权 利 要 求 书 1/1 页 1. 一 种 调 节 植 物 的 叶 倾 角 大 小 的 方 法, 所 述 方 法 包 括 : 调 节 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达, 所 述 的 LC1 蛋 白 是 氨 基 酸 序 列 如 SEQ ID NO:2 的 蛋 白 2. 如 权 利 要 求 1

(19) 中 华 人 民 共 和 国 国 家 知 识 产 权 局 (12) 发 明 专 利 (21) 申 请 号 201110087233.6 (22) 申 请 日 2011.04.07 (10) 授 权 公 告 号 CN 102732551 B (45) 授 权 公 告 日 2014.08.27 期 ),853-860. 审 查 员 安 玉 苹 (73) 专 利 权 人 中 国 科 学 院 上 海 生 命 科 学 研 究 院 地 址 200031 上 海 市 徐 汇 区 岳 阳 路 320 号 (72) 发 明 人 薛 红 卫 赵 淑 青 (74) 专 利 代 理 机 构 上 海 专 利 商 标 事 务 所 有 限 公 司 31100 代 理 人 陈 静 (51)Int.Cl. C12N 15/82 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01) C07K 14/415 (2006.01) C12N 15/29 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01) (56) 对 比 文 件 CN 101177683 A,2008.05.14, CN 101921777 A,2010.12.22, 罗 伟 等. 水 稻 抽 穗 期 功 能 叶 叶 型 相 关 性 状 遗 传 分 析. 分 子 植 物 育 种.2008, 第 6 卷 ( 第 5 权 利 要 求 书 11 页 说 明 书 15 15 页 页 序 列 表 99 页 附 图 4 页 4 页 (54) 发 明 名 称 一 种 植 物 叶 倾 角 调 控 基 因 及 其 用 途 (57) 摘 要 本 发 明 涉 及 一 种 植 物 叶 倾 角 调 控 基 因 及 其 用 途 本 发 明 首 次 发 现 LC1 基 因 对 于 植 物 的 叶 倾 角 起 到 了 调 节 作 用 因 此, 可 以 将 LC1 基 因 应 用 于 植 物 的 改 良 培 育 中, 选 育 出 具 有 特 定 品 质 性 状 的 品 种 CN 102732551 B

权 利 要 求 书 1/1 页 1. 一 种 调 节 植 物 的 叶 倾 角 大 小 的 方 法, 所 述 方 法 包 括 : 调 节 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达, 所 述 的 LC1 蛋 白 是 氨 基 酸 序 列 如 SEQ ID NO:2 的 蛋 白 2. 如 权 利 要 求 1 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于, 所 述 方 法 包 括 : 提 高 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达 ; 从 而 调 节 植 物 的 叶 倾 角 增 大 3. 如 权 利 要 求 1 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于, 包 括 : 将 编 码 LC1 蛋 白 的 多 核 苷 酸 转 入 植 物, 获 得 转 化 入 所 述 多 核 苷 酸 的 植 物 4. 如 权 利 要 求 3 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于, 包 括 : (S1) 提 供 携 带 表 达 载 体 的 农 杆 菌, 所 述 的 表 达 载 体 含 有 多 核 苷 酸, 其 编 码 LC1 蛋 白 ; (S2) 将 植 物 的 细 胞 或 组 织 或 器 官 与 步 骤 (S1) 中 的 农 杆 菌 接 触, 从 而 使 所 述 的 多 核 苷 酸 转 入 植 物 5. 如 权 利 要 求 1 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于, 所 述 方 法 包 括 : 降 低 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达 ; 从 而 调 节 植 物 的 叶 倾 角 减 小 6. 