第 卷 第 期 年 月 上 海 交 通 大 学 学 报 农 业 科 学 版!"!! $%$ 文 章 编 号 ) 黑 灵 芝 免 疫 调 节 蛋 白 基 因 的 克 隆 和 生 物 信 息 学 分 析 苏 恺 琪 王 雪 飞 周 选 围 上 海 交 通 大 学 农 业 与 生 物 学 院 上 海 摘 要 黑 灵 芝!+$ 是 灵 芝 家 族 中 一 个 重 要 成 员 克 隆 和 分 析 黑 灵 芝 免 疫 调 节 蛋 白 基 因 可 为 进 一 步 了 解 真 菌 免 疫 调 节 蛋 白 在 种 群 中 的 分 布 打 下 基 础 以 黑 灵 芝 为 材 料 采 用 同 源 克 隆 方 法 对 真 菌 免 疫 调 节 蛋 白 3 基 因 进 行 3 扩 增 并 对 其 核 苷 酸 编 码 序 列 进 行 了 生 物 信 息 学 分 析 结 果 表 明 黑 灵 芝 真 菌 免 疫 调 节 蛋 白 基 因 序 列 包 含 可 编 码 个 氨 基 酸 残 基 命 名 为 *%<3<+ 分 子 量 为 5 理 论 等 电 点 为 ( 符 合 3 的 特 性 是 3 家 族 一 新 成 员 对 3<+ 进 行 序 列 分 析 发 现 其 氨 基 酸 序 列 具 有 3 的 保 守 序 列 模 式 与 紫 灵 芝.!$ 紫 芝 小 孢 灵 芝!.!$ 赤 灵 芝 "$+$ 松 杉 灵 芝 $ 金 针 菇 "$""$. 及 草 菇!""!" 的 3 序 列 的 同 源 性 分 别 为 8(8(8(8(88))8 系 统 进 化 树 分 析 表 明 黑 灵 芝 的 3 与 紫 芝 的 3 亲 缘 性 最 高 与 金 针 菇 和 草 菇 的 3 亲 缘 性 相 对 较 远 该 研 究 为 进 一 步 了 解 免 疫 调 节 蛋 白 在 灵 芝 种 群 中 的 分 布 提 供 了 较 详 细 的 数 据 关 键 词 黑 灵 芝 真 菌 免 疫 调 节 蛋 白 基 因 克 隆 生 物 信 息 学 分 析 中 图 分 类 号 ) @ 文 献 标 识 码 3 % $ 13$$ /$$%$:-/%-+.2$%$+.++$$..4-+.+.+ :+%**.$*$%+$--$.3../++*%::-$*.$*/$:!+$ 3++-$:/:/-*-.+*%<./+.+% $+:-+*./$.+.+:%./$.-$.$:./$.+*.$+/-+ *$%/%+-*+$:5/-$.++$:(-%$:./+.+%./++3<+++. **-$:3:+*%/+*.$+/./$:3<+ +-*%+-$-**-$:3:+*%/+3+.!$3 3*!.!$ 3% "$+$ 3 $3:4 "$""$.+.344$!""!"/-:$.$8(8(8 (8(88+.))8./+%-/4%+.%%$./-%+$.-+.+%..$-$..*$%$./-$+3+++/%$-%+$. 3+.3+-$4+.*$-+.:$.+$.:$-:--$:3/$**. 收 稿 日 期 ( 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 ) 作 者 简 介 苏 恺 琪 ( 女 硕 士 生 研 究 方 向 真 菌 生 物 技 术!*+%+.(/. 周 选 围 为 本 文 通 讯 作 者 男 学 士 教 授 研 究 方 向 真 菌 生 物 技 术!*+%1+.$/.
