正 常 人 类 细 胞 的 特 性 内 皮 细 胞 : 平 滑 肌 细 胞 : 脂 细 胞 : 软 骨 细 胞 : 成 骨 细 胞 : 骨 骼 肌 细 胞 : 成 纤 维 细 胞 : 鼻 上 皮 细 胞 : 黑 素 细 胞 : 真 皮 毛 囊 乳 头 细 胞 : 正 常 人 类 细 胞 源 组 织 定 位 肉 皮 细 胞 : 平 滑 肌 细 胞 : 脂 细 胞 : 软 骨 细 胞 : 成 骨 细 胞 : 骨 骼 肌 细 胞 : 正 常 人 类 细 胞 的 培 养 及 培 养 技 巧 Van Willebrand 因 子 平 滑 肌 а 肌 动 蛋 白 中 性 脂 肪, 瘦 素 (leptin) II 型 胶 原 骨 钙 素 (Osteocalcin) 肌 球 蛋 白 CD90 广 谱 角 蛋 白 (pan-cytokeratin) 黑 色 素 碱 性 磷 酸 酶 相 应 不 同 类 型 的 血 管 相 应 不 同 类 型 的 血 管 腹 部 真 皮 脂 肪 组 织 腹 部 或 膝 盖 部 软 骨 腹 部 或 膝 盖 部 骨 骼 股, 颈 或 臀 部 肌 肉 成 纤 维 细 胞 : 真 皮 ( 阴 茎 包 皮 ) 鼻 上 皮 细 胞 : 鼻 膈 膜 或 鼻 腺 黑 素 细 胞 : 真 皮 ( 阴 茎 包 皮 ) 培 养 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 (HUVEC) 和 人 真 皮 微 血 管 内 皮 细 胞 (HDMEC) 培 养 正 常 人 类 细 胞 是 无 需 包 埋 培 养 皿 的, 因 为 所 有 的 培 养 基 都 由 复 杂 的 营 养 成 分 组 成, 它 们 可 以 使 细 胞 在 无 预 包 被 的 培 养 皿 中 正 常 的 生 长 培 养 正 常 人 类 细 胞 时 需 要 何 种 温 度 和 CO 2 浓 度 正 常 人 类 细 胞 株 需 要 在 37 5%CO 2 浓 度 及 湿 润 的 环 境 中 进 行 培 养 请 注 意 : 如 果 使 用 细 胞 培 养 瓶, 则 将 瓶 盖 拧 松 半 圈 以 保 证 空 气 流 通 正 常 人 类 细 胞 的 冷 冻 正 常 人 类 细 胞 可 以 冷 冻 但 不 推 荐 冷 冻, 因 为 每 次 冷 冻 都 会 导 致 增 殖 能 力 的 部 分 损 失 如 果 想 冷 冻 细 胞, 请 使 用 无 血 清 冷 冻 培 养 基, 这 是 我 们 在 自 己 的 细 胞 培 养 实 验 室 里 也 会 用 到 的 一 种 冷 冻 培 养 基
不 可 以 将 细 胞 培 养 基 冷 冻 保 存 冷 冻 将 导 致 培 养 基 成 分 不 可 逆 的 沉 淀 作 用 收 到 冷 冻 细 胞 的 处 理 简 明 的 程 序 : 将 冷 冻 细 胞 从 存 有 干 冰 的 货 运 容 器 中 取 出, 立 即 转 入 液 氮 中 这 个 转 移 的 过 程 要 尽 可 能 的 短 不 要 将 细 胞 储 存 在 -80 条 件 下, 这 会 造 成 细 胞 不 可 逆 的 损 伤 用 胰 酶 来 进 行 正 常 人 类 细 胞 的 传 代 培 养 每 批 胰 酶 溶 液 都 用 以 正 常 人 类 细 胞 株 进 行 过 测 试 使 用 其 它 的 胰 酶 溶 液 可 能 会 造 成 细 胞 不 可 逆 的 损 伤 由 于 胰 酶 消 化 后 细 胞 的 产 生 是 不 同 的 我 们 推 荐 在 胰 酶 消 化 后 进 行 细 胞 记 数, 以 每 cm 2 接 种 5,000-10,000 个 细 胞 为 宜 正 常 人 类 细 胞 可 以 进 行 阶 段 性 的 饥 饿 实 验 正 常 人 类 细 胞 可 以 进 行 阶 段 性 的 饥 饿 实 验 细 胞 可 以 在 无 任 何 添 加 剂 的 基 础 培 养 基 上 存 活 一 段 时 间, 但 是 必 须 提 供 好 的 培 养 条 件 一 段 时 间 以 后 必 须 