如 权 利 要 求 5 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于, 所 述 降 低 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达 包 括 : 将 下 调 所 述 LC1 蛋 白 的 编 码 序 列 表 达 的 干 扰 分 子 转 入 植 物 细 胞 组 织 器 官, 从 而 下 调 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达 7. 如 权 利 要 求 6 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于, 所 述 方 法 包 括 : (i) 提 供 携 带 可 干 扰 基 因 表 达 的 载 体 的 农 杆 菌, 所 述 的 载 体 选 自 下 组 : (a) 含 有 反 方 向 启 动 的 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 或 基 因 片 段 的 载 体 ; (b) 含 有 可 在 植 物 体 内 形 成 特 异 性 干 扰 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 表 达 的 成 分 的 干 扰 分 子 的 载 体 ; (ii) 将 植 物 的 细 胞 组 织 或 器 官 与 步 骤 (i) 中 的 农 杆 菌 接 触, 从 而 使 所 述 载 体 转 入 植 物 8. 一 种 LC1 蛋 白 或 其 编 码 基 因 的 用 途, 用 于 调 节 植 物 的 叶 倾 角 ; 或 用 于 制 备 调 节 植 物 的 叶 倾 角 的 材 料 ; 所 述 的 LC1 蛋 白 是 氨 基 酸 序 列 如 SEQ ID NO:2 的 蛋 白 9. 如 权 利 要 求 8 所 述 的 用 途, 其 特 征 在 于, 所 述 的 LC1 蛋 白 或 其 编 码 基 因 用 于 调 节 植 物 的 叶 倾 角 增 大 ; 或 所 述 的 LC1 蛋 白 或 其 编 码 基 因 用 于 制 备 调 节 植 物 叶 倾 角 减 小 的 材 料 10. 含 有 反 方 向 启 动 的 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 的 载 体 的 用 途, 用 于 调 节 植 物 的 叶 倾 角 减 小 ; 所 述 的 LC1 蛋 白 是 氨 基 酸 序 列 如 SEQ ID NO:2 的 蛋 白 11. 含 有 编 码 LC1 蛋 白 的 多 核 苷 酸 的 表 达 载 体 的 用 途, 用 于 调 节 植 物 的 叶 倾 角 增 大 的 物 质 ; 所 述 的 LC1 蛋 白 是 氨 基 酸 序 列 如 SEQ ID NO:2 的 蛋 白 12. 一 种 LC1 蛋 白 或 其 编 码 基 因 用 途, 用 于 作 为 鉴 定 植 物 的 叶 倾 角 大 小 的 分 子 标 记 ; 所 述 的 LC1 蛋 白 是 氨 基 酸 序 列 如 SEQ ID NO:2 的 蛋 白 2

说 明 书 1/15 页 一 种 植 物 叶 倾 角 调 控 基 因 及 其 用 途 技 术 领 域 [0001] 本 发 明 属 于 生 物 技 术 和 植 物 学 领 域 ; 更 具 体 地, 本 发 明 涉 及 一 种 植 物 叶 倾 角 调 控 基 因 其 用 途 以 及 调 控 植 物 叶 倾 角 大 小 的 基 因 工 程 方 法 背 景 技 术 [0002] 水 稻 是 重 要 的 粮 食 作 物, 同 时 也 是 单 子 叶 植 物 的 模 式 植 物 育 种 实 践 表 明, 水 稻 株 型 与 产 量 密 切 相 关, 理 想 的 株 型 是 高 产 的 形 态 和 物 质 基 础 水 稻 叶 倾 角 通 常 是 指 叶 片 和 植 株 茎 秆 之 间 的 夹 角, 是 构 成 水 稻 株 型 的 重 要 组 成 部 分 叶 倾 角 的 大 小 特 别 是 剑 叶 倾 角 的 大 小 对 水 稻 的 光 合 生 产 量 有 很 大 影 响 : 研 究 表 明, 叶 片 直 立 有 利 于 叶 片 两 面 受 光, 减 少 阳 光 反 射 率, 增 加 透 光 度, 并 促 进 种 子 灌 浆 时 期 的 氮 源 储 藏 增 加, 从 而 增 加 产 量, 剑 叶 直 立 更 是 被 看 作 改 善 群 体 光 照 的 重 要 条 件, 直 接 影 响 到 稻 穗 的 营 养 转 化, 因 此 剑 叶 直 立 是 理 想 株 型 的 一 个 指 标 [0003] 水 稻 的 第 一 片 叶 为 不 完 全 叶, 仅 有 叶 鞘, 以 后 各 叶 都 具 有 叶 片 和 叶 鞘 叶 片 基 部 存 在 白 色 缺 少 叶 绿 素 的 带 状 部 分, 叫 叶 枕 这 部 分 组 织 主 要 由 中 脉 组 成, 也 有 少 量 叶 片 