mail:sxwucaie@163.com

基 础 研 究 食 品 科 学 2011, Vol. 32, No. 07 17 白 球 蛋 白 醇 溶 蛋 白 和 碱 溶 蛋 白 等, 发 现 白 果 中 的 蛋 白 质 主 要 以 清 蛋 白 和 球 蛋 白 为 主, 其 中 白 果 清 蛋 白 具 有 抗 氧 化 和 延 缓 衰 老 等 作 用 有 研 究 表 明, 食 物 中 90% [12] 的 过 敏 原 是 蛋 白 质, 郭 红 彦 等 研 究 发 现, 银 杏 枝 条 中 的 32 36kD 贮 藏 蛋 白 具 有 免 疫 原 性 本 课 题 组 在 此 基 础 上, 已 应 用 豚 鼠 为 实 验 动 物, 明 确 了 白 果 蛋 白 具 [13] 有 致 敏 性, 并 建 立 了 白 果 蛋 白 过 敏 反 应 的 小 鼠 模 型, 本 研 究 正 是 基 于 此 模 型, 初 步 鉴 定 白 果 中 的 过 敏 蛋 白, 并 对 其 过 敏 原 性 进 行 分 析, 旨 在 明 确 白 果 中 的 过 敏 蛋 白 及 其 过 敏 原 性, 以 期 为 过 敏 性 疾 病 的 特 异 性 诊 断 以 及 白 果 食 品 的 安 全 开 发 提 供 指 导 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 试 剂 1.1.1 材 料 白 果 为 大 佛 指 品 种, 购 自 江 苏 泰 兴 1.1.2 试 剂 与 仪 器 HRP( 辣 根 过 氧 化 物 酶 ) 标 记 的 羊 抗 鼠 IgE 抗 体 SDS- PAGE 凝 胶 电 泳 所 用 试 剂 美 国 Sigma 公 司 ; 低 分 子 质 量 蛋 白 标 准 葡 萄 糖 牛 血 清 蛋 白 上 海 生 化 试 剂 公 司 ; 邻 苯 二 胺 (OPD) 二 氨 基 联 苯 胺 (DAB) 显 色 试 剂 华 美 公 司 ; 其 他 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 TU-1800PC 紫 外 - 可 见 分 光 光 度 计 北 京 普 析 通 用 仪 器 有 限 责 任 公 司 ;GL-20G- II 型 冷 冻 离 心 机 上 海 安 亭 科 学 仪 器 厂 ;PHS-25 型 ph 计 上 海 智 光 仪 器 仪 表 有 限 公 司 ;DYY-6C 型 电 泳 仪 DYCZ-24D 垂 直 板 电 泳 槽 北 京 六 一 仪 器 厂 ;BIO-RAD 电 泳 自 动 成 像 仪 BIO-RAD 半 干 式 转 印 仪 美 国 BIO-RAD 生 化 科 技 有 限 公 司 ; Thermo354 型 酶 标 仪 96 孔 酶 标 板 Thereto Labsystem 公 司 1.1.3 动 物 小 鼠, 健 康 成 年 昆 明 种 小 白 鼠, 雄 性, 体 质 量 (20 ±2)g, 由 南 京 江 宁 区 青 龙 山 动 物 繁 殖 场 提 供 1.2 方 法 1.2.1 白 果 蛋 白 粗 提 液 的 制 备 取 白 果 50g, 冷 冻 干 燥 后, 研 磨 过 筛,5 倍 体 积 石 油 醚 脱 脂 至 脱 脂 完 全 为 止, 待 石 油 醚 完 全 挥 发 后, 以 1:20 (m/v) 的 比 例 加 入 ph 8.5 0.15mol/L Tris-HCl 溶 液 进 行 蛋 白 提 取,4 下 磁 力 搅 拌 24h,12000r/min 冷 冻 离 心 20min, 上 清 液 通 过 40~80g/100mL 饱 和 度 的 (NH4)2SO4 沉 淀,12000r/min 离 心 10min, 沉 淀 用 ph 7.4 0.01mol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS) 溶 解, 采 用 透 析 袋 用 PBS 进 行 透 析 透 析 完 全 后,4 贮 存 备 用 1.2.2 免 疫 小 鼠 模 型 的 建 立 成 年 小 鼠 分 成 3 组, 每 组 40 只 雄 性 实 验 组 分 为 阴 性 对 照 组 白 果 蛋 白 组 阳 性 对 