上 海 交 通 大 学 学 报 农 业 科 学 版 第 卷 -$. ()!+$:+%**.$*$%+$--$../%$.$.:$-*++.+% 黑 灵 芝!+$ 是 我 国 灵 芝 资 源 宝 库 中 的 一 个 种 类 在 我 国 有 着 悠 久 的 历 史 其 药 用 价 值 早 在 古 代 就 被 我 国 劳 动 人 民 所 认 识 明 朝 的 李 时 珍 在 本 草 纲 目 中 就 记 载 并 列 举 了 青 芝 赤 芝 白 芝 黄 芝 黑 芝 紫 芝 种 灵 芝 的 药 用 性 能 其 研 究 和 总 结 为 后 人 研 究 灵 芝 奠 定 了 基 础 现 代 研 究 证 明 灵 芝 中 含 有 多 糖 三 萜 类 蛋 白 类 甾 醇 脂 肪 酸 微 量 元 素 等 多 种 营 养 和 药 用 成 分 具 有 广 泛 的 药 理 ) 学 活 性 与 其 他 灵 芝 种 类 一 样 人 们 对 黑 灵 芝 的 研 究 也 多 集 中 在 多 糖 的 提 取 分 离 和 生 理 活 性 的 研 ( 究 从 未 涉 及 有 关 蛋 白 研 究 的 报 道 灵 芝 蛋 白 质 是 一 类 重 要 的 活 性 物 质 主 要 包 括 凝 集 素 真 菌 免 疫 调 节 蛋 白 :+%**.$*$%+$- -$. 3 核 糖 体 失 活 蛋 白 抗 微 生 物 蛋 白 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 等 它 不 仅 是 灵 芝 生 命 活 动 的 重 要 物 质 而 且 具 有 的 独 特 免 疫 原 性 使 其 在 免 疫 调 节 和 抗 肿 瘤 病 等 方 面 具 显 著 效 果 3 最 初 是 从 赤 灵 芝 "$+$ 中 分 离 出 来 的 后 来 相 继 从 松 杉 灵 芝 $ 金 针 菇 "$""$. 草 菇!""!" 中 分 别 纯 化 出 了 种 3 并 从 赤 灵 芝 "$+$ 松 杉 灵 芝 $ 紫 灵 芝.!$ 小 孢 灵 芝!.!$ 紫 芝 金 针 菇 "$" "$. 及 草 菇!""!" 等 物 种 中 分 别 克 隆 了 编 码 3 的 基 因 并 进 行 了 原 核 和 真 核 表 达 研 究 了 其 生 理 活 性 到 目 前 为 止 分 离 出 的 天 然 3 的 基 本 特 征 为 分 子 量 均 为 5 左 右 个 氨 基 酸 残 基 除 赤 灵 芝 "$+$ 的 3 为 糖 蛋 白 含 糖 量 约 为 ) 8 之 外 其 他 3 均 不 是 糖 蛋 白 以 前 的 研 究 表 明 3 的 氨 基 酸 序 列 同 源 性 较 高 一 般 可 达 88 左 右 但 不 同 来 源 的 3 其 生 理 活 性 表 现 出 明 显 的 差 异 为 了 进 一 步 了 解 不 同 来 源 3 免 疫 活 性 的 变 化 特 别 是 灵 芝 属 内 3 的 差 异 和 免 疫 活 性 的 差 异 本 文 以 黑 灵 芝 为 材 料 克 隆 了 编 码 3 蛋 白 的 基 因 *% 并 对 其 进 行 了 生 物 信 息 学 分 析 该 研 究 为 利 用 基 因 工 程 技 术 表 达 3 蛋 白 提 供 了 一 个 新 的 资 源 同 时 也 为 利 用 特 异 基 因 对 灵 芝 进 行 分 类 打 下 基 础 * 材 料 与 方 法 ** 材 料 菌 株 及 主 要 试 剂 黑 灵 芝!