组 织 存 在 在 水 稻 发 育 过 程 中, 叶 片 和 叶 鞘 充 分 伸 长 之 后, 叶 枕 部 位 近 轴 面 的 细 胞 开 始 延 伸, 从 而 使 叶 片 从 叶 鞘 的 垂 直 轴 弯 向 远 轴 端, 弯 向 叶 鞘 形 成 叶 倾 角 [0004] 已 有 的 研 究 表 明 叶 倾 角 发 育 受 到 分 子 水 平 和 激 素 特 别 是 油 菜 素 内 酯 等 多 方 面 的 调 控, 对 倾 角 形 成 的 分 子 机 理 研 究 有 利 于 指 导 育 种 实 践 因 此, 找 到 调 节 叶 倾 角 大 小 的 调 控 基 因 对 于 植 物 改 良 育 种 是 有 积 极 意 义 的 发 明 内 容 [0005] 本 发 明 的 目 的 在 于 提 供 一 种 植 物 叶 倾 角 调 控 基 因 及 其 用 途 [0006] 在 本 发 明 的 第 一 方 面, 提 供 一 种 调 节 植 物 的 叶 倾 角 大 小 的 方 法, 所 述 方 法 包 括 : 调 节 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达 [0007] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 植 物 选 自 ( 但 不 限 于 ) : 禾 本 科 植 物 [0008] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 禾 本 科 植 物 是 水 稻, 小 麦, 大 麦, 玉 米, 高 粱 [0009] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 LC1 蛋 白 是 : [0010] (a) 如 SEQ ID NO :2 氨 基 酸 序 列 的 蛋 白 ; [0011] (b) 将 SEQ ID NO :2 氨 基 酸 序 列 经 过 一 个 或 多 个 ( 如 1-20 个 ; 较 佳 地 1-10 ; 更 佳 地 1-5 个 ) 氨 基 酸 残 基 的 取 代 缺 失 或 添 加 而 形 成 的, 且 具 有 (a) 蛋 白 功 能 的 由 (a) 衍 生 的 蛋 白 ; 或 [0012] (c) 与 (a) 限 定 的 蛋 白 序 列 有 90% 以 上 同 源 性 且 具 有 (a) 蛋 白 功 能 的 由 (a) 衍 生 的 蛋 白 [0013] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 LC1 的 编 码 基 因 的 核 苷 酸 序 列 如 SEQ ID NO :1 所 示 [0014] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 方 法 包 括 : 提 高 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达 ; 从 而 调 节 植 物 的 叶 倾 角 增 大 3

说 明 书 2/15 页 [0015] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 方 法 包 括 : 将 编 码 LC1 蛋 白 的 多 核 苷 酸 转 入 植 物, 获 得 转 化 入 所 述 多 核 苷 酸 的 植 物 [0016] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 方 法 包 括 : [0017] (S1) 提 供 携 带 表 达 载 体 的 农 杆 菌, 所 述 的 表 达 载 体 含 有 多 核 苷 酸, 其 编 码 LC1 蛋 白 ; [0018] (S2) 将 植 物 的 细 胞 或 组 织 或 器 官 与 步 骤 (S1) 中 的 农 杆 菌 接 触, 从 而 使 所 述 的 多 核 苷 酸 转 入 植 物 [0019] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 方 法 还 包 括 : [0020] (S3) 选 择 出 转 入 了 所 述 的 多 核 苷 酸 的 植 物 细 胞 组 织 器 官 ; 和 [0021] (S4) 将 步 骤 (S3) 中 的 植 物 细 胞 组 织 器 官 或 种 子 再 生 成 植 物 [0022] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 方 法 包 括 : 降 低 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达 ; 从 而 调 节 植 物 的 叶 倾 角 减 小 [0023] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 降 低 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达 包 括 : [0024] 将 下 调 所 述 LC1 蛋 白 的 编 码 序 列 表 达 ( 或 转 录 ) 的 干 扰 分 子 ( 包 括 反 义 分 子 ) 转 入 植 物 细 胞 组 织 器 官, 从 而 下 调 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达 [0025] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 方 法 包 括 : [0026] (i) 提 供 携 带 可 干 扰 基 因 表 达 的 载 体 的 农 杆 菌, 所 述 的 载 体 选 自 下 组 : [0027] (a) 含 有 反 方 向 启 动 的 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 或 基 因 片 段 ( 反 义 分 子 ) 的 载 体 ; [0028] (b) 含 有 可 在 植 物 体 内 形 成 特 异 性 干 扰 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 表 达 ( 或 转 录 ) 的 成 分 的 干 扰 分 子 的 载 体 ; [0029] (ii) 将 植 物 的 细 胞 组 织 或 器 官 与 步 骤 (i) 中 的 农 杆 菌 接 触, 从 而 使 所 述 载 体 转 入 植 物 细 胞 组 织 或 器 官 [0030] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 方 法 还 包 括 : [0031] (iii) 选 择 出 转 入 了 所 述 载 体 的 植 物 细 胞 组 织 或 器 官 ; 和 [0032] (iv) 将 步 骤 (iii) 中 的 植 物 细 胞 组 织 或 器 官 再 生 成 植 物 [0033] 在 本 发 明 的 另 一 方 面, 提 供 一 种 植 物, 由 前 述 任 一 所 述 的 方 法 制 备 获 得 [0034] 在 本 发 明 的 另 一 方 面, 提 供 一 种 LC1 蛋 白 或 其 编 码 基 因 的 用 途, 用 于 调 节 植 物 的 叶 倾 角 ; 或 用 于 制 备 调 节 植 物 的 叶 倾 角 的 材 料 [0035] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 LC1 蛋 白 或 其 编 码 基 因 用 于 调 节 植 物 的 叶 倾 角 增 大 ; 或 所 述 的 LC1 蛋 白 或 其 编 码 基 因 用 于 制 备 调 节 植 物 叶 倾 角 减 小 的 材 料 [0036] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 调 节 植 物 叶 倾 角 减 小 的 材 料 [0037] 在 本 发 明 的 另 一 方 面, 提 供 一 种 降 低 LC1 蛋 白 表 达 的 物 质 的 用 途, 用 于 调 节 植 物 的 叶 倾 角 减 小 [0038] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 降 低 LC 1 蛋 白 表 达 的 物 质 是 干 扰 所 述 LC1 蛋 白 的 编 码 序 列 表 达 ( 或 转 录 ) 的 干 扰 分 子 ( 包 括 反 义 分 子 ) ; 或 是 LC1 蛋 白 的 抑 制 剂 拮 抗 剂 下 调 剂 [0039] 在 另 一 优 选 例 中, 所 述 的 降 低 LC1 蛋 白 表 达 的 物 质 是 含 有 反 方 向 启 动 的 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 或 基 因 片 段 ( 反 义 分 子 ) 的 载 体 [0040] 在 本 发 明 的 另 一 方 面, 提 供 一 种 调 节 植 物 的 叶 倾 角 减 小 的 物 质, 其 是 含 有 反 方 向 启 动 的 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 或 基 因 片 段 ( 反 义 分 子 ) 的 载 体 4