照 组, 具 体 如 下 : 阴 性 对 照 组 :0.2mol/L ph 7.4 的 Tris-HCl 经 口 灌 胃 致 敏 和 腹 腔 注 射 激 发 ; 白 果 蛋 白 组 :100mg/mL 白 果 蛋 白 经 口 灌 胃 致 敏 200mg/mL 白 果 蛋 白 经 口 灌 胃 激 发 ; 阳 性 对 照 组 :0.50mg/mL 的 卵 白 蛋 白 经 口 灌 胃 致 敏 1.0mg/mL 卵 白 蛋 白 腹 腔 注 射 激 发 每 组 小 鼠 均 在 第 1 7 14 天 致 敏, 第 21 天 激 发 致 敏 激 发 剂 量 均 为 0.3mL/10g 体 质 量 末 次 激 发 后 第 14 天 采 血, 收 集 的 血 清 放 置 在 室 温 中 自 然 凝 固 3~4h 待 血 液 凝 固 血 块 收 缩 后, 用 毛 细 滴 管 吸 取 血 清 于 3000r/min 离 心 15min, 取 上 清, 分 装 后 置 4 冰 箱 中 保 存 备 用 测 定 时, 取 5mL 血 清 与 等 量 的 生 理 盐 水 混 合 后, 缓 慢 加 入 20g/100mL 的 硫 酸 铵 使 有 沉 淀 产 生 充 分 混 合 后,4 放 置 30min; 后 于 3000r/min 离 心 20min, 弃 沉 淀, 上 清 液 中 继 续 加 入 硫 酸 铵 至 浓 度 为 50g/100mL,4 放 置 30min, 经 5000r/min 离 心 30min, 收 集 沉 淀 溶 于 10mL 的 生 理 盐 水, 加 入 硫 酸 铵 至 终 浓 度 为 33g/100mL, 4 放 置 30min, 后 于 3000r/min 离 心 20min, 沉 淀 以 33g/100mL 饱 和 度 的 硫 酸 铵 溶 液 洗 涤 两 次 后, 溶 解 于 l0ml 生 理 盐 水 中, 置 于 透 析 袋 中 在 生 理 盐 水 中 透 析 过 夜, 处 理 好 的 血 清 用 于 IgE 测 定 1.2.3 SDS-PAGE 分 析 调 整 白 果 蛋 白 粗 提 物 质 量 浓 度 为 1mg/mL, 将 白 果 蛋 白 提 取 液 与 样 品 缓 冲 液 按 1:1 的 比 例 混 合,100 煮 沸 5min,12000r/min 离 心 5min, 上 样 20μL,12% 分 离 胶,3.9% 浓 缩 胶 开 始 电 流 10mA, 进 入 分 离 胶 后 为 20mA, 电 泳 时 间 为 2.5~3.5h 考 马 斯 亮 蓝 R-250 染 色, 过 夜, 放 入 脱 色 液 中 脱 色, 直 至 胶 片 背 景 蓝 色 完 全 透 明 状 BIO-RAD 电 泳 自 动 成 像 仪 拍 照, 蛋 白 质 分 子 质 量 运 用 Quality one 软 件 进 行 分 析 1.2.4 Western-Blotting 分 析 使 用 BIO-RAD 半 干 式 转 印 仪 将 SDS-PAGE 凝 胶 中 的 蛋 白 条 带 转 移 至 PVDF( 聚 偏 氟 乙 烯 ) 膜 上 ; 转 移 结 束 后, 0.01mol/L PBS 洗 膜,5min 3 次, 将 膜 用 5g/100mL OVA ( 卵 蛋 白 ) 封 闭 2h;PBST 漂 洗, 加 入 抗 血 清 ( 按 1:100 稀 释 ), 设 阴 性 对 照,4 放 置 12h 以 上 ;PBST 漂 洗,5min 3 次, 加 入 羊 抗 鼠 IgE-HRP( 按 1:500 稀 释 ), 室 温 孵 育 2h, PBST 漂 洗,5min 3 次 加 入 DAB 显 色 液, 显 色 后 用 水 终 止 反 应, 结 果 拍 照 保 存 1.2.5 间 接 ELISA 检 测 抗 血 清 中 sige 用 包 被 缓 冲 液 将 白 果 蛋 白 稀 释 至 一 定 质 量 浓 度, 加 到 96 孔 酶 标 板,100μL/ 孔,4 过 夜 ; 次 日 用 PBST 液 洗 涤 3 次, 拍 干 ; 将 酶 标 板 孔 内 加 入 封 闭 液,200μL/ 孔, 37 恒 温 箱 中 孵 育 2h, 同 上 洗 涤 ; 将 一 定 质 量 浓 度 的