+$ 由 上 海 市 农 业 科 学 研 究 院 刘 灶 长 研 究 员 馈 赠 保 存 于 上 海 交 通 大 学 植 物 生 物 技 术 研 究 中 心 胶 回 收 小 量 试 剂 盒 (*% /$- 试 剂 盒 柱 离 心 式 小 量 质 粒 抽 提 试 剂 盒 + 聚 合 酶 3 标 准 分 子 量 及 ) 均 为 宝 生 物 工 程 大 连 有 限 公 司 产 品 *+ 基 因 组 的 提 取 采 用 高 盐 低 法 提 取 黑 灵 芝 基 因 组 步 骤 如 下 用 液 氮 将 菌 丝 体 研 磨 成 粉 末 状 在 材 料 中 加 入 少 许 ) 预 热 的 提 取 缓 冲 液 ) 水 浴 保 温 *. 每 )*. 缓 慢 振 摇 次 在 室 温 下 -*. 离 心 *. 取 上 清 液 加 入 体 积 的 >/)*$% 溶 液 混 匀 后 置 于 保 持 *. -*. 离 心 *. 上 清 液 加 入 等 体 积 的 氯 仿 异 戊 醇 -*. 离 心 *. 使 其 分 层 取 出 水 相 转 入 另 一 离 心 管 加 入 体 积 的 冰 冷 的 异 丙 醇 混 匀 后 置 于 < 过 夜 以 沉 淀 核 酸 用 8 乙 醇 洗 涤 沉 淀 在 空 气 中 干 燥 )*. 将 沉 淀 溶 解 在 ) 的. 水 中 放 置 于 < 保 存 * 真 菌 免 疫 调 节 蛋 白 基 因 的 克 隆 以 提 取 的 黑 灵 芝 基 因 组 为 模 板 进 行 3 扩 增 根 据 已 经 报 道 的 3% 3 ( 基 因 序 列 在 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 合 成 如 下 引 物 3 上 游 引 物 ) 32 下 游 引 物 ) 3 反 应 体 系 包 括 2:- )3 @ )+ 引 物 各 ) 终 体 积 为 )3 反 应 程 序 为 预 变 性 ) *. 后 按 照 )) 进 行 ) 个 循 环 最 后 延 伸 *.3 产 物 在 电 泳 缓 冲 液 下 经
第 期 苏 恺 琪 等 黑 灵 芝 免 疫 调 节 蛋 白 基 因 的 克 隆 和 生 物 信 息 学 分 析 8 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 和 溴 化 乙 锭 染 色 后 用 凝 胶 成 像 系 统 拍 照 电 泳 检 测 回 收 后 连 接 到 ( *% /$- 载 体 并 转 化 到 感 受 态 细 胞 ) 菌 落 3 检 测 的 阳 性 克 隆 送 上 海 英 骏 生 物 工 程 有 限 公 司 进 行 测 序 *- 黑 灵 芝 : 基 因 的 生 物 信 息 学 分 析 基 因 和 蛋 白 质 同 源 性 分 析 核 苷 酸 序 列 翻 译 和 氨 基 酸 序 列 比 对 由 软 件 /$-( 完 成 蛋 白 的 理 化 性 质 及 疏 水 性 分 析 利 用!13 中 的 相 关 工 具 预 测 蛋 白 质 的 三 级 结 构 通 过 2 进 行 预 测 分 子 系 统 进 化 树 在 软 件!) 上 进 行 采 用.$-$.. 方 法 重 复 运 行 次 + 结 果 与 分 析 +*% 基 因 的 克 隆 以 黑 灵 芝 菌 丝 体 为 材 料 提 取 黑 灵 芝 基 因 组 电 泳 检 测 结 果 如 图 从 图 可 以 看 到 提 取 的 黑 灵 芝 较 完 整 以 黑 灵 芝 的 基 因 组 为 模 板 以 332 为 引 物 进 行 3 扩 增 电 泳 图 谱 显 示 大 小 为 左 右 的 条 带 图 此 条 带 与 目 的 片 段 大 小 相 符 合 将 此 条 带 克 隆 后 经 菌 落 3 检 测 为 阳 性 克 隆 图 阳 性 克 隆 测 序 结 果 见 图 经 /$-( 软 件 分 析 表 明 黑 灵 芝 3 基 因 长 度 为 编 码 个 氨 基 酸 ++:+ 和 其 他 :+ 的 同 源 性 分 析 采 用 /$-( 对 3+ 和 其 他 3 进 行 了 同 源 性 分 析 图 ) 其 他 3 的 序 列 来 自.2+.5 如 紫 灵 芝.!