说 明 书 3/15 页 [0041] 在 本 发 明 的 另 一 方 面, 提 供 一 种 调 节 植 物 的 叶 倾 角 增 大 的 物 质, 其 是 含 有 编 码 LC1 蛋 白 的 多 核 苷 酸 的 表 达 载 体 [0042] 在 本 发 明 的 另 一 方 面, 提 供 一 种 LC1 蛋 白 或 其 编 码 基 因 用 途, 用 于 作 为 鉴 定 植 物 的 叶 倾 角 大 小 的 分 子 标 记 [0043] 在 另 一 优 选 例 中, 若 经 检 测 植 物 组 织 中 LC1 蛋 白 表 达 高 于 一 个 特 定 值, 则 相 对 而 言, 所 述 植 物 的 叶 倾 角 减 小 ; 若 经 检 测 植 物 组 织 中 LC1 蛋 白 表 达 低 于 该 特 定 值, 则 相 对 而 言, 所 述 植 物 的 叶 倾 角 增 大 其 中, 除 非 另 外 说 明, 所 述 的 特 定 值 是 指 该 植 物 ( 较 佳 地 为 野 生 型 的 该 植 株 ) 中 LC1 蛋 白 表 达 量 的 平 均 值 [0044] 在 另 一 优 选 例 中, 检 测 相 同 物 种 不 同 品 种 的 植 物 组 织 中 LC1 蛋 白 表 达 水 平, 则 相 对 而 言,LC1 蛋 白 表 达 水 平 较 低 的 植 物 品 种 叶 倾 角 较 大,LC1 蛋 白 表 达 水 平 较 高 的 植 物 品 种 叶 倾 角 较 小 此 例 可 作 为 育 种 中 亲 本 筛 选 的 方 法 之 一 来 应 用 [0045] 本 发 明 的 其 它 方 面 由 于 本 文 的 公 开 内 容, 对 本 领 域 的 技 术 人 员 而 言 是 显 而 易 见 的 附 图 说 明 [0046] 图 1 是 水 稻 叶 倾 角 突 变 体 lc1( 右 ) 与 野 生 型 ( 左 ) 材 料 的 表 型 图 2 是 突 变 体 lc1 中 T-DNA 的 插 入 位 置 示 意 图 及 PCR 验 证 [0047] 图 3 是 突 变 体 lc1 中 LC1 基 因 表 达 情 况 的 PCR 鉴 定 [0048] 图 4 是 pcambia2301-a-lc1 载 体 图 谱 [0049] 图 5 是 功 能 互 补 实 验 T 0 转 基 因 水 稻 植 株 的 表 型 [0050] 图 6 是 突 变 体 lc1 与 互 补 转 基 因 水 稻 植 株 的 旗 叶 的 叶 倾 角 的 角 度 统 计 [0051] 图 7 是 pcambia1302-lc1 载 体 图 谱 [0052] 图 8 是 LC1 基 因 过 表 达 转 基 因 水 稻 植 株 的 表 型 [0053] 图 9 是 LC1 基 因 的 DNA 核 苷 酸 序 列 [0054] 图 10 是 LC1 基 因 编 码 的 蛋 白 的 氨 基 酸 序 列 具 体 实 施 方 式 [0055] 本 发 明 人 经 过 深 入 的 研 究, 发 现 LC1 基 因 对 植 物 叶 倾 角 的 大 小 具 有 调 控 作 用 因 此, 可 以 将 LC1 基 因 应 用 于 植 物 的 培 育 中, 选 育 出 具 有 特 定 品 质 性 状 的 品 种, 如 选 育 出 高 产 品 种 株 型 理 想 的 品 种 或 观 赏 性 好 的 品 种 [0056] 如 本 文 所 用, 所 述 的 植 物 ( 或 作 物 农 作 物 ) 包 括 任 何 种 类 的 植 物, 只 要 该 植 物 适 合 进 行 基 因 的 转 化 操 作 ( 转 基 因 操 作 ), 如 各 种 农 作 物 花 卉 植 物 或 林 业 植 物 等 所 述 的 植 物 比 如 可 以 是 : 双 子 叶 植 物 单 子 叶 植 物 或 裸 子 植 物 例 如 但 不 限 于 : 禾 本 科 的 水 稻 小 麦 大 麦 高 粱 玉 米 黑 麦 ; 十 字 花 科 芸 薹 属 的 大 白 菜 小 白 菜 ; 十 字 花 科 鼠 耳 芥 属 植 物, 此 外 还 包 括 烟 草 瓜 果 蔬 菜 油 菜 等 等 更 具 体 地, 所 述 的 植 物 包 括 ( 但 不 限 于 ) : 小 麦 大 麦 黑 麦 水 稻 玉 米 高 梁 甜 菜 苹 果 梨 李 桃 杏 樱 桃 草 莓 木 莓 黑 莓 豆 扁 豆 豌 豆 大 豆 油 菜 芥 罂 粟 齐 墩 果 向 日 葵 椰 子 蓖 麻 油 植 物 可 可 豆 花 生 葫 芦 黄 瓜 西 瓜 棉 花 亚 麻 大 麻 黄 麻 柑 桔 柠 檬 葡 萄 柚 菠 菜 苘 苣 芦 笋 洋 白 菜 大 白 菜 小 白 菜 胡 萝 卜 洋 葱 土 豆 西 红 柿 青 椒 鳄 梨 桂 皮 樟 脑 烟 叶 坚 果 咖 啡 茄 子 甘 蔗 茶 叶 胡 椒 葡 5

