神经所光学成像实验室操作规范

神 经 所 光 学 成 像 实 验 室 手 册 目 录 实 验 室 简 介... 1 提 供 的 服 务 和 技 术... 2 仪 器 使 用 规 章 制 度... 3 仪 器 使 用 收 费 标 准... 3 技 术 员 操 作 规 范... 5 光 学 成 像 实 验 注 意 事 项... 14 光 学 成 像 实 验 要 点... 19 附 录 : 显 微 镜 配 置 和 参 数... 23 实 验 室 简 介 神 经 所 光 学 成 像 实 验 室 成 立 于 2002 年, 是 中 科 院 上 海 生 命 科 学 院 神 经 科 学 研 究 所 的 光 学 显 微 镜 公 共 实 验 平 台, 现 有 专 业 技 术 人 员 5 名, 由 胡 谦 博 士 负 责 管 理 光 学 成 像 实 验 室 分 为 两 组 第 一 组 位 于 新 实 验 大 楼 一 楼, 由 马 倩 茹 ( 组 长 ) 和 杨 莹 负 责, 管 理 Nikon Ti 活 细 胞 工 作 站 (A0107) Prairie 活 体 双 光 子 显 微 镜 (A0119) Nikon Ti- A1R 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0119) Nikon Fn1-A1R 正 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0119) Olympus Fv-10i( 水 式 ) 台 式 共 聚 焦 显 微 镜 (A0119) 等 5 台 设 备 第 二 组 位 于 新 实 验 大 楼 四 楼, 由 向 丹 ( 组 长 ) 和 陈 旭 鑫 负 责, 管 理 Nikon E80i 正 置 荧 光 显 微 镜 (A0436) Neurolucida 正 置 荧 光 显 微 镜 (A0436) Nikon TE2000e 倒 置 荧 光 显 微 镜 (A0436) Zeiss LSM 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0434) Zeiss LSM 正 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0434) Nikon Ti-A1 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0434) Olympus FV1000 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0438) Olympus Fv-10i( 油 式 ) 台 式 共 聚 焦 显 微 镜 (A0438) 等 8 台 设 备 实 验 室 还 配 备 有 EPC -10 膜 片 钳 放 大 器 AMPI Master-8 可 编 程 刺 激 器 等 电 生 理 研 究 专 用 设 备 1

房 间 号 仪 器 设 备 仪 器 管 理 负 责 人 卫 生 负 责 人 A0434 A0436 A0438 A0119 Nikon Ti-A1 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 Zeiss LSM510 正 置 共 聚 焦 显 微 镜 Zeiss LSM510 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 Neurolucida 正 置 荧 光 显 微 镜 Nikon 80i 正 置 荧 光 显 微 镜 Nikon TE2000e 倒 置 荧 光 显 微 镜 Olympus FV-1000 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 Olympus FV-10i( 油 式 ) 台 式 共 聚 焦 显 微 镜 Nikon Ti-A1R 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 Nikon FN1-A1R 正 置 共 聚 焦 显 微 镜 Olympus FV-10i( 水 式 ) 台 式 共 聚 焦 显 微 镜 Prairie 活 体 双 光 子 显 微 镜 向 丹 陈 旭 鑫 向 丹 陈 旭 鑫 向 丹 陈 旭 鑫 马 倩 茹 杨 莹 向 丹 向 丹 陈 旭 鑫 杨 莹 (CO2 细 胞 培 养 箱 由 马 倩 茹 负 责 维 护 ) A0107 Nikon Ti 活 细 胞 工 作 站 马 倩 茹 杨 莹 马 倩 茹 实 验 室 开 放 时 间 : 每 周 开 放 80 小 时, 周 一 至 周 五 9:00 AM - 10:00 PM, 周 六 周 日 2:00 PM - 10:00 PM 神 经 所 光 学 成 像 实 验 室 为 国 内 技 术 较 先 进 仪 器 使 用 率 较 高 的 公 共 实 验 室 提 供 的 服 务 和 技 术 1 多 标 记 固 定 标 本 和 活 体 标 本 的 高 分 辨 率 荧 光 成 像, 可 同 时 采 集 明 场 相 差 和 微 分 干 涉 图 像 ( 标 本 厚 度 可 达 100 微 米 ) 2 活 体 和 固 定 标 本 的 光 切 片 成 像 和 三 维 重 建 ( 光 切 片 最 薄 可 达 0.1 微 米 ) 3 脑 片 和 其 它 厚 组 织 标 本 的 双 光 子 荧 光 成 像 ( 标 本 厚 度 可 达 400 微 米 ) 4 活 细 胞 荧 光 信 号 动 态 变 化 的 时 间 序 列 成 像 和 分 析 5 快 反 应 信 号 高 时 间 分 辨 率 成 像 和 分 析 6 细 胞 内 重 要 离 子 的 浓 度 测 量 ( 包 括 : 钙 钠 钾 镁 离 子 细 胞 膜 电 位 和 ph) 7 使 用 笼 锁 分 子 进 行 实 验 8 荧 光 共 振 能 量 转 移 (FRET) 实 验 FRET 技 术 可 以 用 来 测 量 分 子 间 的 相 互 作 用 9 光 漂 白 恢 复 (FRAP) 实 验 FRAP 是 指 将 细 胞 某 一 区 域 内 的 荧 光 标 记 分 子 用 激 光 照 射 漂 白, 然 后 观 察 该 区 域 的 荧 光 恢 复 ( 经 周 围 荧 光 分 子 扩 散 ) FRAP 技 术 可 以 用 来 测 量 分 子 的 运 动 和 扩 散 10 光 学 信 号 和 电 信 号 同 时 测 量 和 分 析 11 细 胞 和 亚 细 胞 结 构 定 量 分 析, 包 括 : 结 构 属 性 ( 如 : 形 状 大 小 ) 和 分 子 属 性 ( 如 : 荧 光 信 号 强 弱 ) 12 TIRF 实 验 TIRF 是 利 用 全 内 反 射 原 理 加 强 荧 光 成 像 轴 向 解 析 度 的 一 种 光 学 成 像 技 术, 可 以 用 来 观 察 与 细 胞 膜 相 关 的 过 程, 如 : 如 细 胞 粘 附 分 子 运 输 胞 吐 ( 神 经 递 质 的 释 放 和 吸 收 ) 和 内 吞 等 过 程 2

仪 器 使 用 规 章 制 度 本 实 验 室 所 有 设 备 都 按 仪 器 设 备 所 级 中 心 的 要 求 纳 入 中 科 院 仪 器 设 备 共 享 管 理 平 台, 提 供 仪 器 共 享 和 网 上 实 验 预 约 ( http://caslims.cas.cn ) ( 在 填 写 网 上 预 约 单 检 验 业 务 委 托 书 时, 表 格 最 后 一 行 的 右 边 委 托 人 员 必 须 填 写 实 验 者 本 人 的 姓 名 联 系 邮 件 为 实 验 者 本 人 的 邮 箱 地 址 预 约 的 时 间 仅 限 本 人 使 用 ) 实 验 室 仪 器 预 约 :(1) 使 用 活 标 本 做 实 验 可 以 提 前 2 周 预 约 设 备 ;(2) 使 用 固 定 标 本 做 实 验 只 可 以 提 前 1 周 预 约 设 备 ;(3) 每 周 每 台 设 备, 每 人 最 多 可 以 预 约 3 次 实 验 ;(4) 有 特 殊 实 验 需 求 或 需 要 预 约 更 多 实 验 的 同 学 可 以 向 平 台 工 作 人 员 提 出 申 请, 我 们 将 尽 量 满 足 大 家 的 实 验 需 求 取 消 预 约 的 实 验 : 如 需 取 消 实 验 或 更 改 已 预 约 的 实 验, 请 提 前 用 e-mail 发 all1 all2 all3 通 告 并 说 明 取 消 或 更 改 实 验 的 原 因 未 提 前 通 告 而 不 来 做 实 验 的 同 学 将 被 取 消 继 续 使 用 光 学 成 像 实 验 室 仪 器 的 资 格 ( 如 要 恢 复 资 格, 请 向 仪 器 管 理 委 员 会 提 出 书 面 申 请, 经 同 意 后 才 能 恢 复 仪 器 使 用 资 格 ) 提 前 1 天 以 上 在 设 备 共 享 管 理 平 台 上 申 请 撤 销 实 验 并 发 e-mail 通 告 者, 可 以 不 收 取 仪 器 使 用 费, 否 则 将 按 预 约 时 间 全 额 收 取 仪 器 使 用 费 实 验 开 始 和 结 束 : (1) 实 验 者 必 须 经 过 实 验 室 工 作 人 员 培 训 掌 握 仪 器 的 操 作 方 法 后, 才 能 独 立 操 作 仪 器 做 实 验 (2) 实 验 开 始 前 请 先 刷 园 区 卡 记 录 开 始 时 间, 并 在 征 得 实 验 室 工 作 人 员 同 意 后 再 开 始 实 验 (3) 未 经 许 可 不 得 擅 自 更 改 显 微 镜 和 工 作 电 脑 的 软 硬 件 设 置 (4) 遇 到 仪 器 故 障 或 对 实 验 数 据 不 满 意, 请 立 刻 告 知 实 验 室 工 作 人 员, 以 求 及 时 解 决 严 禁 擅 自 处 理 或 隐 瞒 仪 器 故 障 (5) 实 验 结 束 后 请 及 时 刷 园 区 卡 记 录 结 束 时 间, 并 立 即 通 知 实 验 室 工 作 人 员 (6) 请 清 理 自 带 设 备 ( 如 : 灌 流 系 统 加 热 系 统 电 生 理 设 备 等 ) 和 实 验 过 程 中 产 生 的 垃 圾 (7) 不 要 清 理 显 微 镜 物 镜 和 关 闭 仪 器 的 软 件 和 硬 件 显 微 镜 清 理 和 仪 器 关 闭 等 工 作 都 应 由 实 验 室 工 作 人 员 来 完 成 实 验 数 据 拷 贝 : 数 据 应 先 上 传 到 数 据 服 务 器, 然 后 从 数 据 服 务 器 复 制 到 实 验 者 自 己 的 存 储 设 备 (USB 盘 ) 严 禁 使 用 仪 器 工 作 电 脑 的 软 驱 光 驱 光 驱 刻 录 机 USB 外 插 设 备 等 拷 贝 数 据 因 为 数 据 服 务 器 的 存 储 空 间 有 限, 我 们 会 定 期 删 除 多 余 的 数 据 实 验 者 应 及 时 备 份 自 己 的 实 验 数 据, 实 验 数 据 的 安 全 由 实 验 者 本 人 负 责!!! 仪 器 使 用 收 费 标 准 本 实 验 室 仪 器 按 使 用 时 间 进 行 收 费, 收 费 标 准 ( 元 / 小 时 ) 如 下 : 设 备 名 称 神 经 所 内 中 科 院 内 中 科 院 外 Neurolucida NIKON TE-2000e NIKON-E80i 荧 光 显 微 镜 25 200 400 NIKON Ti 活 细 胞 工 作 站 50 300 600 3