$ ( 的 3+ 赤 灵 芝 "$+$ ) 的 3% 来 自 金 针 菇 "$.2( 的 3:4 和 已 发 表 的 文 献 如 紫 芝 的 3 小 孢 灵 芝!.!$ 的 3* 松 杉 灵 芝 $ 的 3 草 菇!" 的 344$ ) 结 果 显 示 出 不 同 真 菌 免 疫 调 节 蛋 白 的 氨 基 酸 序 列 具 有 一 定 的 同 源 性 其 中 3+ 和 33+ 3*33% 同 源 性 较 高 大 于 ()8 分 别 为 8(8(8(8(8 而 与 3:4 和 344$ 的 同 源 性 较 低 分 别 为 8))8 序 列 同 源 性 的 比 对 结 果 表 明 黑 灵 芝 和 紫 芝 的 亲 缘 性 很 高 推 测 黑 灵 芝 属 于 紫 芝 组 灵 芝 组 和 紫 芝 组 之 间 的 氨 基 酸 序 列 差 别 (8 图 )3+ 与 紫 芝 组 的 同 源 性 为 (8 与 灵 芝 组 的 同 源 性 为 (8 图 黑 灵 芝 基 因 组 泳 道 +-5-) 泳 道 黑 灵 芝 基 因 组!+$.$*/ +.*+-5-)+.!+$.$*/ 图 基 因 组 3 产 物 的 电 泳 图 泳 道 +-5- 泳 道 *% 目 的 基 因!+$.$*/3-$/ +.*+-5-+.*%. 图 菌 落 3 检 测 电 泳 图 泳 道 +-5- 泳 道 <) 3 阳 性 检 测 泳 道 阴 性 对 照!%/-$$-$:/$%$.3-$/ +.*+-5-+.<)$%$. 3-$/+.+4/$.-$%
@ 上 海 交 通 大 学 学 报!农 业 科 学 版" 第!"卷 图?!黑灵芝 核酸序列和推导氨基酸序列 N B X 8?!)N 图A! 和其他种的 氨基酸序列比对结果 注黑色背景和*(表示@种 完全一致的氨基酸序列%灰色背景表示和 一致的氨基酸%*4表示灵芝属内!来自 + 38?++ "?"%!来自 ] 8 "%!来自 ]L +3?"%!来自 ] " (+ 8"% N L!来自 ] 4?"% 3?" 个序列一致的氨基酸*)表示紫芝组和灵芝组$组之间的差别氨基酸 B!来自 ]? 3 A!^N XB X \ H H 8 B / N X B B I BNB B \ B 81H B B!!) B Y: H H\ : S: S N m(m% H B \ H H\ Y : S N8*4 B B! + 38?++ "? "%! ] 8 "%! ] L +3?"%! ]" (+ 8"% N! ]4?"% ]? 3?"8*) X X B B! L 3 8 3 8?+ N: 8+ 38?+] : \ N: 81+
第 期 苏 恺 琪 等 黑 灵 芝 免 疫 调 节 蛋 白 基 因 的 克 隆 和 生 物 信 息 学 分 析 +:+ 的 结 构 分 析 经!1+ 相 关 软 件 预 测 1+$-$$%-$+-+**%3+ 的 氨 基 酸 残 基 为 个 分 子 量 为 )5 这 与 3 蛋 白 具 有 5 氨 基 酸 的 结 论 相 吻 合 3+ 的 理 论 等 电 点 为 ( 不 含 胱 氨 酸 和 组 氨 酸 却 富 含 天 冬 氨 酸 和 缬 氨 酸 +% 疏 水 性 分 析 结 果 表 明 3+ 第 ( 位 的 甘 氨 酸 % 亲 水 性 最 强 < 第 ( 位 苯 丙 氨 酸 3 疏 水 性 最 强 (3+ 的 整 体 结 构 表 现 出 亲 水 性 但 其 端 和 端 是 疏 水 的 图 通 过 $*+ 方 法.