18 抗 血 清 加 入 板 孔,100μL/ 孔,37 恒 温 箱 中 孵 育 2h, 同 上 洗 涤 ; 加 入 羊 抗 鼠 IgE-HRP,100μL/ 孔,37 恒 温 箱 中 孵 育 2h, 同 上 洗 涤 ; 再 加 现 配 制 的 OPD 底 物 显 色 液,37 避 光 显 色 30 min; 加 入 2mol/L 的 H2SO4 终 止 液, 每 孔 50μL, 用 ELISA 酶 标 仪 于 492nm 波 长 处, 以 空 白 对 照 孔 调 零 后 测 定 各 孔 OD 值 结 果 判 定 : 计 算 待 检 测 孔 与 阴 性 对 照 孔 的 OD492nm 之 比 (P/N), 当 P/N 2.1 时, 为 阳 性 ; 当 P/N < 2.1 时, 为 阴 性 1.2.5.1 酶 标 二 抗 浓 度 的 确 定 按 照 ELISA 操 作 步 骤, 用 包 被 缓 冲 液 将 抗 血 清 稀 释 为 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400; 将 羊 抗 鼠 IgE-HRP, 分 别 稀 释 为 1:500 1:1000 1:2000, 依 次 加 入 酶 标 板, 两 者 37 作 用 2h 后, 再 加 底 物 液 作 用 30min, 加 终 止 液, 在 酶 标 仪 上 读 取 OD492nm 值 1.2.5.2 抗 原 最 佳 包 被 质 量 浓 度 和 抗 血 清 最 佳 稀 释 度 的 确 定 采 用 棋 盘 法 将 包 被 抗 原 稀 释 为 5 10 50μg/mL 和 100μg/mL, 加 入 到 酶 标 板 中, 每 行 1 个 稀 释 度,4 过 夜 ; 将 抗 血 清 稀 释 为 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 加 入 酶 标 板 中, 每 一 列 为 1 个 稀 释 度,37 孵 育 2h 其 余 反 应 同 ELISA 操 作 步 骤, 测 定 各 孔 OD492nm 1.2.6 抗 血 清 sige 效 价 的 测 定 将 抗 血 清 按 照 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 的 比 例 稀 释, 采 用 间 接 ELISA 法 测 定 其 效 价 以 阳 性 血 清 和 阴 性 血 清 的 OD492nm 之 比 (P/N) 大 于 2.1 的 血 清 最 高 稀 释 倍 数 作 为 抗 体 的 效 价 1.2.7 蛋 白 质 量 浓 度 的 测 定 [14] 应 用 Bradford 法, 以 牛 血 清 蛋 白 为 标 准 蛋 白, 标 准 曲 线 方 程 为 Y=8.2134X+0.0214(R 2 =0.9985) 1.3 统 计 学 分 析 数 据 采 用 DPS(version 3.01) 统 计 软 件 进 行 统 计 分 析, 设 置 显 著 水 平 分 别 为 P < 0.05 及 P < 0.01 所 有 实 验 设 3 次 重 复, 结 果 均 为 平 均 值, 以 平 均 值 ± 标 准 误 表 示, 并 进 行 方 差 分 析 和 Duncan, s 检 验 2 结 果 与 分 析 2.1 白 果 蛋 白 粗 提 液 SDS-PAGE 电 泳 分 析 对 白 果 蛋 白 提 取 液 进 行 SDS-PAGE 凝 胶 电 泳, 如 图 1 所 示 白 果 的 蛋 白 质 条 带 主 要 有 13 条, 其 分 子 质 量 介 于 10~100kD 之 间, 白 果 蛋 白 分 子 质 量 最 大 为 99kD, 最 小 的 为 13kD, 其 中 含 量 高 的 有 6 条, 分 子 质 量 分 别 为 15 21 32 36 48 69kD, 其 中 以 21kD 和 32kD 含 量 最 多 白 果 的 蛋 白 条 带 主 要 集 中 在 31~100kD, 占 蛋 白 总 条 数 的 77%, 其 余 蛋 白 条 带 集 中 在 13~22kD 范 围 内, 可 见 白 果 蛋 白 多 以 大 分 子 的 结 构 存 在, 蛋 白 质 带 表 现 出 了 良 好 的 多 态 性 白 果 中 蛋 白 种 类 丰 富, 主 要 存 在 分 子 质 量 为 21kD 和 32kD 的 两 种 蛋 白, 以 及 十 余 种 含 量 略 低 的 其 他 蛋 白, 大 分 子 蛋 白 较 多 97.0kD 66.2kD 43.0kD 31.0kD 20.1kD 14.4kD M 1 2 M. 