ZEISS LSM510 共 聚 焦 显 微 镜 25 300 600 NIKON Ti-A1 Ti-A1R Fn1-A1R 共 聚 焦 显 微 镜 50 300 600 OLYMPUS FV-1000 共 聚 焦 显 微 镜 50 300 600 OLYMPUS FV10i 台 式 共 聚 焦 50 300 600 Prairie 活 体 双 光 子 显 微 镜 50 400 800 ( 注 : 请 预 约 者 按 照 预 约 时 间 前 来 实 验, 因 突 发 情 况 需 要 延 迟 实 验 者 请 及 时 与 工 作 人 员 联 系, 以 免 仪 器 空 开 造 成 不 必 要 的 浪 费 仪 器 使 用 时 间 少 于 预 约 时 间 的 按 预 约 时 间 收 费, 仪 器 使 用 时 间 超 过 预 约 时 间 的 按 实 际 使 用 时 间 收 费 ) 4

技 术 员 操 作 规 范 1. 不 要 迟 到 早 退, 上 班 时 间 ( 除 中 午 12:00-13:00 和 下 午 17:00-18:00 吃 饭 时 间 ) 不 要 无 故 离 开 实 验 室 2. 保 持 实 验 室 清 洁 根 据 各 自 的 卫 生 负 责 区 域 每 两 天 清 理 实 验 室 一 次 ( 包 括 仪 器 电 脑 实 验 台 地 面 墙 壁 等 等 ) 为 防 止 灰 尘 飞 扬, 应 该 用 湿 抹 布 和 湿 拖 把 清 理, 不 能 用 干 抹 布 和 扫 帚 清 理 要 经 常 检 查 和 保 持 显 微 镜 系 统 清 洁, 如 : 聚 光 镜 物 镜 目 镜 载 物 台 和 仪 器 表 面 等 3. 要 经 常 注 意 实 验 室 的 温 度, 检 查 实 验 室 空 调 是 否 处 于 正 常 工 作 状 态 实 验 完 毕 离 开 实 验 室 前, 要 关 好 门 窗 水 电, 确 保 仪 器 安 全 4. 时 刻 注 意 停 电 通 知, 根 据 停 电 时 间 通 知 学 生 安 排 好 实 验 停 电 复 电 后, 应 注 意 实 验 室 空 调 是 否 处 于 工 作 状 态, 及 时 打 开 实 验 室 空 调 5. 实 验 室 内 空 调 水 电 维 修 时, 应 用 塑 料 台 布 将 仪 器 盖 上, 以 防 维 修 时 水 漏 到 仪 器 上 6. 注 意 防 震 台 是 否 有 气 压, 没 气 时 要 及 时 更 换 气 瓶 防 震 台 一 律 使 用 空 气 7. 每 周 检 查 一 次 计 算 机 容 量, 发 现 硬 盘 容 量 小 于 5 G 时, 应 检 查 各 个 实 验 者 的 数 据 量 和 时 间, 将 超 过 一 周 的 数 据 删 除 8. 实 验 结 束 后 应 及 时 填 写 仪 器 使 用 记 录 每 月 由 指 定 的 技 术 员 ( 马 倩 茹 和 陈 旭 鑫 ) 统 计 仪 器 使 用 量 和 课 题 组 应 收 费 用, 每 月 初 将 上 个 月 的 统 计 报 表 发 给 各 组 PI 和 管 家 9. 如 果 同 时 有 多 个 学 生 需 要 带 实 验 时, 应 按 照 先 来 后 到 先 简 后 繁 先 熟 练 后 生 疏 的 次 序 协 助 学 生 实 验 10. 实 验 开 始 时, 应 帮 助 学 生 找 到 标 本 焦 平 面 设 置 好 仪 器 参 数 ( 激 光 强 度 Pinhole 大 小 PMT 增 益 滤 光 片 聚 光 镜 DIC 相 差 等 ) 并 采 集 一 张 符 合 标 准 的 图 像, 然 后 再 让 学 生 独 立 实 验 在 设 置 仪 器 参 数 的 时 候, 要 边 讲 解 边 设 置 11. 在 设 置 多 荧 光 标 记 标 本 的 实 验 参 数 时, 要 一 个 通 道 一 个 通 道 按 次 序 设 置 (NIKON 的 共 聚 焦 显 微 镜 可 使 用 Preview 和 Capture 分 别 保 存 预 览 参 数 和 正 式 采 图 参 数 ) 12. 对 于 首 次 实 验 或 者 不 能 熟 练 使 用 显 微 镜 的 学 生, 应 首 先 讲 解 仪 器 的 工 作 原 理 和 仪 器 的 操 作 步 骤, 然 后 按 先 做 示 范 边 讲 解 边 示 范 边 讲 解 边 让 学 生 自 己 动 手 采 集 图 像 的 步 骤, 逐 步 教 会 学 生 掌 握 仪 器 操 作 13. 在 示 范 和 操 作 显 微 镜 时 要 注 意 以 下 仪 器 操 作 要 点 :(1) 检 查 物 镜 是 否 清 洁 检 查 显 微 镜 镜 油 有 没 有 结 晶 或 浑 浊 物 ;(2) 物 镜 的 盖 玻 片 厚 度 校 正 是 否 设 置 正 确 ;(3) 明 视 野 光 路 是 否 清 洁 无 灰 尘 ;(4) 物 镜 的 类 型 是 否 选 择 正 确 ( 首 选 高 数 值 孔 径 Plan-APO 物 镜 用 水 镜 来 观 察 活 标 本 等 );(5) 共 聚 焦 针 孔 设 置 是 否 正 确 ( 一 般 选 1 Airy Unit); (6) 合 适 的 扫 描 速 度 和 平 均 次 数 ;(7) 合 适 的 采 图 分 辨 率 ( 根 据 Nyquist 采 样 定 律, 5

采 图 分 辨 率 应 最 起 码 为 所 需 观 察 的 最 小 物 体 空 间 尺 度 率 的 1/2-1/3);( 8) 荧 光 定 量 分 析 实 验 要 注 意 图 像 亮 度 不 要 过 亮 PMT 的 Offset 不 要 过 高, 应 使 用 Hi-Lo 调 色 板 或 Line-Profile 来 检 查 图 像 亮 度 ;(9) 更 换 标 本 和 物 镜 时 要 先 把 物 镜 降 到 最 低 位 置 ; (10) 聚 焦 时 要 注 意 样 品 和 物 镜 的 距 离 ( 可 参 考 显 微 镜 前 方 小 显 示 屏 中 物 镜 的 Z 轴 位 置 读 数 ), 避 免 物 镜 升 得 过 高 撞 及 样 品 损 坏 物 镜 ;( 11) 观 察 或 采 集 载 玻 片 边 缘 的 标 本 时 要 注 意 物 镜 离 样 品 架 之 间 的 距 离, 避 免 物 镜 顶 到 样 品 架 造 成 设 备 损 坏 14. 在 学 生 实 验 过 程 中, 应 经 常 检 查 采 图 参 数 是 否 正 确 仪 器 工 作 状 态 是 否 正 常 学 生 的 操 作 是 否 正 确 及 时 关 闭 不 使 用 的 激 光 器, 及 时 收 纳 不 需 要 使 用 的 物 镜 15. 使 用 恒 温 加 热 台 时 要 注 意 : 打 开 盖 子 和 合 上 盖 子 时 不 要 朝 一 个 方 向 缠 绕 电 线 通 气 时 要 注 意 水 槽 中 的 水 不 能 溢 出 使 用 3-4 小 时 后, 应 向 水 槽 中 补 足 超 纯 水 16. 使 用 灌 流 系 统 的 实 验 要 注 意 : 要 在 物 镜 或 聚 光 镜 上 加 一 层 保 鲜 膜, 检 查 负 压 泵 是 否 正 常 工 作, 防 止 实 验 溶 液 溢 出 在 仪 器 设 备 上 17. 在 实 验 过 程 中 遇 到 仪 器 故 障 或 问 题 应 及 时 告 知 实 验 室 主 任 在 实 验 室 主 任 帮 助 操 作 仪 器 做 操 作 或 实 验 演 示 时, 要 认 真 听 讲 18. 实 验 完 毕 及 时 关 闭 和 清 理 设 备 :( 1) 仪 器 恢 复 到 初 始 状 态 : 将 荧 光 光 路 上 的 ND 滤 片 全 部 拉 出 将 光 路 切 换 到 目 视 观 察 位 置 载 物 台 位 置 复 位 ZDC 或 者 PFS 置 于 OUT 位 置 倒 置 ( 正 置 ) 显 微 镜 的 物 镜 放 置 到 Z 轴 最 低 ( 高 ) 位 置 按 每 台 仪 器 的 关 机 步 骤 关 闭 仪 器 (2) 及 时 清 洁 物 镜, 每 台 显 微 镜 只 留 一 个 空 气 物 镜, 将 不 使 用 的 物 镜 清 洁 后 装 入 镜 盒 收 纳 19. 使 用 气 体 的 实 验 ( 活 细 胞 成 像 实 验 需 使 用 灌 流 系 统 的 实 验 ) 结 束 后, 应 及 时 关 闭 气 体 阀 门 若 发 现 漏 气 或 气 阀 失 灵, 应 停 止 实 验, 立 即 检 查 并 修 复 20. 使 用 灌 流 系 统 的 实 验 结 束 后, 要 及 时 冲 洗 灌 流 系 统 和 清 理 废 物 瓶 实 验 完 后 将 废 物 瓶 的 负 压 泵 及 时 关 闭 21. 冲 洗 灌 流 系 统 的 步 骤 :(1) 将 压 力 调 至 最 小, 用 10ML 的 注 射 器 把 每 一 管 灌 流 管 中 的 溶 液 抽 干 ;(2) 用 5ML 的 注 射 器 向 每 一 管 灌 流 管 中 注 满 超 纯 水, 再 用 10ML 的 注 射 器 依 次 抽 干, 此 步 骤 重 复 3 次 ;(3) 用 5ML 的 注 射 器 将 每 一 管 灌 流 管 中 注 满 超 纯 水, 打 开 气 体 压 力 到 80kpa, 检 查 每 一 管 灌 流 管 是 否 通 畅, 如 有 堵 塞, 用 10ML 的 注 射 器 倒 吸 管 子 里 的 堵 塞 物 ;(4) 等 溶 液 全 部 流 完 后, 将 压 力 调 至 最 小, 关 闭 气 体 阀 门 22. 灌 流 系 统 每 1-2 月 彻 底 清 洗 一 次, 由 组 长 负 责 清 洗 :(1) 配 置 5% 浓 度 的 84 消 毒 液, 用 5ML 的 注 射 器 注 入 到 每 一 管 灌 流 管, 浸 泡 40 分 钟, 用 10ML 的 注 射 器 依 次 抽 干 灌 流 管 内 溶 液, 用 超 纯 水 清 洗 3 遍 ;(2) 把 灌 流 系 统 上 的 三 通 以 及 所 有 软 管 和 电 极 头 拆 下, 分 别 用 5% 浓 度 的 84 消 毒 液 冲 洗 浸 泡, 最 后 用 超 纯 水 浸 泡 冲 洗 清 洗 完 后, 装 回 灌 流 系 统, 用 5ML 注 射 器 将 所 有 灌 流 管 中 注 满 超 纯 水, 冲 洗 管 道 10 遍 ;(3) 清 洗 完 后 将 气 体 压 力 关 到 最 小, 关 闭 气 体 阀 门 23. 物 镜 清 洁 注 意 事 项 : 空 气 镜 和 油 镜 用 无 水 乙 醇 擦 拭 擦 拭 时 应 选 用 物 镜 专 用 擦 镜 纸 6