停 止 实 验, 延 长 实 验 时 间 会 导 致 细 胞 死 亡 建 议 在 实 验 进 行 以 前 测 试 一 下 细 胞 可 以 耐 受 饥 饿 的 时 间 长 短, 而 这 个 时 间 长 短 受 诸 多 因 素 的 影 响 用 无 血 清 冷 冻 培 养 基 对 正 常 人 类 细 胞 株 进 行 冷 冻 贮 存 在 无 血 清 细 胞 培 养 系 统 中, 有 一 点 很 关 键 : 低 温 贮 存 也 须 要 在 无 血 清 冷 冻 培 养 基 而 不 是 含 血 清 培 养 基 上 进 行 使 用 普 通 的 含 血 清 冷 冻 培 养 基 时, 血 清 会 长 时 间 影 响 细 胞 培 养 可 以 通 过 继 代 培 养 即 稀 释 的 方 法 来 消 除 这 种 影 响 无 血 清 冷 冻 培 养 基 适 合 人 体 或 动 物 细 胞, 以 DMSO 甲 基 纤 维 素 及 其 它 防 冻 成 分 取 代 血 清 经 过 低 温 贮 存 和 解 冻 后 的 细 胞 株 仍 然 可 以 得 到 很 高 的 细 胞 得 率 无 血 清 冷 冻 培 养 基 上 的 细 胞 解 冻 后 也 能 表 现 出 和 正 常 培 养 细 胞 一 样 优 秀 的 附 着 能 力
问 题 指 南 在 培 养 正 常 人 类 细 胞 株 的 过 程 中 需 要 丰 富 的 经 验 才 能 获 得 很 高 的 细 胞 得 率 如 果 仔 细 研 读 过 指 导 手 册, 很 多 常 见 的 错 误 都 能 够 避 免 利 用 下 面 的 表 格 来 对 照 分 析 培 养 结 果 不 理 想 的 原 因, 并 改 善 以 后 的 培 养 方 法 问 题 可 能 的 原 因 细 胞 不 附 壁 或 附 壁 效 率 低 冷 冻 过 程 中 细 胞 受 到 损 伤 不 适 当 的 低 温 贮 存 解 冻 过 程 中 细 胞 受 到 损 伤 胰 酶 /EDTA 损 伤 细 胞 胰 酶 消 化 过 程 中 培 养 物 过 度 融 合 不 适 宜 的 培 养 基 配 方 设 计 解 决 方 法 确 保 冷 冻 过 程 以 每 min1 的 速 率 进 行, 并 使 用 专 为 正 常 人 类 细 胞 株 设 计 的 低 温 贮 存 培 养 基 低 温 贮 存 的 细 胞 应 贮 存 于 液 氮 中,-80 只 适 于 短 期 运 输 过 程 解 冻 时 应 迅 速 在 37 水 浴 中 进 行, 解 冻 后 细 胞 应 立 即 转 入 准 备 好 的 培 养 基 中 ( 不 要 在 冷 冻 的 小 瓶 内 进 行 离 心 ) ) 在 室 温 下 使 用 胰 酶 /EDTA 胰 酶 消 化 时 间 不 要 超 过 7min 推 荐 0.04% 或 0.03% 的 胰 酶 /EDTA 确 保 胰 酶 消 化 到 融 合 70-90% 即 可 使 用 推 荐 的 针 对 各 细 胞 株 优 化 过 的 培 养 基 细 胞 不 分 散 或 分 散 效 率 低 胰 酶 /EDTA 失 活 或 温 度 太 低 在 室 温 下 使 用 胰 酶 /EDTA 胰 酶 /EDTA 的 不 适 当 贮 存 胰 酶 在 -20 下 分 装 贮 藏, 溶 液 解 冻 至 室 温 作 用 时 间 太 短 胰 酶 /EDTA 的 作 用 时 间 再 长 一 些 胰 酶 /EDTA 被 中 和 了 胰 酶 消 化 前 用 HepesBSS 冲 洗, 去 除 会 中 和 的 蛋 白 质 细 胞 生 长 过 慢 培 养 基 改 变 或 血 清 条 件 改 变 检 查 培 养 基 中 任 何 成 分 的 变 化