蛋 白 质 分 子 质 量 标 准 ;1 2. 白 果 蛋 白 图 1 白 果 蛋 白 提 取 液 的 SDS-PAGE 结 果 Fig.1 SDS-PAGE of ginkgo seed proteins 2.2 Western-Blotting 分 析 鉴 定 白 果 的 主 要 过 敏 蛋 白 Western-Blotting 是 将 经 过 SDS-PAGE 分 离 的 蛋 白 质 样 品, 转 移 到 固 相 载 体 (PVDF 膜 ) 上, 以 固 相 载 体 上 的 蛋 白 质 作 为 抗 原, 与 对 应 的 抗 体 起 免 疫 反 应, 再 与 酶 标 记 的 第 二 抗 体 起 反 应, 经 过 底 物 显 色 以 检 测 电 泳 分 离 的 特 异 性 的 蛋 白 成 分 将 白 果 蛋 白 进 行 Western-Blotting 分 析, 结 果 如 图 2 所 示 97.0kD 66.2kD 43.0kD 31.0kD 20.1kD 14.4kD M 1 2 过 敏 小 鼠 血 清 经 免 疫 印 迹 检 测 均 有 阳 性 区 带 产 生, 而 阴 性 对 照 血 清 未 显 示 特 异 性 IgE 结 合 区 带 白 果 蛋 白 组 分 中 可 与 过 敏 小 鼠 抗 血 清 中 的 IgE 特 异 性 结 合 的 主 要 有 3 种 蛋 白 组 分, 其 分 子 质 量 分 别 为 21 32 36kD, 可 初 步 确 定 其 为 白 果 中 主 要 的 过 敏 原 蛋 白 据 报 道, 大 豆 中 的 3 种 主 要 致 敏 原 是 Glym Bd 30k Glym Bd 28k 和 β- 伴 大 豆 球 蛋 白, 其 分 子 质 量 分 别 为 30 28kD, 而 大 米 中 已 分 离 得 到 的 6 种 过 敏 蛋 白, 分 子 质 量 分 别 为 14 15 16 26 33kD 和 56kD [15], 可 见, 白 果 过 敏 蛋 白 与 其 他 核 果 类 过 敏 原 中 存 在 的 主 要 过 敏 原 蛋 白 在 分 子 质 量 上 具 有 一 定 的 相 似 性 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 M. 蛋 白 质 分 子 质 量 标 准 ;1. 白 果 蛋 白 免 疫 印 迹 阳 性 条 带 ;2. 阴 性 对 照 图 2 白 果 蛋 白 的 Western-Blotting 结 果 Fig.2 Western-Blotting of ginkgo seed proteins

基 础 研 究 食 品 科 学 2011, Vol. 32, No. 07 19 2.3 间 接 ELISA 检 测 抗 血 清 中 sige 2.3.1 酶 标 二 抗 浓 度 的 确 定 分 别 将 羊 抗 鼠 IgE-HRP 稀 释 为 1:500 1:1000 和 1:2000, 在 不 同 的 抗 血 清 稀 释 度 下 测 得 的 OD492nm 如 图 3 所 示 OD492nm 1.2 0.9 0.6 0.3 0.0 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 抗 血 清 稀 释 度 1:500 1:1000 1:2000 图 3 不 同 血 清 稀 释 度 下 HRP- 羊 抗 鼠 IgE 稀 释 度 的 OD492nm Fig.3 Plot of OD492nm versus different dilutions of antiserum with different dilutions of goat anti-mouse IgE-HRP 随 着 羊 抗 鼠 IgE-HRP 稀 释 度 增 大, 各 孔 OD 