或 长 纤 维 的 脱 脂 棉 签, 从 中 心 往 外 呈 螺 旋 形 擦 拭, 或 单 方 向 擦 拭 严 禁 来 回 摩 擦 镜 头 水 镜 用 超 纯 水 清 洗, 再 用 擦 镜 纸 擦 干 24. 细 胞 箱 维 护 注 意 事 项 : 经 常 检 查 二 氧 化 碳 气 体 余 量 培 养 箱 的 门 是 否 关 紧 CO2 的 浓 度 和 培 养 箱 的 温 度 及 时 清 理 培 养 箱 内 剩 余 的 细 胞 每 2 周 更 换 一 次 培 养 箱 内 的 超 纯 水 每 2 个 月 彻 底 清 洁 培 养 箱 内 壁 和 托 盘 每 年 给 培 养 箱 内 部 加 一 次 超 纯 水 遵 守 每 台 仪 器 的 开 机 和 关 机 流 程 以 及 注 意 事 项 : 开 机 时 要 1 个 设 备 1 个 设 备 按 次 序 开, 要 等 上 一 个 设 备 启 动 完 再 开 启 下 一 个 设 备, 切 忌 同 时 打 开 所 有 设 备 尤 其 在 启 动 电 脑 时 人 不 要 走 开, 要 一 直 注 意 电 脑 的 启 动 状 态, 确 保 正 常 启 动, 防 止 电 脑 自 动 进 入 recovery 或 restore 等 状 态 损 坏 软 件 1. Nikon Ti-A1 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0434) 开 机 步 骤 : 开 汞 灯 ( 开 明 场 灯 ) 开 电 脑 开 E-box 开 显 微 镜 开 电 动 载 物 台 电 源 开 激 光 器 开 软 件 注 意 事 项 : 1) 使 用 Preview 和 Capture 分 别 设 置 预 览 参 数 和 正 式 采 图 参 数 2) 更 换 标 本 时 应 先 将 物 镜 降 到 最 低 位 位 置 聚 焦 时 注 意 标 本 和 物 镜 间 的 距 离 ( 可 参 考 显 微 镜 前 方 小 显 示 屏 中 物 镜 Z 轴 位 置 读 数 ), 避 免 物 镜 升 得 过 高 损 坏 标 本 和 物 镜 3) 标 本 应 离 载 玻 片 2 端 1 厘 米, 如 标 本 不 符 合 标 准 应 向 学 生 指 出 并 拒 绝 实 验, 待 学 生 改 正 后 再 进 行 实 验 观 察 载 玻 片 边 缘 的 标 本 时, 要 注 意 物 镜 和 样 品 架 之 间 的 距 离, 避 免 损 伤 物 镜 和 样 品 架 4) 实 验 结 束 后, 应 将 光 路 切 换 到 GFP 观 察 位 置 将 物 镜 降 到 最 低 位 置 将 电 动 平 台 复 位 5) 清 洁 所 有 物 镜, 除 了 10X 和 20X 物 镜 外, 收 纳 其 它 物 镜 关 机 步 骤 : 与 开 机 步 骤 相 反 2. Zeiss LSM510 正 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0434) 开 机 步 骤 : 1) 开 防 震 台 上 的 总 电 源 开 E-box 开 电 脑 开 显 微 镜 开 软 件 等 软 件 进 入 后 开 汞 灯 开 激 光 器 2)488 激 光 器 开 启 : 先 将 488 激 光 器 电 源 开 关 ON 在 软 件 中 将 488 激 光 点 Standby 等 488 激 光 器 预 热 完 成 后 点 ON 3)543/633 激 光 器 开 启 : 先 开 543/633 激 光 器 电 源 钥 匙 在 软 件 中 将 543/633 激 光 点 ON 注 意 事 项 : 1) 使 用 512x512 Zoom1 Scan speed=7 Average=1 设 置 参 数 预 览 图 像, 使 用 1024x1024 Scan speed=6 Average=4-8 采 集 图 像 7

2) 不 要 将 载 物 台 一 直 往 一 个 方 向 偏 移, 当 载 物 台 位 置 过 偏 时, 及 时 将 载 物 台 复 位 3) 更 换 标 本 时, 先 将 物 镜 轻 轻 抬 起 来, 放 置 好 标 本 后, 再 将 物 镜 轻 轻 放 下 来 使 用 高 倍 (40x/63x/100x) 油 镜 聚 焦 时 注 意 不 要 调 焦 过 猛, 避 免 损 坏 标 本 和 物 镜 4) 当 需 要 用 明 视 野 观 察 标 本 时, 应 先 将 显 微 镜 切 换 至 目 视 观 察 位 置, 然 后 再 将 明 视 野 灯 切 入 光 路 5) 在 成 像 时, 应 将 明 视 野 灯 关 闭 或 开 至 最 小 6) 实 验 结 束 后, 将 载 物 台 复 位 关 机 步 骤 : 与 开 机 步 骤 相 反 3) 2) 1) 关 闭 543/633 激 光 器 : 先 在 软 件 中 将 543/633 激 光 点 off 关 闭 543/633 激 光 器 电 源 钥 匙 关 闭 488 激 光 器 : 先 在 软 件 中 点 Standby 点 off 等 488 激 光 器 冷 却, 风 扇 停 止 转 动 关 闭 488 激 光 器 电 源 开 关 3.Zeiss LSM510 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0434) 开 机 步 骤 : 1) 开 防 震 台 上 的 总 电 源 开 E-box 开 电 脑 开 显 微 镜 开 软 件 等 软 件 进 入 后 开 汞 灯 开 激 光 器 2)488 激 光 器 开 启 : 先 将 488 激 光 器 电 源 开 关 ON 在 软 件 中 将 488 激 光 点 Standby 等 488 激 光 器 预 热 完 成 后 点 ON 3)543/633 激 光 器 开 启 : 先 开 543/633 激 光 器 电 源 钥 匙 在 软 件 中 将 543/633 激 光 点 ON 注 意 事 项 : 1) 使 用 512x512 Zoom1 Scan speed=7 Average=1 设 置 参 数 预 览 图 像, 使 用 1024x1024 Scan speed=6,average=4/8 参 数 采 集 图 像 2) 更 换 标 本 时 应 先 将 物 镜 降 到 最 低 位 位 置 聚 焦 时 注 意 标 本 和 物 镜 间 的 距 离 ( 可 参 考 显 微 镜 前 方 小 显 示 屏 中 物 镜 Z 轴 位 置 读 数 ), 避 免 物 镜 升 得 过 高 损 坏 标 本 和 物 镜 3) 标 本 应 离 载 玻 片 2 端 1 厘 米, 如 标 本 不 符 合 标 准 应 向 学 生 指 出 并 拒 绝 实 验, 待 学 生 改 正 后 再 进 行 实 验 观 察 载 玻 片 边 缘 的 标 本 时, 要 注 意 物 镜 和 样 品 架 之 间 的 距 离, 避 免 损 伤 物 镜 和 样 品 架 4) 实 验 结 束 后, 应 将 光 路 切 换 到 GFP 观 察 位 置 将 物 镜 降 到 最 低 位 置 将 平 台 复 位 5) 清 洁 所 有 物 镜, 除 了 10X 和 20X 物 镜 外, 收 纳 其 它 物 镜 关 机 步 骤 : 与 开 机 步 骤 相 反 3) 2) 1) 关 闭 543/633 激 光 器 : 先 在 软 件 中 将 543/633 激 光 点 off 关 闭 543/633 激 光 器 电 源 钥 匙 关 闭 488 激 光 器 : 先 在 软 件 中 点 Standby 点 off 等 488 激 光 器 冷 却, 风 扇 停 止 转 动 关 闭 488 激 光 器 电 源 开 关 4. Olympus FV-1000 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0438) 8

开 机 步 骤 : 开 汞 灯 开 电 脑 开 E-box 开 电 动 载 物 台 电 源 开 显 微 镜 开 激 光 器 开 软 件 405 激 光 器 开 启 : 先 将 405 激 光 器 电 源 开 关 ON 打 开 钥 匙 488 激 光 器 开 启 : 先 将 488 激 光 器 电 源 开 关 ON 打 开 钥 匙 543/633 激 光 器 开 启 : 打 开 543/633 激 光 器 电 源 钥 匙 注 意 事 项 : 1) 做 活 细 胞 实 验 时, 提 前 开 启 加 热 台 预 热 2) 更 换 标 本 时 应 先 将 物 镜 降 到 最 低 位 位 置 聚 焦 时 注 意 标 本 和 物 镜 间 的 距 离 ( 可 参 考 显 微 镜 前 方 小 显 示 屏 中 物 镜 Z 轴 位 置 读 数 ), 避 免 物 镜 升 得 过 高 损 坏 标 本 和 物 镜 3) 标 本 应 离 载 玻 片 2 端 1 厘 米, 如 标 本 不 符 合 标 准 应 向 学 生 指 出 并 拒 绝 实 验, 待 学 生 改 正 后 再 进 行 实 验 观 察 载 玻 片 边 缘 的 标 本 时, 要 注 意 物 镜 和 样 品 架 之 间 的 距 离, 避 免 损 伤 物 镜 和 样 品 架 4) 固 定 标 本 成 像 时, 应 将 ZDC 置 于 OUT 位 置 5) 活 细 胞 成 像 实 验 结 束 后, 及 时 关 闭 气 体 阀 门 若 发 现 漏 气 或 气 阀 失 灵, 应 停 止 实 验, 立 即 检 查 并 修 复 6) 实 验 结 束 后, 切 换 到 GFP 荧 光 观 察 模 式, 物 镜 降 到 Z 轴 最 低 点, 将 电 动 平 台 复 位 关 机 步 骤 : 与 开 机 步 骤 相 反 关 闭 488 激 光 器 : 关 钥 匙 等 488 激 光 器 冷 却, 风 扇 停 止 转 动 关 488 激 光 器 电 源 开 关 关 闭 543/633 激 光 器 : 关 543/633 激 光 器 电 源 钥 匙 关 闭 405 激 光 器 : 关 钥 匙 关 405 激 光 器 电 源 开 关 5. Olympus FV10i 台 式 共 聚 焦 显 微 镜 ( 油 式 )(A0438) 开 机 步 骤 : 开 电 脑 开 E-box 开 显 微 镜 电 源 ( 电 源 键 按 一 下 ) 机 器 预 热, 指 示 灯 闪 光 机 器 预 热 完 毕, 指 示 灯 停 止 闪 光 开 软 件 注 意 事 项 : 1) 将 标 本 盖 玻 片 朝 下 放 置 在 样 品 架 上, 要 采 集 的 标 本 部 位 对 齐 样 品 架 上 的 1 2 3 4 5 位 置 标 记 标 本 载 玻 片 注 意 用 弹 片 固 定 放 平 2) 打 开 台 式 机 机 箱 盖 子 时 注 意 用 手 防 护, 防 止 盖 子 弹 起 速 度 过 快 3) 将 样 品 架 放 置 到 显 微 镜 机 箱 内 的 载 物 台 上, 注 意 方 向 正 确 4) 盖 机 箱 时, 注 意 用 双 手 分 别 置 于 机 箱 盖 左 右 两 端, 用 力 轻 缓 盖 好 机 箱 盖 5) 打 开 采 图 软 件, 选 择 需 要 的 荧 光 通 道, 驱 动 电 动 载 物 台 自 动 获 取 10x 物 镜 下 样 品 焦 平 面, 取 得 标 本 全 景 图 6) 选 择 60x 油 镜, 油 镜 会 自 动 移 到 加 油 孔, 将 镜 油 排 除 空 气 后 滴 到 加 油 孔 确 认 加 油 后 60x 油 镜 自 动 移 到 标 本 下 7) 自 由 选 点, 调 节 每 个 荧 光 通 道 和 明 场 通 道 的 采 图 参 数,Z-stack 参 数 8) 依 据 设 定 的 参 数 自 动 进 行 长 时 间 多 点 位 置 4 色 荧 光 及 相 差 图 像 采 集 9) 因 台 式 共 聚 焦 显 微 镜 是 自 动 获 取 样 品 焦 平 面, 要 求 样 品 制 备 要 标 准 片 盖 玻 片 的 厚 度 不 能 过 厚, 标 本 要 放 置 在 载 玻 片 的 中 央 位 置 当 找 不 到 焦 平 面 时, 要 检 查 盖 玻 片 表 面 是 否 清 洁 盖 玻 片 厚 度 是 否 合 适, 是 否 使 用 了 过 多 的 封 片 剂, 使 用 油 镜 时 滴 的 镜 油 里 是 否 有 气 泡, 标 本 载 玻 片 是 否 用 弹 片 固 定 平 整 9