+%/:-/./-$*+ % 预 测 了 3+ 的 二 级 结 构 其 二 级 结 构 包 括 8 螺 旋 )8 延 伸 链 和 ))8 无 规 则 盘 绕 螺 旋 最 长 的 线 主 要 存 在 于 端 无 规 则 盘 绕 最 短 的 线 贯 穿 于 整 个 3+ 序 列 是 最 重 要 的 结 构 元 素 而 延 伸 链 中 长 的 线 则 分 散 在 序 列 中 图 2 通 过 / 网 站 / 5-4/+-+ 对 3+ 进 行 三 维 结 构 预 测 表 明 空 间 结 构 与 3* 链 >B 结 晶 体 结 构 相 似 图 +- 分 子 系 统 进 化 树 将 3+ 和 其 他 几 种 已 知 的 3 用! 图 3+ 蛋 白 质 序 列 疏 水 区 域 分 布 预 测 图 疏 水 性 峰 大 于 零 亲 水 性 峰 小 于 零 23+ 的 二 级 结 构 图 螺 旋 延 伸 链 无 规 则 盘 绕 分 别 用 长 中 短 线 表 示 3+ 三 级 结 构 预 测 图 -$$/+-+:$-/+*+$:3+-$. -$$/+5-+-+.-$+.-$%/+5%+.-$2$*.$.+%-/-%11.-+.+. -+.$*/$%+-./+%$./$.%$.+.$-4-/+%%.-/4%3-/3+-*.$.+%*$%
上 海 交 通 大 学 学 报 农 业 科 学 版 第 卷 ) 软 件 /%+%B 比 对 后 采 用 方 法 进 行 分 子 系 统 进 化 分 析 重 复 次 数 次 构 建 系 统 进 化 树 图 从 图 中 可 以 看 出 3+ 的 推 导 氨 基 酸 序 列 与 紫 芝 3 紫 灵 芝.!$3+ 氨 基 酸 序 列 在 进 化 上 很 接 近 同 属 于 紫 芝 组 而 赤 灵 芝 "$+$3% 和 松 杉 灵 芝 $3 同 属 于 灵 芝 组 3 * 处 于 组 之 间 3+ 与 3:4 和 344$ 亲 缘 性 较 远 讨 论 图 3+ 的 分 子 系 统 进 化 树 3%$./-$:3+ 本 试 验 根 据 已 报 道 的 3 的 基 因 序 列 在 其 ) 和 端 设 计 引 物 扩 增 出 黑 灵 芝 *% 基 因 的 编 码 区 序 列 通 过 软 件 /$-( 分 析 *% 基 因 序 列 与 *% 基 因 的 同 源 性 达 到 了 (8 经 过 氨 基 酸 序 列 比 对 发 现 黑 灵 芝 的 3+ 与 3 氨 基 酸 序 列 仅 有 个 差 别 和 3+ 有 个 氨 基 酸 差 别 这 与 柳 永 等 认 为 灵 芝 免 疫 调 节 蛋 白 在 灵 芝 亚 属 各 个 种 中 保 守 性 较 高 的 结 论 相 一 致 同 时 也 证 明 了 利 用 3 对 灵 芝 进 行 分 类 是 可 行 和 可 靠 的 神 农 本 草 经 是 最 早 提 出 灵 芝 分 类 的 著 作 主 要 根 据 子 实 体 颜 色 将 灵 芝 分 为 六 芝 青 芝 赤 芝 白 芝 黄 芝 黑 芝 紫 芝 虽 然 这 种 分 类 和 现 代 科 学 灵 芝 的 分 类 完 全 是 两 回 事 但 它 却 给 后 来 灵 芝 的 分 类 和 研 究 以 有 益 的 启 迪 奠 定 了 以 形 态 特 征 为 依 据 的 分 类 设 想 根 据 形 态 学 及 担 孢 子 的 特 征 