值 逐 渐 减 小 当 羊 抗 鼠 IgE-HRP 稀 释 至 1:2000 时,OD 值 较 稀 释 度 1:500 和 1:1000 显 著 降 低 (P > 0.05) 但 羊 抗 鼠 IgE- HRP 稀 释 为 1:500 和 1:1000,OD492nm 值 较 接 近 一 般 情 况 下,ELISA 检 测 仪 在 检 测 OD 值 时,OD 值 为 1.0 左 [16] 右 时 误 差 最 小, 反 应 最 灵 敏 羊 抗 鼠 IgE-HRP 在 稀 释 度 1:1000, 血 清 稀 释 度 为 1:400 时,OD492nm 为 0.992, 接 近 1.0, 另 外 从 节 约 成 本 角 度 考 虑, 本 实 验 确 定 酶 标 二 抗 的 最 佳 工 作 稀 释 度 为 1:1000 2.3.2 抗 原 最 佳 包 被 质 量 浓 度 和 抗 血 清 最 佳 稀 释 度 的 确 定 通 过 以 不 同 质 量 浓 度 的 白 果 蛋 白 包 被 酶 标 板, 然 后 加 入 不 同 稀 释 度 的 抗 血 清, 再 通 过 酶 标 二 抗 的 作 用, 不 同 质 量 浓 度 的 过 敏 原 与 不 同 稀 释 度 的 抗 血 清 作 用 的 OD492nm 值, 结 果 见 图 4 随 着 抗 血 清 稀 释 度 的 增 加, 不 同 抗 原 包 被 质 量 浓 度 下 测 得 的 OD 值 逐 渐 减 小, 当 包 被 的 白 果 蛋 白 质 量 浓 度 为 50μg/mL 和 100μg/mL 时 测 得 的 OD 值 较 高, 当 包 被 的 白 果 蛋 白 质 量 浓 度 为 50μg/mL, 血 清 稀 释 度 为 1:500 时,OD492nm 为 0.997, 接 近 1.0, 且 此 时 阳 性 血 清 和 阴 性 血 清 的 OD492nm 的 比 值 P/N 为 8.982, 其 值 远 远 大 于 2.1, 因 此 确 定 抗 原 的 最 佳 包 被 质 量 浓 度 为 50μg/mL, 包 被 是 ELISA 实 验 中 关 键 的 一 步, 如 果 质 量 浓 度 过 低, 包 被 液 中 的 蛋 白 质 不 能 完 全 覆 盖 固 相 载 体 表 面, 随 后 加 入 的 特 异 性 抗 体 和 酶 标 二 抗 就 有 可 能 直 接 被 吸 附 到 固 相 载 体 上, 最 后 产 生 非 特 异 性 显 色 而 使 检 [17] 测 结 果 偏 高 ; 质 量 浓 度 过 高, 蛋 白 质 分 子 的 相 互 作 用 影 响 聚 苯 乙 烯 与 蛋 白 质 之 间 的 吸 附, 以 至 在 随 后 的 抗 原 抗 体 反 应 洗 涤 等 步 骤 中, 部 分 抗 原 或 与 抗 体 结 合 释 放 到 洗 涤 液 中 被 弃 去, 或 直 接 释 放 到 洗 涤 液 中 造 成 抗 原 [18] 的 浪 费, 本 实 验 确 定 抗 原 的 最 佳 包 被 质 量 浓 度 为 50μg/mL, 取 得 了 较 好 的 包 被 效 果 OD492nm 1.2 0.9 0.6 0.3 0.0 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:64001:12800 抗 血 清 稀 释 度 100μg/mL 50μg/mL 10μg/mL 5μg/mL 阴 性 对 照 图 4 白 果 蛋 白 不 同 包 被 质 量 浓 度 时 不 同 稀 释 度 血 清 的 OD492nm Fig.4 Plot pf OD492nm versus different dilutions of antiserum with different coating concentrations of ginkgo seed proteins 2.4 抗 血 清 sige 效 价 的 测 定 本 实 验 采 用 间 接 ELISA 法 测 定 经 白 果 蛋 白 免 疫 后 的 过 敏 小 鼠 血 清 中 sige 的 效 价, 以 阳 性 血 清 和 阴 性 血 清 的 OD492nm 之 比 (P/N) 大 于 2.1 的 血 清 最 高 稀 释 倍 数 作 为 