10) 清 洁 样 品 架 后 收 纳 清 洁 所 有 物 镜 清 洁 载 物 台 关 机 步 骤 : 与 开 机 步 骤 相 反 6. Nikon E80i 正 置 荧 光 显 微 镜 (A0436) 开 机 步 骤 : 开 汞 灯 开 电 脑 开 载 物 台 电 源 开 CCD 注 意 事 项 : 1) 使 用 Neurolucida 软 件 做 大 范 围 拼 图, 使 用 Micro-Manager 软 件 做 多 通 道 单 张 荧 光 图 像 采 集 2) 手 动 转 换 物 镜 时, 应 首 先 将 物 镜 抬 高 3) 不 要 长 时 间 在 荧 光 灯 下 观 察 标 本, 在 没 有 进 行 图 像 采 集 和 不 观 察 标 本 时, 及 时 关 闭 荧 光 shutter, 以 免 不 必 要 的 荧 光 照 射 标 本, 以 防 标 本 漂 白 4) 图 像 采 集 的 时 候, 光 路 切 换 到 CCD, 没 有 采 集 图 像 的 时 候, 不 要 将 光 路 切 换 到 CCD, 以 免 强 光 长 时 间 照 射 CCD, 对 CCD 灵 敏 度 造 成 损 伤 当 荧 光 信 号 很 强 时, 调 低 曝 光 时 间, 防 止 过 亮 对 CCD 造 成 损 伤 5) 荧 光 光 源 汞 灯 由 于 使 用 寿 命 短, 为 保 护 汞 灯 延 长 其 使 用 寿 命, 汞 灯 电 源 开 / 关 间 隔 时 间 必 须 大 于 三 十 分 钟 6) 实 验 结 束 后, 将 观 察 / 采 图 切 换 拉 杆 切 换 到 观 察 模 式, 将 载 物 台 复 位,ND 滤 片 全 拉 出 复 原 关 机 步 骤 : 与 开 机 步 骤 相 反 7. Neurolucida 正 置 荧 光 显 微 镜 (A0436) 开 机 步 骤 : 开 汞 灯 / 开 明 场 灯 开 电 脑 开 载 物 台 电 源 开 CCD 注 意 事 项 : 1) 使 用 Neurolucida 软 件 做 大 范 围 拼 图, 使 用 Picture-Frame 软 件 做 多 通 道 单 张 荧 光 图 像 采 集 2) 手 动 转 换 物 镜 时, 注 意 轻 抬 轻 放 3) 不 要 长 时 间 在 荧 光 灯 下 观 察 标 本, 在 没 有 进 行 图 像 采 集 和 不 观 察 标 本 时, 及 时 关 闭 荧 光 shutter, 以 免 不 必 要 的 荧 光 照 射 标 本, 以 防 标 本 漂 白 4) 图 像 采 集 的 时 候, 光 路 切 换 到 CCD, 没 有 采 集 图 像 的 时 候, 不 要 将 光 路 切 换 到 CCD, 以 免 强 光 长 时 间 照 射 CCD, 对 CCD 灵 敏 度 造 成 损 伤 当 荧 光 信 号 很 强 时, 调 低 曝 光 时 间, 防 止 过 亮 对 CCD 造 成 损 伤 5) 荧 光 光 源 汞 灯 由 于 使 用 寿 命 短, 为 保 护 汞 灯 延 长 其 使 用 寿 命, 汞 灯 电 源 开 / 关 间 隔 时 间 必 须 大 于 三 十 分 钟 6) 实 验 结 束 后, 将 观 察 / 采 图 切 换 拉 杆 切 换 到 观 察 模 式, 将 载 物 台 复 位,ND 滤 片 全 拉 出 复 原 关 机 步 骤 : 与 开 机 步 骤 相 反 10

8. Nikon TE-2000e 倒 置 荧 光 显 微 镜 (A0436) 开 机 步 骤 : 开 汞 灯 / 开 明 场 灯 开 电 脑 开 显 微 镜 电 源 开 载 物 台 电 源 开 CCD 注 意 事 项 : 1) 使 用 Neurolucida 软 件 做 大 范 围 拼 图, 使 用 Micro-Manager 软 件 做 多 通 道 单 张 荧 光 图 像 采 集 2) 不 要 长 时 间 在 荧 光 灯 下 观 察 标 本, 在 没 有 进 行 图 像 采 集 和 不 观 察 标 本 时, 及 时 关 闭 荧 光 shutter, 以 免 不 必 要 的 荧 光 照 射 标 本, 以 防 标 本 漂 白 3) 图 像 采 集 的 时 候, 光 路 切 换 到 CCD, 没 有 采 集 图 像 的 时 候, 不 要 将 光 路 切 换 到 CCD, 以 免 强 光 长 时 间 照 射 CCD, 对 CCD 灵 敏 度 造 成 损 伤 当 荧 光 信 号 很 强 时, 调 低 曝 光 时 间, 防 止 过 亮 对 CCD 造 成 损 伤 4) 此 台 仪 器 配 的 是 高 灵 敏 度 制 冷 CCD, 注 意 CCD 制 冷 风 扇 的 正 常 运 行, 防 止 CCD 因 运 行 温 度 过 高 造 成 损 伤 5) 实 验 结 束 后, 切 换 到 荧 光 观 察 模 式, 将 载 物 台 复 位,ND 滤 片 全 拉 出 复 原 关 机 步 骤 : 与 开 机 步 骤 相 反 9. NIKON Ti-A1R 共 聚 焦 显 微 镜 (A0119) 开 机 步 骤 : 开 汞 灯 ( 开 明 场 灯 ) 开 E-box 开 电 脑 开 shutter 控 制 器 开 显 微 镜 开 电 动 载 物 台 电 源 开 E-box 开 激 光 器 开 软 件 注 意 事 项 : 1) 观 察 标 本 聚 焦 时 应 注 意 物 镜 和 标 本 以 及 标 本 夹 之 间 的 距 离, 以 免 物 镜 压 坏 标 本 和 标 本 夹 关 机 步 骤 : 与 开 机 步 骤 相 反 10. NIKON Fn1-A1R 共 聚 焦 显 微 镜 (A0119) 开 机 步 骤 : 开 汞 灯 ( 开 明 场 灯 ) 开 E-box 开 电 脑 开 Z 轴 远 程 控 制 器 开 激 光 器 ( 先 打 开 440nm 激 光 控 制 器, 再 打 开 440nm 激 光 器 电 源 ) 开 软 件 注 意 事 项 : 1) 观 察 标 本 聚 焦 时 应 注 意 物 镜 和 标 本 以 及 标 本 夹 之 间 的 距 离, 以 免 物 镜 压 坏 标 本 和 标 本 夹 2) 每 月 更 换 一 次 聚 光 器 上 用 于 防 水 的 保 鲜 膜 关 机 步 骤 : 与 开 机 步 骤 相 反 11. Prairie 活 体 双 光 子 显 微 镜 (A0119) 11

开 机 步 骤 : 开 接 线 板 电 源 开 分 压 器 开 电 源 控 制 器 开 检 流 式 光 学 扫 描 控 制 器 (2 台 ) 开 device control( 带 风 扇 ) 开 PMT control 开 device control 开 汞 灯 开 BIAS VOLTAGE 开 光 检 测 器 开 电 脑 开 软 件 开 双 光 子 激 光 器 : 开 电 脑, 关 360 安 全 卫 士 开 maitai 软 件, 设 置 COM3 长 按 ON,warm up 到 100% 打 开 Info 和 Setup 选 择 green power 模 式, 能 量 先 设 置 为 7, 等 激 光 器 能 量 稳 定 到 7 之 后, 逐 步 加 到 12, 激 光 机 锁 模 并 能 量 稳 定 后, 设 置 学 生 使 用 的 双 光 子 波 长 切 换 回 IR power 模 式 开 DeepSee 软 件, 设 置 为 4, 设 置 最 佳 光 补 偿 参 数 开 双 光 子 激 光 器 的 shutter 调 节 bias voltage, 使 光 检 测 器 上 的 数 值 达 到 最 小 ( 过 一 段 时 间 后, 光 检 测 器 的 上 的 数 值 会 变 化, 要 及 时 调 节 bias voltage) 注 意 事 项 : 1) 实 验 结 束 后, 将 Master 8 刺 激 器 的 所 有 通 道 的 电 流 关 到 最 小 后 再 关 闭 Master 8 刺 激 器 和 刺 激 隔 离 器 2) 经 常 观 察 激 光 器 的 状 态 : 是 否 锁 模, 能 量 是 否 稳 定, 激 光 器 的 温 度 和 湿 度 等 3) 观 察 标 本 :( 重 要 : 先 确 认 PMT 放 在 0, 以 免 强 光 照 射 到 PMT 上 造 成 损 坏 ) 打 开 外 罩 的 门 推 入 杆 子 切 换 滤 片 汞 灯 光 强 打 开 1 格 打 开 汞 灯 shutter 观 察 标 本 4) 采 图 : 关 闭 汞 灯 shutter 滤 片 切 换 到 1 拉 出 杆 子 关 上 外 罩 的 门 汞 灯 光 强 关 到 最 小 采 图 5) 其 他 设 备 不 使 用 双 光 子 激 光 器 时, 要 把 遮 光 盒 挡 在 其 光 路 上, 以 防 激 光 长 时 间 照 射 分 光 镜 造 成 损 坏 6) 实 验 结 束 后, 将 PMT Gain 设 置 在 0 将 显 微 镜 滤 光 块 位 置 拨 到 位 置 5 将 显 微 镜 光 路 切 换 至 观 察, 以 免 外 部 强 光 损 坏 PMT 关 双 光 子 激 光 器 : 关 激 光 器 的 shutter, 把 波 长 设 置 成 800nm 选 择 OFF 关 闭 激 光 器, 关 闭 Maitai 和 DeepSee 的 软 件 关 机 步 骤 : 与 开 机 步 骤 相 反 12. NIKON Ti 活 细 胞 工 作 站 (A0107) 开 机 步 骤 : 开 电 脑 ( 启 动 完 毕 后 ) 开 接 线 板 电 源 开 单 色 仪 ( 或 开 汞 灯 ) 开 明 场 灯 开 显 微 镜 开 shutter 控 制 器 开 CCD 风 扇 开 CCD 开 软 件 注 意 事 项 : 1) 更 换 单 色 仪 光 纤 和 汞 灯 的 光 纤 时, 动 作 要 轻 关 机 步 骤 : 与 开 机 步 骤 相 反 13. Olympus FV10i 台 式 共 聚 焦 显 微 镜 ( 水 式 ) (A0119) 12