对 灵 芝 属 进 行 分 类 灵 芝 属 可 分 为 灵 芝 亚 属 树 舌 灵 芝 亚 属 和 粗 皮 灵 芝 亚 属 其 中 灵 芝 亚 属 又 分 为 灵 芝 组 和 紫 芝 组 近 年 来 随 着 分 子 生 物 学 技 术 的 发 展 灵 芝 属 的 分 类 学 研 究 已 逐 步 由 表 型 观 察 深 入 到 核 酸 水 平 苏 春 丽 等 用 < 微 管 蛋 白 基 因 部 分 序 列 对 灵 芝 属 菌 株 的 亲 缘 关 系 进 行 探 讨 将 黑 灵 芝 归 于 紫 芝 ) 组 这 与 本 研 究 的 结 果 是 一 致 的 而 赵 明 文 等 利 用 3 技 术 对 生 产 中 常 用 的 灵 芝 属 ( 个 菌 株 的 亲 缘 关 系 进 行 了 分 析 根 据 3 构 建 的 树 状 图 表 明 ( 个 菌 株 在 较 低 的 相 似 水 平 上 可 以 分 成 个 明 显 不 同 的 组 其 中 黑 灵 芝 $ 松 杉 灵 芝 $ 圆 芝!$+$ 灵 芝 "$+$ 和 韩 国 灵 芝 "$+$ 被 分 为 同 一 组 也 就 是 说 黑 灵 芝 和 赤 灵 芝 的 亲 缘 关 系 较 近 这 一 结 论 和 我 们 本 研 究 的 结 果 存 在 一 定 的 出 入 本 研 究 根 据 灵 芝 免 疫 调 节 蛋 白 的 序 列 的 分 析 认 为 3+ 与 紫 芝 的 3 和 紫 灵 芝 的 3+ 氨 基 酸 序 列 在 进 化 上 很 接 近 有 可 能 从 同 一 祖 先 平 行 进 化 而 来 与 3% 和 3 所 属 的 灵 芝 组 较 远 而 与 3:4 和 344$ 亲 缘 性 更 远 所 以 初 步 认 为 黑 灵 芝 属 于 紫 芝 组 本 研 究 利 用 生 物 信 息 学 方 法 对 黑 灵 芝 免 疫 调 节 蛋 白 基 因 推 导 的 氨 基 酸 序 列 从 氨 基 酸 组 成 理 化 性 质 疏 水 性 二 级 和 三 级 结 构 等 方 面 进 行 了 预 测 与 分 析 为 后 期 3+ 氨 基 酸 序 列 的 结 构 性 质 及 蛋 白 质 空 间 结 构 的 实 验 研 究 提 供 了 一 定 的 理 论 参 考 依 据 并 为 进 一 步 研 究 3+ 的 表 达 和 功 能 奠 定 基 础 对 深 入 了 解 黑 灵 芝 免 疫 调 节 蛋 白 基 因 结 构 与 功 能 之 间 的 相 关 性 有 着 深 远 的 意 义 参 考 文 献 周 选 围 林 娟 中 国 野 生 灵 芝 资 源 的 开 发 利 用 食 用 菌 学 报 )( 周 选 围 林 娟 周 良 灵 芝 主 要 营 养 成 分 的 测 定 分 析 陕 西 师 范 大 学 学 报 ( 田 光 辉 林 娟 陈 文 强 等 野 生 与 栽 培 灵 芝 挥 发 油 成 分 的 分 析 中 国 食 用 菌 ( 黄 为 群 吴 其 威 黄 瑞 珊 等 灵 芝 菌 发 酵 产 物 中 多 糖 组 分 的 分 离 与 性 质 研 究 上 海 交 通 大 学 学 报 ((( ) $ B.".""+.$-*++/ +.+-+%-$/+.--%++-*+/$%$/+% :./$.(-*-./+ )))) B3 ""!+$ $%+//+-+.+$1+4-./ +%+/$.*$-+.4.(( )(."B$%:+.2B""+.$-*+ //-*.+$.+%*$/-$*+$-+/ :.--..$.+$.+-+:/.
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