抗 体 的 效 价, 结 果 见 表 1 表 1 抗 血 清 IgE 效 价 测 定 结 果 Table 1 Determination results of mouse serum IgE titer 序 号 稀 释 比 例 OD492nm P/N 阳 / 阴 性 反 应 1 1:200 0.981 ± 0.009 10.113 + 2 1:400 0.998 ± 0.007 10.289 + 3 1:800 0.894 ± 0.013 9.216 + 4 1:1600 0.793 ± 0.011 8.175 + 5 1:3200 0.537 ± 0.007 5.536 + 6 1:6400 0.289 ± 0.009 2.979 + 7 1:12800 0.157 ± 0.014 1.619-8 阴 性 对 照 0.097 ± 0.006 - 将 抗 血 清 按 照 一 定 的 比 例 稀 释 后, 除 抗 血 清 稀 释 度 为 1:12800 外, 其 余 稀 释 度 中 各 反 应 皆 为 阳 性 反 应, 阳 性 血 清 和 阴 性 血 清 的 OD492nm 之 比 P/N 都 大 于 2.1, 因 此 确 定 抗 血 清 中 sige 的 效 价 为 1:6400 本 实 验 测 得 的 sige [17] 的 效 价 较 报 道 的 其 他 过 敏 原 效 价 较 低, 分 析 原 因, 可 能 是 因 为 酶 联 免 疫 是 很 强 的 非 特 异 性 吸 附 反 应, 而 制 得 的 多 克 隆 抗 体 只 经 过 硫 酸 铵 沉 淀 未 经 过 层 析 法 进 一 步 纯 化, 使 得 制 得 的 多 克 隆 抗 体 中 除 了 一 些 特 异 性 的 抗 体 以 外, 还 有 存 在 某 些 杂 质 和 其 他 抗 体 成 分, 这 些 物 质 的 [19] 存 在 一 定 程 度 上 降 低 了 特 异 性 抗 体 的 灵 敏 性 目 前, 测 定 抗 体 效 价 的 方 法 很 多, 结 果 比 较 粗 放, 采 用 琼 脂 扩 散 的 方 法 比 较 多, 但 由 于 影 响 因 素 比 [20] 较 多, 而 且 敏 感 度 比 较 低 间 接 酶 联 免 疫 的 方 法 克 服 了 这 些 缺 点, 而 且 操 作 简 便 由 于 多 克 隆 抗 体 存 在 大 量 的 抗 原 决 定 簇, 很 容 易 和 抗 体 进 行 结 合, 特 别 适 合 于 用 酶 联 免 疫 的 方 法 检 测, 而 且 在 检 测 过 程 中 经 常 采 用 酶 联 免 疫 的 方 法, 能 够 对 以 后 检 测 过 程 中 抗 体 的 使 用 提 供 直 接 的 指 导

20 3 结 论 3.1 通 过 Tris-HCl 法 提 取 白 果 蛋 白, 并 采 用 SDS-PAGE 分 析 白 果 蛋 白 的 分 子 组 成 及 其 分 子 质 量, 结 果 表 明, 白 果 的 蛋 白 质 条 带 主 要 有 13 条, 其 中 以 21kD 和 32kD 含 量 最 多 3.2 通 过 Western-Blotting 分 析 鉴 定 白 果 的 主 要 过 敏 原, 结 果 初 步 表 明 白 果 中 主 要 存 在 3 种 蛋 白 过 敏 原, 其 分 子 质 量 分 别 为 21 32 36kD 3.3 采 用 间 接 ELISA 法 测 定 经 白 果 蛋 白 免 疫 后 的 过 敏 小 鼠 血 清 中 sige 的 效 价, 结 果 表 明 当 酶 标 二 抗 浓 度 为 1:1000, 白 果 蛋 白 包 被 质 量 浓 度 为 50μg/mL 时, 测 得 过 敏 小 鼠 血 清 中 sige 的 效 价 为 1:6400 参 考 文 献 : [1] HEIMO B, CLARE M. Plant food allergens:structural and functional aspects of allergenicity[j]. Biotechnology Advances, 2005, 23: 395-399. [2] 聂 凌 鸿. 食 物 过 敏 原 研 究 进 展 [J]. 