开 机 步 骤 : 开 E-box 开 显 微 镜 电 源 机 器 预 热, 指 示 灯 闪 光 机 器 预 热 完 毕, 指 示 灯 停 止 闪 光 开 电 脑 开 软 件 注 意 事 项 : 1) 将 细 胞 培 养 皿 放 置 在 样 品 架 上, 注 意 用 弹 片 固 定 放 平 2) 打 开 台 式 机 机 箱 盖 子, 盖 子 开 启 时 注 意 用 手 防 护, 防 止 盖 子 弹 起 速 度 过 快 3) 将 水 槽 加 入 超 纯 水 后 装 入 仪 器 内, 放 入 通 气 管, 调 节 好 通 气 量 ( 气 瓶 压 力 设 置 为 5kpa, 压 力 调 节 旋 钮 旋 到 最 小 ) 4) 将 样 品 架 放 置 到 显 微 镜 机 箱 内 的 载 物 台 上, 放 标 本 架 和 放 细 胞 盒 盖 时 一 定 要 确 认 放 到 位 5) 双 手 分 别 置 于 机 箱 盖 左 右 两 端, 用 力 轻 缓 盖 好 机 箱 盖 6) 打 开 采 图 软 件, 驱 动 电 动 载 物 台 自 动 获 取 10x 物 镜 下 样 品 焦 平 面, 采 集 预 览 的 map 时, 应 选 择 最 重 要 的 2 个 通 道 来 采 集 7) 选 择 60x 水 镜, 给 物 镜 加 水 前 先 排 除 气 泡 8) 自 由 选 点, 调 节 每 个 荧 光 通 道 和 明 场 通 道 的 采 图 参 数,Z-stack 参 数 9) 依 据 设 定 的 参 数 自 动 进 行 长 时 间 多 点 位 置 4 色 荧 光 及 相 差 图 像 采 集 10) 关 闭 气 体 阀 门, 将 水 槽 取 出 后 把 水 倒 干 净, 清 洁 样 品 架 后 收 纳 清 洁 所 有 物 镜 清 洁 载 物 台 关 机 步 骤 : 与 开 机 步 骤 相 反 13

光 学 成 像 实 验 注 意 事 项 1) 显 微 镜 属 于 高 精 密 的 科 学 仪 器, 所 处 环 境 应 保 持 洁 净 干 燥 稳 定 严 禁 在 显 微 镜 室 中 吃 东 西 喝 饮 料 成 像 实 验 室 的 温 度 需 常 年 保 持 在 18 左 右, 请 勿 私 自 更 改 空 调 的 温 度 进 出 光 学 成 像 实 验 室 请 注 意 关 门, 保 证 室 内 温 度 稳 定 2) 用 于 显 微 镜 观 察 的 标 本 应 放 置 在 载 玻 片 的 中 央 部 位, 盖 玻 片 应 该 朝 向 物 镜 如 果 使 用 的 是 油 ( 水 ) 镜, 确 定 在 物 镜 和 盖 玻 片 之 间 有 足 够 的 油 ( 水 ), 并 且 没 有 气 泡 3) 固 定 标 本 需 要 等 封 片 剂 干 了 用 棉 签 沾 无 水 乙 醇 擦 干 玻 片 表 面 的 水 汽 后 才 能 进 行 成 像 实 验 活 细 胞 标 本 需 将 培 养 皿 底 部 的 盖 玻 片 用 无 水 乙 醇 擦 干 后 才 能 进 行 成 像 实 验 4) 固 定 标 本 应 放 置 在 片 盒 或 者 其 它 避 光 盒 中, 活 细 胞 应 放 在 培 养 箱 中 标 本 和 实 验 器 材 应 放 置 在 实 验 桌 上, 不 得 放 在 仪 器 设 备 ( 如 :E-box 激 光 器 载 物 台 上 等 ) 上 5) 禁 止 戴 手 套 操 作 仪 器 设 备 6) 使 用 恒 温 加 热 台 时, 打 开 盖 子 和 合 上 盖 子 时 要 注 意 不 要 朝 一 个 方 向 缠 绕 电 线, 通 气 时 要 注 意 水 槽 中 的 水 不 能 溢 出 7) 移 动 任 何 光 学 部 件 时 动 作 要 轻 柔 不 能 用 蛮 力 实 验 时 身 体 不 得 依 靠 在 仪 器 上 8) 聚 焦 时 要 注 意 镜 头 和 标 本 间 的 距 离, 防 止 压 坏 标 本 和 损 坏 物 镜! 取 放 样 品 之 前, 倒 置 显 微 镜 务 必 降 下 物 镜, 正 置 显 微 镜 务 必 升 上 物 镜 9) 如 在 实 验 室 需 要 使 用 自 带 设 备 ( 如 : 微 操 纵 器 电 刺 激 器 等 ) 或 显 微 镜 的 通 讯 接 口, 请 提 前 告 知 工 作 人 员, 并 按 工 作 人 员 的 安 排 将 自 带 设 备 放 置 于 固 定 位 置 且 使 用 指 定 的 电 源 接 口 未 经 允 许 请 不 得 使 用 显 微 镜 通 讯 接 口 和 实 验 室 的 电 源 接 口 电 生 理 实 验 后 的 玻 璃 电 极 请 自 己 带 走, 不 可 丢 在 实 验 室 垃 圾 桶 里 10) 移 动 XY 电 动 平 台 时, 要 小 心 避 开 控 制 器 前 方 的 CCD 电 源 线 手 不 能 靠 在 电 动 载 物 台 上, 以 免 损 坏 电 动 平 台 11) 不 要 将 实 验 溶 液 溢 出 在 仪 器 设 备 上, 如 有 不 慎 溢 出 的 情 况, 请 马 上 报 告 工 作 人 员 12) 使 用 灌 流 系 统 时, 溶 液 要 用 0.2um 孔 径 的 过 滤 器 过 滤 如 溶 液 含 脂 溶 性 或 者 剧 毒 的 化 合 物 ( 禁 止 将 Thapsigargin Ionomycin A-23187 等 药 物 装 入 灌 流 系 统 ), 请 提 前 告 知 工 作 人 员 13) 使 用 CCD 进 行 图 像 采 集 的 时 候, 应 将 光 路 切 换 到 CCD; 不 进 行 图 像 采 集 时, 不 要 将 光 路 切 换 至 CCD, 以 免 强 光 长 时 间 照 射 CCD, 使 CCD 灵 敏 度 降 低 当 荧 光 信 号 很 强 时, 调 低 曝 光 时 间, 以 防 损 坏 CCD 14) 不 要 直 视 激 光 光 束 ( 尤 其 是 双 光 子 激 光 ) 和 正 在 扫 描 的 样 品, 以 免 损 伤 眼 睛 14

15) 无 关 人 员 请 不 要 私 自 进 入 实 验 室 激 光 器 的 打 开 和 关 闭 物 镜 的 安 装 和 更 换 室 内 通 风 及 温 度 控 制 等 必 须 由 本 实 验 室 工 作 人 员 进 行 16) 实 验 者 的 手 机 电 脑 等 自 带 电 子 设 备 禁 止 插 用 本 实 验 室 的 电 源 插 座 Nikon Ti A1 和 A1R 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 ( 特 别 注 意 事 项 ): 1) 观 察 标 本 聚 焦 时 应 注 意 物 镜 和 标 本 以 及 标 本 夹 之 间 的 距 离, 以 免 物 镜 压 坏 标 本 和 标 本 夹 严 禁 使 用 不 规 范 制 作 的 标 本 ( 如 : 标 本 排 列 过 密 标 本 距 载 玻 片 两 端 的 距 离 过 近 ) 做 实 验 Nikon FN1 A1R 正 置 共 聚 焦 显 微 镜 ( 特 别 注 意 事 项 ): 1) 观 察 标 本 聚 焦 时 需 要 注 意 : 用 白 色 金 属 圈 ( 粗 调 节 ) 聚 焦, 或 者 用 远 程 控 制 器 ( 细 调 节 ) 聚 焦, 不 要 旋 转 黑 色 聚 焦 旋 钮 正 确 操 作 : 用 白 色 金 属 圈 ( 粗 调 节 ) 聚 焦, 或 者 用 远 程 控 制 器 ( 细 调 节 ) 聚 焦 错 误 操 作 : 此 黑 色 圈 聚 焦 已 锁 住, 强 行 旋 动 会 造 成 仪 器 损 坏 15

2) 注 意 载 物 台 的 位 置 : 使 用 一 段 时 间 后 要 将 载 物 台 移 回 中 央 位 置, 不 要 沿 一 个 方 向 移 动 载 物 台 以 防 超 过 平 台 的 最 大 移 动 距 离 损 坏 载 物 台 Prairie 活 体 双 光 子 显 微 镜 ( 特 别 注 意 事 项 ): 1) 注 意 载 物 台 的 位 置 : 使 用 一 段 时 间 后 要 将 载 物 台 移 回 中 央 位 置, 不 要 沿 一 个 方 向 移 动 载 物 台 以 防 超 过 平 台 的 最 大 移 动 距 离 损 坏 载 物 台 2) 实 验 中 如 果 需 要 改 变 双 光 子 激 光 的 波 长, 请 通 知 工 作 人 员, 切 勿 自 己 操 作 3) 不 采 图 时, 将 PMT Gain 设 置 在 0 将 显 微 镜 滤 光 块 位 置 拨 到 位 置 5 将 显 微 镜 光 路 切 换 至 观 察, 以 免 外 部 强 光 损 坏 PMT 4) 如 需 使 用 显 微 镜 的 Tirg in line out 和 frame out 等 信 号, 请 提 前 告 知 工 作 人 员 连 接 信 号 线 时 需 专 心, 切 勿 连 错 信 号 线 损 坏 设 备 Nikon Ti 活 细 胞 工 作 站 ( 特 别 注 意 事 项 ): 1) 观 察 标 本 : 先 将 显 微 镜 切 换 至 EYE 状 态, 再 打 开 光 源 的 shutter 观 察 标 本 2) 采 图 : 先 关 闭 光 源 的 shutter, 再 切 换 至 L100(CCD) 采 图 16