培 养 过 程 中 细 胞 死 亡 不 合 理 的 培 养 基 配 方 设 计 培 养 基 或 生 长 因 子 的 不 合 理 的 贮 存 接 种 率 太 低 胰 酶 消 化 过 程 中 培 养 物 过 度 融 合 细 胞 老 化 使 用 推 荐 的 针 对 各 细 胞 株 优 化 过 的 4-8 下 贮 存 基 础 培 养 基,-20 下 贮 存 生 长 因 子, 已 添 加 生 长 因 子 的 培 养 基 在 4-8 下 贮 存 不 要 超 过 6 周 使 用 前 只 需 预 热 分 装 好 的 使 用 量 确 保 培 养 过 程 使 用 了 推 荐 的 接 种 率 通 过 细 胞 记 数 来 检 查 接 种 率 确 保 胰 酶 消 化 到 融 合 70-90% 即 可 丢 弃 细 胞 培 养 物, 开 始 新 批 次 的 培 养 不 适 合 的 培 养 条 件 (ph, 温 度 ) 检 查 培 养 容 器 中 CO 2 的 浓 度 及 温 度 毒 素 代 谢 的 积 累 每 2-3 天 换 依 次 培 养 基 附 加 生 长 因 子 的 培 养 基 保 存 期 附 加 生 长 因 子 的 培 养 基 在 添 加 补 充 成 分 后 可 以 在 4 下 保 存 6 周 使 用 前 取 出 使 用 量 进 行 37 预 热, 剩 下 的 部 分 仍 然 在 大 瓶 内 保 存 在 4 下 源 细 胞 培 养 基 在 使 用 前 至 少 保 持 室 温 如 果 您 想 预 热 到 37, 请 避 免 使 用 不 可 调 控 的 热 培 养 基 需 要 多 久 更 换 一 次 培 养 基 每 2-3 天 就 需 要 更 换, 绝 大 部 分 的 实 验 室 在 每 周 一 三 五 进 行 更 换 培 养 基 请 注 意 : 低 温 贮 藏 的 细 胞 在 解 冻 后, 第 一 次 培 养 基 更 换 需 要 在 接 种 24 小 时 后 进 行, 以 防 细 胞 被 残 留 的 低 温 培 养 基 损 伤 细 胞 因 子 的 稳 定 性 细 胞 因 子 除 非 我 们 的 产 品 说 明 里 特 别 提 及, 我 们 所 有 的 产 品 都 是 冻 干 粉 形 式, 在 室 温 下 都 十 分 稳 定 短 期 贮 存 ( 一 个 月 内 ) 可 以 在 4 下 进 行, 长 期 贮 存 则 推 荐 在 -20 下 进 行 不 推 荐 在 -50 以 下 的 温 度 条 件 下 进 行 贮 存 对 于 大 多 数 产 品 的 溶 液 来 说, 推 荐 4 下 进 行 短 期 贮 存, 长 期 贮 存 时 推 荐 将 蛋 白 溶 液 分 装 后 在 -20 下 贮 存, 以 避 免 反 复 冻 融 请 记 住, 每 次 冻 融 都 会 导 致 蛋 白 的 部 分 变 性
以 ED 50 或 units/ml 来 表 示 活 性 表 达 时 有 的 联 系 半 数 有 效 量,ED 50, 定 义 为 达 到 最 大 反 应 活 性 的 50% 时 细 胞 因 子 的 浓 度 这 种 表 达 方 法 只 适 用 于 S 形 动 力 曲 线 的 细 胞 因 子 将 ED 50 (ng/ml) 转 化 为 比 活 力 units/mg 的 公 式 是 : 1 10 6 /ED50(ng/mL)= 比 活 力 (units/mg) 细 胞 因 子 具 有 物 种 间 的 交 叉 活 性 除 了 少 数 例 外, 大 多 数 人 类 细 胞 因 子 在 小 鼠 细 胞 中 都 有 活 力 许 多 小 鼠 细 胞 因 子 在 人 类 细 胞 中 也 有 活 力 表 现, 但 是 与 相 应 的 人 类 细 胞 因 子 相 比 其 比 活 力 较 低 一 些 人 类 的 细 胞 因 子 如 IL-7 在 小 鼠 细 胞 中 甚 至 表 现 出 比 相 应 的 小 鼠 细 胞 因 子 更 高 的 比 活 力 而 干 扰 素 如 GM-CSF IL-3 和 IL-4 是 物 种 特 异 性 的, 在 非 人 类 细 胞 中 几 乎 没 有 活 性 相 反, 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 (FGFs) 和 神 经 营 养 素 是 高 度 保 守 的, 在 其 它 的 动 物 物 种 细 胞 中 也 能 表 现 很 好 的 活 性