生 命 的 化 学, 2002, 22(5): 474-477. [3] 曹 福 亮. 中 国 银 杏 志 [M]. 北 京 : 中 国 林 业 出 版 社, 2007. [4] 钱 丙 炎. 银 杏 的 功 效 [M]. 邳 州 : 邳 州 市 银 杏 科 学 研 究 所, 2008. [5] van BEEK T A. Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts [J]. Journal of Chromatography A, 2002, 967: 21-55. [6] BARON-RUPPERT G, LUEPKE N P. Evidence for toxic effects of alkylphenols from Ginkgo biloba in the hen, s egg test[j]. Phytomedicine, 2001, 8, 133-138. [7] ARENZ A, KLEIN M, FIEHE K, et al. Occurrence of neurotoxic 4'-Omethylpyridoxine in Ginkgo biloba leaves, ginkgo medications and Japanese ginkgo food[j]. Planta Med, 1996, 62: 548-551. [8] 杨 剑 婷, 吴 彩 娥. 白 果 致 过 敏 成 分 及 其 致 敏 机 理 研 究 进 展 [J]. 食 品 科 技, 2009, 34(6): 282-286. [9] UWE J, HEIKE B. Legumin-like proteins in gymnosperms[j]. Phytochemistry, 1989, 28(5): 1389-1394. [10] 牛 卫 宁, 郭 霭 光. 银 杏 种 仁 中 抗 菌 蛋 白 的 纯 化 及 性 质 [J]. 西 北 植 物 学 报, 2003, 23(9): 1545-1549. [11] 黄 文, 谢 笔 钧, 王 益, 等. 白 果 蛋 白 的 分 离 纯 化 理 化 特 性 及 其 抗 氧 化 活 性 研 究 [J]. 中 国 农 业 科 学, 2004, 37(10): 1537-1545. [12] 郭 红 彦. 银 杏 营 养 贮 藏 蛋 白 质 的 分 离 鉴 定 及 特 性 研 究 [D]. 南 京 : 南 京 林 业 大 学, 2007. [13] 杨 剑 婷, 吴 彩 娥, 李 莹 莹, 等. 白 果 蛋 白 过 敏 动 物 模 型 的 试 验 研 究 [J]. 中 国 农 业 科 学, 2010, 43(17): 3616-3623. [14] BRADFORD M M. Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein:dye binding [J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254. [15] 卢 大 用. 食 品 中 的 蛋 白 过 敏 原 及 其 检 测 [J]. 食 品 研 究 与 开 发, 2000, 21(2): 49-50. [16] 刘 合 义, 孙 留 霞, 王 进 轶, 等. 牛 冠 状 病 毒 重 组 N 蛋 白 间 接 ELISA 检 测 方 法 的 建 立 [J]. 中 国 预 防 兽 医 学 报, 2009, 31(8): 618-620. [17] 李 金 明. 临 床 酶 免 测 定 技 术 [M]. 北 京 : 人 民 军 医 出 版 社, 2005. [18] 张 也, 刘 以 祥. 酶 联 免 疫 技 术 与 食 品 安 全 快 速 检 测 [J]. 食 品 科 学, 2003, 24(8): 200-203. [19] 李 文 敏. 酶 联 免 疫 吸 附 反 应 的 技 术 进 展 及 应 用 [J]. 中 国 动 物 检 疫, 2003, 6(4): 65-69. [20] 朱 立 平, 陈 学 清. 免 疫 学 常 用 实 验 方 法 [M]. 北 京 : 人 民 军 医 出 版 社, 2000.