Olympus FV10i 台 式 共 聚 焦 显 微 镜 ( 特 别 注 意 事 项 ): 1) 开 仓 门 时, 一 个 手 摁 住 开 仓 的 开 关, 另 一 个 手 挡 住 抬 起 的 盖 子, 慢 慢 打 开 : 2) 关 仓 门 时, 双 手 同 时 向 下 关 闭 仓 门 : 17

3) 放 标 本 架 和 放 细 胞 盒 盖 时 一 定 要 确 认 放 到 位 ( 放 好 后, 左 右 轻 轻 推 一 下, 确 认 放 到 位 ), 否 则 会 损 坏 设 备! 4) 采 集 预 览 的 map 时, 应 选 择 最 重 要 的 2 个 通 道 来 采 集 18

光 学 成 像 实 验 要 点 1) 使 用 面 积 较 小 的 盖 玻 片 制 作 标 本 时, 应 使 用 ProLong R Diamond Antifade Mountant 等 凝 固 型 封 片 剂 封 片 使 用 凝 固 型 封 片 剂 可 以 避 免 标 本 移 动 a. Add 1 drop of ProLong R Diamond Antifade Mountant onto glass slide. b. Remove excess liquid from coverslip. c. Place coverslip sample-side down onto ProLong Diamond Antifade Mountant on the glass slide. d. Cure for 24 hours at room temperature in the dark. e. Clean coverslip and image cells. 2) 应 尽 量 使 用 平 场 复 消 色 差 (Plan-APO) 物 镜 来 采 集 图 像 使 用 平 场 复 消 色 差 (Plan-APO) 物 镜 可 以 获 得 较 平 整 的 和 色 差 较 小 的 图 像 3) 在 采 集 荧 光 图 像 时 尽 量 不 要 同 时 采 集 DIC 图 像 以 免 降 低 图 像 分 辨 率 和 影 响 图 像 亮 度 4) 在 进 行 荧 光 亮 度 定 量 分 析 实 验 时, 所 有 的 采 图 参 数 ( 光 路 设 置 激 光 强 度 PMT 增 益 PMT Offset 平 均 次 数 Zoom Pinhole 等 ) 都 必 须 保 持 一 致, 建 议 使 用 阳 性 标 本 ( 荧 光 亮 度 最 亮 的 标 本 ) 来 设 置 参 数, 避 免 荧 光 亮 度 过 饱 和 应 尽 量 预 订 足 够 长 时 间 的 实 验 时 间, 在 一 次 实 验 中 完 成 所 有 荧 光 定 量 分 析 标 本 的 成 像 5) 在 共 聚 焦 采 图 时, 如 无 特 殊 原 因 Pinhole 应 该 设 置 在 1 Airy Unit 位 置,PMT Offset 应 该 设 置 在 0 位 置,PMT Gain 分 别 设 置 在 50-150 (for NIKON Ti-A1R NIKON FN1- A1R) 600-800 (for Olympus FV-1000) 40-60%(for Olympus FV-10i) 600-700 (for Zeiss LSM 510) 6) 在 共 聚 焦 活 标 本 采 图 时, 可 以 根 据 实 验 需 要 适 当 增 大 Pinhole 降 低 激 光 强 度 增 加 PMT Gain 降 低 采 图 分 辨 率 增 加 采 图 速 度 以 减 小 激 光 对 细 胞 活 性 的 影 响 7) 在 使 用 Prairie Two-photon 显 微 镜 双 光 子 采 图 时,PMT Gain 应 该 设 置 在 600-800,PMT Offset 设 置 在 1.17 左 右, 并 使 用 HiLo Lookup Table 检 查 图 像 亮 度, 避 免 背 景 过 低 或 图 像 过 饱 和 8) 在 活 细 胞 成 像 时 应 尽 量 使 用 水 镜, 避 免 球 差 引 起 的 分 辨 率 变 差 结 构 变 形 ( 拉 长 或 缩 短 ) 9) 在 多 标 记 标 本 荧 光 成 像 时, 要 使 用 序 列 扫 描 来 减 少 串 色 串 色 只 能 尽 量 减 少 不 可 能 完 全 避 免, 所 以 还 必 须 使 用 单 荧 光 标 记 标 本 作 为 对 照 来 检 查 是 否 串 色, 并 用 软 件 来 进 行 串 色 校 正 10) 不 要 用 Live-scan 长 时 间 扫 描 标 本 也 不 要 长 时 间 在 荧 光 灯 下 观 察 标 本, 以 防 标 本 漂 白 19

11) 设 置 参 数 要 1 个 通 道 1 个 通 道 设 置,NIKON 共 聚 焦 显 微 镜 应 使 用 Preview 和 Capture 分 别 设 置 预 览 参 数 和 正 式 采 图 参 数 采 集 预 览 图 像 时 应 使 用 低 分 辨 率 扫 描, 不 要 使 用 高 分 辨 率 扫 描 或 平 均 12) 在 多 荧 光 标 记 标 本 成 像 时 ( 尤 其 是 使 用 Plan-APO 60x 高 数 值 孔 径 物 镜 高 分 辨 成 像 时 ), 必 须 使 用 多 色 荧 光 小 球 标 本 为 对 照 来 检 查 色 差 引 起 的 图 像 在 XYZ 方 向 上 的 偏 移 色 差 只 能 尽 量 避 免 ( 如 : 使 用 Plan-APO 物 镜 使 用 波 长 比 较 接 近 的 488 nm 和 561 nm 激 光 来 采 图 等 ) 不 可 能 完 全 避 免 色 差 一 般 为 几 十 - 几 百 纳 米 ( 视 不 同 的 显 微 镜 构 架 物 镜 类 型 激 发 光 波 长 的 不 同 而 不 同 ), 高 分 辨 率 成 像 实 验 的 图 像 必 须 使 用 软 件 来 进 行 色 差 校 正 13) 高 分 辨 率 图 像 采 集 和 活 细 胞 图 像 采 集 的 图 像 ( 包 括 Z-stack Time-series Two-photon image), 可 以 使 用 反 卷 积 软 件 来 进 一 步 提 高 分 辨 率 或 降 低 噪 声 ( 提 高 信 噪 比 ) 反 卷 积 的 效 果 与 原 始 图 像 的 采 图 分 辨 率 密 切 相 关, 一 般 采 图 分 辨 率 需 要 达 到 物 镜 极 限 分 辨 率 的 1/3-1/4 图 像 的 分 辨 率 和 信 噪 比 对 荧 光 共 定 位 分 析 至 关 重 要 荧 光 共 定 位 分 析 实 验 必 须 使 用 高 数 值 孔 径 物 镜 成 像 图 像 必 须 经 过 反 卷 积 色 差 校 正 串 色 校 正 等 处 理 需 要 做 反 卷 积 处 理 的 同 学 请 找 胡 谦 老 师 讨 论 实 验 和 确 定 采 图 参 数 左 图 为 原 始 图 像 ( 此 标 本 荧 光 标 记 比 较 弱, 无 法 获 得 高 信 噪 比 的 图 像 ), 右 图 为 经 过 反 卷 积 和 色 差 校 正 后 的 图 像, 使 用 OLYMPUS FV-1000 PLAPON 60xOil NA. 1.42 物 镜, 采 图 分 辨 率 xy=0.069 um/pixel, z=0.25 um/pixel 14) 所 有 光 学 成 像 实 验 都 必 须 设 计 和 完 成 正 对 照 实 验 和 负 对 照 实 验 来 保 证 光 学 成 像 实 验 结 果 的 正 确 性 和 准 确 性 http://en.wikipedia.org/wiki/scientific_control Positive controls are groups where a phenomenon is expected. That is, they ensure that there is an effect when there should be an effect, by using an experimental treatment that is already known to produce that effect (and then comparing this to the treatment that is being investigated in the experiment). 20

Negative controls are groups where no phenomenon is expected. They ensure that there is no effect when there should be no effect. To continue with the example of drug testing, a negative control is a group that has not been administered the drug of interest. This group receives either no preparation at all or a sham preparation (that is, a placebo), either an excipient-only (also called vehicle-only) preparation or the proverbial "sugar pill." We would say that the control group should show a negative or null effect. ----------------------------------------------------------------- 附 :Fura-2 AM Loading Protocol 分 子 式 : C44H47N3O24 分 子 量 : 1001.85 外 观 : 黄 色 或 橙 黄 色 粉 末 Loading cells with Fura-2 ------------------------------------------------------------------ General Information on Fura-2 AM ester: Fura-2 is a high-affinity (Kd = 220 nm) Ca 2+ dye. AM ester = acetoxymethyl ester; The AM ester makes the dye membrane permeable because it caps hydrophilic carboxyl groups to form esters. Once the dye is taken up into cells, the esters are cleaved by intracellular esterases and the dye is trapped inside. Excitation ratiometric imaging of Fura-2 is carried out by using 340/26 nm and 380/10 nm excitation filters, a 455 nm dichroic mirror (must have good reflectivity down to approximately 330 nm), and a 535/40 nm emission filter. Fura-2 is light sensitive so store in lightproof manner (e.g., wrapped in tin-foil) at 20 o C. Both Fura-2 and Pluronic F-127 can be obtained from Molecular Probes (Invitrogen). Pluronic F-127 is used to help disperse/solubilize Fura-2. -------------------------------------------------------------------- Loading Cells: 1) Prepare individual Fura-2 and Pluronic F-127 solutions: 50 micrograms of Fura-2 dissolved in 50 microliters 100% DMSO to yield an approximately 1 millimolar solution. Prepare a 20% Pluronic F-127 solution in 100% DMSO 21

Mix 4 microliters of Fura-2 with 2 microliters Pluronic F-127 in a 1.5 milliliter eppendorf tube. Mix well. You may need to vary the ratio of Fura-2/Pluronic! Add 1 ml HBSS to yield a 4 micromolar Fura-2, 0.04% Pluronic solution. After use, Fura-2 can be stored at 20 o C. Pluronic should be stored at room temperature. 2) Remove cells from incubator, wash 2 times with 2 milliliters HBSS (1x Hanks Balanced Salts + 20 millimolar HEPES + 2 g/l D-glucose, ph 7.4). 3) Add the 1mL Fura-2, Pluronic and HBSS to the dish. Let cells sit in the dark at room temperature for 30 min. Do not load Fura-2 at 37 o C; this has a tendency to load internal compartments. 4) After 30 min remove Fura-2 solution. Rinse with 2 milliliters HBSS then add 1 milliliter HBSS to cells and let sit in the dark at room temperature for 15 min. This time is meant to allow for cleavage of the AM ester, trapping the Fura-2 inside the cell. 5) After 15 min replace media with 1 ml fresh HBSS. ------------------------------------------------------------------ Calibration of Fura-2 inside cells: Treat cells with 8 micromolar ionomycin and 10 millimolar EGTA in Ca 2+ -free HBSS to obtain minimum ratio (Rmin). After obtaining Rmin, treat with 2-8 micromolar ionomycin and 20 millimolar Ca 2+ in HBSS to obtain maximum ratio (Rmax). Use the standard equation to convert the Fura-2 340/380 ratio to cytosolic Ca 2+ concentration, [Ca 2+ ]cyt, where Sf and Sb is the emission intensity at 380 nm for Ca 2+ -free and Ca 2+ -bound Fura-2, respectively: [Ca 2+ ]cyt = Kd * [(R-Rmin)/(Rmax-R)] * Sf/Sb Kd = 220 nm 22

附 录 : 显 微 镜 配 置 和 参 数 1. NIKON Ti-A1R 共 聚 焦 显 微 镜 (A0119) 仪 器 主 要 用 途 : 固 定 标 本 和 活 细 胞 标 本 荧 光 成 像 3D 多 标 记 荧 光 成 像 活 细 胞 长 时 间 成 像 FRET(CFP/YFP) 实 验 FRAP 实 验 TIRF 实 验 光 谱 拆 分 实 验 大 范 围 3D 拼 图 实 验 共 振 扫 描 高 速 成 像 ( 可 在 成 象 的 同 时 进 行 光 刺 激 光 漂 白 ) 等 仪 器 配 置 : (1)NIKON Ti-E 全 自 动 倒 置 荧 光 显 微 镜, 含 完 美 聚 焦 系 统 快 速 荧 光 快 门 TIRF 照 明 电 动 XYZ 载 物 台 5% CO2 细 胞 孵 育 系 统 (2)5 个 显 微 镜 荧 光 滤 块 : DAPI(Ex.330-385,Em.420,DM 400) ECFP(Ex.425-445HQ,Em.460-510HQ,DM 450) EGFP(Ex.460-480HQ,Em.495-540HQ,DM 485) EYFP (Ex.490-500HQ,Em.515-560HQ,DM 505) RFP (Ex.535-555HQ,Em.570-625HQ,DM 565) (3)6 个 物 镜 : Plan Apo 10x DIC N1 NA 0.45 WD 4.0 Plan Apo VC 20x DIC N2 NA 0.75 WD 1.0 Plan Apo 40x DIC M/N2 NA 0.95 WD 0.14 S Fluor 40xOil DIC H/N2 NA 1.3 WD 0.22 Plan Apo VC 60xOil DIC N2 NA 1.4 WD 0.13 Plan Apo VC 60xWater DIC N2 NA 1.2 WD 0.31-0.28 (4)4 个 激 光 器 :405 nm 457/488/514 nm 561nm 638 nm (5)2 个 激 光 扫 描 装 置 : 检 流 计 镜 面 扫 描 和 高 速 振 镜 扫 描 (6)3 个 光 检 测 器 :4 PMT 荧 光 检 测 器 透 射 光 检 测 器 32PMT 光 谱 检 测 器 (7) 数 字 信 号 输 入 输 出 : 提 供 同 步 触 发 信 号 输 入 和 输 出 端 口 (8)ANDOR DU-897E EM CCD 2. NIKON Fn1-A1R 共 聚 焦 显 微 镜 (A0119) 仪 器 主 要 用 途 : 固 定 标 本 脑 片 小 动 物 ( 斑 马 鱼 果 蝇 ) 荧 光 成 像 3D 多 标 记 荧 光 成 像 FRET(CFP/YFP) 实 验 FRAP 实 验 光 谱 拆 分 实 验 共 振 扫 描 高 速 成 像 ( 可 在 成 象 的 同 时 进 行 光 刺 激 光 漂 白 ) 等 仪 器 配 置 : (1)FN1 正 置 荧 光 显 微 镜 (2)5 个 显 微 镜 荧 光 滤 块 : DAPI (Ex.330-385,Em.420,DM 400) ECFP(Ex.425-445HQ,Em.460-510HQ,DM 450) EGFP(Ex.460-480HQ,Em.495-540HQ,DM 485) EYFP(Ex.490-500HQ,Em.515-560HQ,DM 505) RFP(Ex.535-555HQ,Em.570-625HQ,DM 565) 23

(3)10 个 物 镜 : Plan Apo 10x DIC N1 NA 0.45 WD 4.0 Plan Apo VC 20x DIC N2 NA 0.75 WD 1.0 Plan Apo 40x DIC M/N2 NA 0.95 WD 0.14 Plan Apo VC 60xOil DIC N2 NA 1.4 WD 0.13 Plan Fluor 10xWater DIC N1 NA 0.3 WD 3.5 NIR Apo 40xWater DIC N2 NA 0.8 WD 3.5 NIR Apo 60xWater DIC N2 NA 1.0 WD 2.8 Plan 100xWater DIC N2 NA 1.1 WD 2.5 CFI75 LWD 16xWater DIC N2 NA 0.8 WD 3.0 CFI75 Apo LWD 25xWater DIC N2 NA 1.1 WD 2.0 (4)5 个 激 光 器 :405 nm 457/488/514 nm 561nm 638 nm 440 nm (5)2 个 激 光 扫 描 装 置 : 检 流 计 镜 面 扫 描 和 高 速 振 镜 扫 描 (6)3 个 光 检 测 器 :4 PMT 荧 光 检 测 器 透 射 光 检 测 器 32PMT 光 谱 检 测 器 (7) 数 字 信 号 输 入 输 出 : 提 供 同 步 触 发 信 号 输 入 和 输 出 端 口 (8)HAMAMATSU C2400-79H IR CCD 3. Prairie 活 体 双 光 子 显 微 镜 (A0119) 仪 器 主 要 用 途 : 活 体 动 物 双 光 子 成 像 3D 多 标 记 标 本 双 光 子 成 像 ( 最 多 2 个 通 道 ) 双 光 子 FRET(CFP/YFP) 实 验 双 光 子 漂 白 损 毁 实 验 基 于 AOD 的 高 速 成 像 ( 分 辨 率 较 差, 可 在 成 象 的 同 时 进 行 光 刺 激 光 漂 白 ) 等 仪 器 配 置 : (1)Olympus BX-61/51 WI 显 微 镜, 配 有 电 动 XYZ 载 物 台 和 2 个 荧 光 滤 块 : ET-GFP(FITC/CY2) ET-DsRed(TRITC/CY3) (2)4 个 物 镜 : OLYMPUS XLUMPLFL 20xWater NA0.95 OLYMPUS LUMPlanFL/IR 40x Water NA 0.8 UPlanFL 4x Phl NA 0.13 (Old) LCPlan Fl ph1 20x NA 0.4 (Old) (3)2 个 双 光 子 成 像 荧 光 滤 块 :GFP/DsRed (DM 575, BA 525/70 nm, BA 607/45 nm), CFP/YFP (DM 515 nm, BA 485/50 nm, BA 540/40 nm) (4)3 个 激 光 扫 描 装 置 : 高 精 度 检 流 计 扫 描 镜 面 基 于 AOD 的 高 速 扫 描 独 立 的 光 刺 激 扫 描 镜 面 (5) TriggerSync 软 件, 可 在 成 像 的 同 时 进 行 多 点 漂 白 解 笼 锁 和 触 发 外 部 电 生 理 设 备 等 (6) 数 字 信 号 输 入 输 出 : 提 供 同 步 触 发 信 号 输 入 和 输 出 端 口 (7)2 个 MaiTai DeepSee Ti:Sapphire 近 红 外 高 速 脉 冲 激 光 器, 具 有 脉 宽 预 补 偿 功 能, 波 长 可 调 范 围 :690 nm-1020 nm 用 于 双 光 子 成 像 和 刺 激 24

4. NIKON Ti-E 活 细 胞 工 作 站 (A0107) 仪 器 主 要 用 途 : 培 养 细 胞 的 结 构 和 功 能 研 究 活 细 胞 长 时 间 成 像 离 子 成 像 TIRF 实 验 等 仪 器 配 置 : (1)NIKON Ti-E 全 自 动 倒 置 荧 光 显 微 镜, 含 完 美 聚 焦 系 统 快 速 荧 光 快 门 基 于 汞 灯 的 TIRF 照 明 电 动 XYZ 载 物 台 5% CO2 细 胞 孵 育 系 统 (2)5 个 荧 光 滤 块 : Fura2(Ex.330-385,Em.470-550,DM 400) FITC(Ex.465-495HQ,Em.515-555,DM 505) G-2A( Ex.510-560HQ,Em.BA590,DM 575) ECFP(Ex.420-445HQ,Em.460-510,DM 450) EYFP (Ex.490-500HQ,Em.520-560,DM 510) (3)8 个 物 镜 : Plan Fluor 10x Ph1 DL NA 0.30 WD 15.2 S Fluor 20x NA 0.75 WD 1.0 S Fluor 40xOil DIC H/N2 NA 1.3 WD 0.22 Plan Apo 60xOil Ph3 DM N.A.1.4 WD 0.13 Plan Apo 60xWater DIC H NA 1.2 WD 0.22 Apo TIRF 60xOil DIC N2 NA 1.49 WD 0.12 Apo TIRF 100xOil DIC N2 NA 1.49 WD 0.12 S Fluor 100xOil Iris N.A.0.5-1.3 WD 0.2 (4) 其 他 :CCD: Roper Cascade 512B EMCCD,Till Polychrome IV 单 色 仪,MetaMorph and MetaFluor 成 像 软 件 CCD 分 辨 率 (um/pixl) 物 镜 ZOOM 1.0 ZOOM 1.5 Plan Fluor 10x Ph1 DL N.A.0.30 1.623377 1.082251 S Fluor 20x N.A.0.75 S Fluor 40x DIC H/N2 Oil N.A.1.3 0.399464 0.267387 Plan Apo 60x Ph3 DM Oil N.A.1.4 0.269770 0.179837 Plan Apo 60xA Water N.A.1.2 Apo TIRF 60x DIC Oil N.A.1.49 0.266917 0.178581 Apo TIRF 100x Oil N.A.1.49 0.160256 0.107296 S Fluor 100x Oil Iris N.A.0.5-1.3 5. Olympus FV-10i 台 式 共 聚 焦 显 微 镜 ( 水 式 )(A0119) 仪 器 主 要 用 途 : 活 细 胞 和 固 定 标 本 荧 光 成 像 可 以 同 时 采 集 4 种 颜 色 荧 光 图 像 和 1 张 明 视 野 相 差 图 像, 采 图 模 式 :XYT XYZ XYZT 多 位 置 XYT 多 位 置 XYZT 仪 器 配 置 : 25

(1) 由 计 算 机 和 暗 箱 式 共 聚 焦 显 微 镜 组 成 : 含 电 动 XYZ 载 物 台 2 个 物 镜 4 个 激 光 器 等 部 件 (2)4 个 激 光 器 :405 nm 473 nm 559 nm 635 nm (3)3 个 光 检 测 器 :2 PMT 荧 光 检 测 器,1 个 透 射 光 检 测 器 (4) 物 镜 :Plan APO 10x Ph NA 0.4 和 Plan APO 60xWater Ph NA 1.2( 有 自 动 加 水 和 清 洁 装 置 ) (5) 温 控 和 CO2 控 制 : 温 度 控 制 37±1 C, 湿 度 大 于 90%,CO2 控 制 5% (6) 含 聚 焦 稳 定 装 置 : 硬 件 自 动 识 别 培 养 皿 玻 底 和 溶 液 的 界 面, 可 长 时 间 (> 72 小 时 ) 稳 定 聚 焦 平 面 6. Nikon Ti-A1 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0434) 仪 器 主 要 用 途 : 固 定 标 本 荧 光 成 像,3D 多 标 记 荧 光 成 像, 大 范 围 3D 拼 图 等 仪 器 配 置 : (1)NIKON Ti-E 全 自 动 倒 置 荧 光 显 微 镜, 配 有 电 动 XYZ 载 物 台 (2)3 个 显 微 镜 荧 光 滤 块 : DAPI(Ex.330-385,Em.420,DM 400) EGFP(Ex.460-480HQ,Em.495-540HQ,DM 485) RFP(Ex.535-555HQ,Em.570-625HQ,DM 565) (3)4 个 物 镜 : Plan Apo 10x DIC N1 NA 0.45 WD 4.0 Plan Apo VC 20x DIC N2 NA 0.75 WD 1.0 S Fluor 40xOil DIC H/N2 NA 1.3 WD 0.22 Plan Apo VC 60xOil DIC N2 NA 1.4 WD 0.13 (4)4 个 激 光 器 :405 nm 457/488/514 nm 543nm 633 nm (5)2 个 光 检 测 器 :4 PMT 荧 光 检 测 器 透 射 光 检 测 器 7. Olympus FV-1000 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0438) 仪 器 主 要 用 途 : 固 定 标 本 和 活 细 胞 荧 光 成 像 3D/4D 多 标 记 荧 光 成 像 大 范 围 3D 拼 图 ( 最 多 3 个 通 道 ) 仪 器 配 置 : (1)Olympus FV-1000 倒 置 荧 光 显 微 镜, 配 有 电 动 XYZ 载 物 台 载 物 台 活 细 胞 孵 育 系 统 (2) 4 个 显 微 镜 荧 光 滤 块 : DAPI(Ex.330-385,Em.420,DM 400) EGFP(Ex.470-495,Em.510-550,DM 485) RFP(Ex.530-550,Em.575IF,DM 565) CY5(Ex.620/60HQ,Em.700/75HQ,DM 660) (3) 6 个 物 镜 : UPLSAPO 10x NA0.45 UPLSAPO 20x DIC NA0.75 26

UPLFLN 40xOil DIC NA 1.3 PLAPON 60xOil DIC NA 1.42 LUCPLFLN 20X NA 0.45 UPLSAPO 100xOil NA 1.4 (4)4 个 激 光 器 :405 nm 488 nm 543nm 633 nm (5) 2 个 光 检 测 器 :3 PMT 荧 光 检 测 器 透 射 光 检 测 器 8. Olympus FV-10i 台 式 共 聚 焦 显 微 镜 ( 油 式 )(A0438) 仪 器 主 要 用 途 : 固 定 标 本 荧 光 成 像 可 以 同 时 采 集 4 种 颜 色 荧 光 图 像 和 1 张 明 视 野 相 差 图 像, 采 图 模 式 :XYT XYZ XYZT 多 位 置 XYT 多 位 置 XYZT 仪 器 配 置 : (1) 由 计 算 机 和 暗 箱 式 共 聚 焦 显 微 镜 组 成 : 含 电 动 XYZ 载 物 台 2 个 物 镜 4 个 激 光 器 等 部 件 (2)4 个 激 光 器 :405 nm 473 nm 559 nm 635 nm (3)3 个 光 检 测 器 :2 PMT 荧 光 检 测 器,1 个 透 射 光 检 测 器 (4) 物 镜 :Plan APO 10x Ph NA 0.4 和 Plan APO 60xOil Ph NA 1.35 9. Zeiss LSM510 正 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0434) 仪 器 主 要 用 途 : 固 定 标 本 荧 光 成 像,3D 多 标 记 标 本 荧 光 成 像 仪 器 配 置 : (1)Zeiss AxioSkop 2 FS mot 正 置 荧 光 显 微 镜 (2)3 个 显 微 镜 荧 光 滤 块 : DAPI(Ex.330-385,Em.420,DM 400) EGFP(Ex.460-480HQ,Em.495-540HQ,DM 485) RFP(Ex.535-555HQ,Em.570-625HQ,DM 565) (3)11 个 物 镜 : Plan Neofluar 10x/0.3 DICI Plan APO 10x/0.45 DICI Plan APO 20x/0.8 DICII Plan APO 20x/0.60 Ph2 Plan Neofluar 40xOil/1.3 DICIII Plan APO 63xOil/1.4 DICIII Plan APO 100xOil/1.4 DICIII Achroplan 10xW/0.30 Ph1 Achroplan 20xW/0.50 Ph2 Achroplan 40xW/0.80 IR DICIII Achroplan 63xW/0.90 IR DICIII (3)3 个 激 光 器 : 458/477/488/514 nm 543nm 633 nm 27

(4)3 个 光 检 测 器 :3 PMT 荧 光 检 测 器 32 PMT 光 谱 检 测 器 透 射 光 检 测 器 (5) 仪 器 故 障 : 仪 器 已 经 使 用 13 年, 3 个 PMT 中 2 个 灵 敏 度 有 所 下 降, 现 使 用 Ch3 ChS 通 道 来 荧 光 成 像 ; 明 视 野 灯 和 透 射 光 PMT 的 自 动 切 换 失 灵, 需 要 手 工 切 换 10. Zeiss LSM510 倒 置 共 聚 焦 显 微 镜 (A0434) 仪 器 主 要 用 途 : 固 定 标 本 荧 光 成 像,3D 多 标 记 标 本 荧 光 成 像 仪 器 配 置 : (1)Zeiss AxioVert 200M 倒 置 荧 光 显 微 镜 (2)3 个 显 微 镜 荧 光 滤 块 : DAPI(Ex.330-385,Em.420,DM 400) EGFP(Ex.460-480HQ,Em.495-540HQ,DM 485) RFP(Ex.535-555HQ,Em.570-625HQ,DM 565) (3)7 个 物 镜 : Plan Neofluar 5x/0.15 Ph1 Plan Neofluar 10x/0.30 DICI Plan Neofluar 20x/0.50 DICII Plan APO 20x/0.75 DICII Plan Neofluar 40xOil/1.30 DICIII Plan Neofluar 40xOil/1.30 Ph3 Plan APO 63xOil/1.4 DICIII (4)3 个 激 光 器 : 458/477/488/514 nm 543nm 633 nm (5)2 个 光 检 测 器 :3 PMT 荧 光 检 测 器 透 射 光 检 测 器 (6) 仪 器 故 障 : 仪 器 已 经 使 用 13 年, 4 个 PMT 灵 敏 度 都 有 下 降, 现 使 用 Ch3 成 像 ; 自 动 荧 光 滤 片 盘 转 盘 失 灵, 需 要 手 工 切 换 11. NIKON E80i 正 置 荧 光 显 微 镜 (A0436) 仪 器 主 要 用 途 : 主 要 用 于 固 定 标 本 荧 光 图 像 采 集, 包 括 多 标 记 荧 光 图 像 采 集 2D/3D 大 范 围 拼 图 仪 器 配 置 : (1)NIKON Eclipse 80i 正 置 荧 光 显 微 镜, 配 有 电 动 XYZ 载 物 台 (2)3 个 显 微 镜 荧 光 滤 块 : DAPI(Ex.330-380,Em.420,DM 400) EGFP(Ex.450-490HQ,Em.535/40HQ,DM 505) RFP(Ex.545/30HQ,Em.610/75HQ,DM 565) (3)2 个 物 镜 : Plan Fluor 4xNA 0.13 Plan APO 100xOil NA 1.40 (4)Q Imaging Retiga 1300R 制 冷 CCD 12. Neurolucida 正 置 荧 光 显 微 镜 (A0436) 28

仪 器 主 要 用 途 : 固 定 标 本 明 场 ( 彩 色 ) 成 像 2D/3D 大 范 围 拼 图 多 标 记 荧 光 成 像 仪 器 配 置 : (1)NIKON Eclipse E600FN 正 置 荧 光 显 微 镜, 配 有 电 动 XYZ 载 物 台 (2)3 个 显 微 镜 荧 光 滤 块 : DAPI(Ex.330-380,Em.420,DM 400) EGFP(Ex.460-480HQ,Em.505-535HQ,DM 485) RFP(Ex.510-560HQ,Em.590,DM 575) (3)3 个 物 镜 : Plan APO 10x NA 0.45 Plan APO 20x NA 0.75 Plan APO 40x C NA 0.95 (4)Optronics MicroFire 彩 色 CCD 13. NIKON TE-2000e 倒 置 荧 光 显 微 镜 (A0436) 仪 器 主 要 用 途 : 固 定 标 本 荧 光 成 像 多 标 记 荧 光 成 像 2D 大 范 围 拼 图 仪 器 配 置 : (1)NIKON Eclipse TE-2000e 倒 置 荧 光 显 微 镜, 配 有 电 动 XY 载 物 台 (2)4 个 显 微 镜 荧 光 滤 块 : DAPI(Ex.330-380,Em.420,DM 400) EGFP(Ex.455-485HQ,Em.500-545HQ,DM 495) RFP(Ex.540/25HQ,Em.605/55HQ,DM 565) CY5(Ex.620/60HQ,Em.700/75HQ,DM 660) (3)5 个 物 镜 : Plan APO 4x NA 0.2 Plan APO 10x NA 0.45 Plan APO 20x NA 0.75 Plan APO 40x C NA 0.95 Plan APO 60xOil NA 1.40 (4)PCO Sensicam QE CCD 荧 光 显 微 镜 各 种 物 镜 成 像 分 辨 率 (um/pixl) 物 镜 NIKON E80i 正 置 荧 光 显 微 镜 Neurolucida 正 置 荧 光 显 微 镜 NIKON TE-2000e 倒 置 荧 光 显 微 镜 Plan Fluor 4x NA 0.13 1.838310 1.857392 1.607726 Plan APO 4x NA 0.2 Plan APO 10x NA 0.45 0.733113 0.733972 0.639386 Plan APO 20x NA 0.75 0.368166 0.371250 0.322349 29

Plan APO 40x C NA 0.95 0.188679 0.185927 0.162074 Plan APO 60x Oil N.A. 1.40 0.122999 0.107297 Plan APO 100x Oil NA 1.40 0.073965 0.064600 30