说 明 书 4/15 页 萄 树 蚝 麻 草 香 蕉 天 然 橡 胶 树 和 观 赏 植 物 等 作 为 本 发 明 的 优 选 方 式, 所 述 的 植 物 是 禾 本 科 植 物, 包 括 但 不 限 于 水 稻 小 麦 大 麦 高 粱 玉 米 黑 麦 [0057] 如 本 文 所 用, 所 述 的 叶 倾 角 是 指 植 物 完 全 展 开 的 叶 子 主 脉 与 植 株 中 心 轴 之 间 形 成 的 角 度 通 常, 叶 倾 角 以 度 ( ) 为 单 位 [0058] 如 本 文 所 用, 分 离 的 是 指 物 质 从 其 原 始 环 境 中 分 离 出 来 ( 如 果 是 天 然 的 物 质, 原 始 环 境 即 是 天 然 环 境 ) 如 活 体 细 胞 内 的 天 然 状 态 下 的 多 聚 核 苷 酸 和 多 肽 是 没 有 分 离 纯 化 的, 但 同 样 的 多 聚 核 苷 酸 或 多 肽 如 从 天 然 状 态 中 同 存 在 的 其 他 物 质 中 分 开, 则 为 分 离 纯 化 的 [0059] 如 本 文 所 用, 分 离 的 LC1 蛋 白 或 分 离 的 LC1 多 肽 是 指 LC1 蛋 白 基 本 上 不 含 天 然 与 其 相 关 的 其 它 蛋 白 脂 类 糖 类 或 其 它 物 质 本 领 域 的 技 术 人 员 能 用 标 准 的 蛋 白 质 纯 化 技 术 纯 化 LC1 蛋 白 基 本 上 纯 的 多 肽 在 非 还 原 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 上 能 产 生 单 一 的 主 带 [0060] 本 发 明 的 多 肽 可 以 是 重 组 多 肽 天 然 多 肽 合 成 多 肽 本 发 明 的 多 肽 可 以 是 天 然 纯 化 的 产 物, 或 是 化 学 合 成 的 产 物, 或 使 用 重 组 技 术 从 原 核 或 真 核 宿 主 ( 例 如, 细 菌 酵 母 高 等 植 物 昆 虫 和 哺 乳 动 物 细 胞 ) 中 产 生 根 据 重 组 生 产 方 案 所 用 的 宿 主, 本 发 明 的 多 肽 可 以 是 糖 基 化 的, 或 可 以 是 非 糖 基 化 的 本 发 明 的 多 肽 还 可 包 括 或 不 包 括 起 始 的 甲 硫 氨 酸 残 基 [0061] 本 发 明 还 包 括 LC1 蛋 白 的 片 段 衍 生 物 和 类 似 物 如 本 文 所 用, 术 语 片 段 衍 生 物 和 类 似 物 是 指 基 本 上 保 持 本 发 明 的 LC1 蛋 白 相 同 的 生 物 学 功 能 或 活 性 的 多 肽 本 发 明 的 多 肽 片 段 衍 生 物 或 类 似 物 可 以 是 (i) 有 一 个 或 多 个 保 守 或 非 保 守 性 氨 基 酸 残 基 ( 优 选 保 守 性 氨 基 酸 残 基 ) 被 取 代 的 多 肽, 而 这 样 的 取 代 的 氨 基 酸 残 基 可 以 是 也 可 以 不 是 由 遗 传 密 码 编 码 的, 或 (ii) 在 一 个 或 多 个 氨 基 酸 残 基 中 具 有 取 代 基 团 的 多 肽, 或 (iii) 成 熟 多 肽 与 另 一 个 化 合 物 ( 比 如 延 长 多 肽 半 衰 期 的 化 合 物, 例 如 聚 乙 二 醇 ) 融 合 所 形 成 的 多 肽, 或 (iv) 附 加 的 氨 基 酸 序 列 融 合 到 此 多 肽 序 列 而 形 成 的 多 肽 ( 如 前 导 序 列 或 分 泌 序 列 或 用 来 纯 化 此 多 肽 的 序 列 或 蛋 白 原 序 列, 或 融 合 蛋 白 ) 根 据 本 文 的 定 义 这 些 片 段 衍 生 物 和 类 似 物 属 于 本 领 域 熟 练 技 术 人 员 公 知 的 范 围 [0062] 任 何 一 种 LC1 蛋 白 的 生 物 活 性 片 段 都 可 以 应 用 到 本 发 明 中 在 这 里,LC1 蛋 白 的 生 物 活 性 片 段 的 含 义 是 指 作 为 一 种 多 肽, 其 仍 然 能 保 持 全 长 的 LC1 蛋 白 的 全 部 或 部 分 功 能 通 常 情 况 下, 所 述 的 生 物 活 性 片 段 至 少 保 持 50% 的 全 长 LC1 蛋 白 的 活 性 在 更 优 选 的 条 件 下, 所 述 活 性 片 段 能 够 保 持 全 长 LC1 蛋 白 的 60% 70% 80% 90% 95% 99% 或 100% 的 活 性 [0063] 在 本 发 明 中, 术 语 LC1 蛋 白 指 具 有 LC 1 蛋 白 活 性 的 SEQ ID NO :2 序 列 的 多 肽 该 术 语 还 包 括 具 有 与 LC1 蛋 白 相 同 功 能 的 SEQ ID NO :2 序 列 的 变 异 形 式 这 些 变 异 形 式 包 括 ( 但 并 不 限 于 ) : 若 干 个 ( 通 常 为 1-50 个, 较 佳 地 1-30 个, 更 佳 地 1-20 个, 最 佳 地 1-10 个, 还 更 佳 如 1-8 个 1-5 个 ) 氨 基 酸 的 缺 失 插 入 和 / 或 取 代, 以 及 在 C 末 端 和 / 或 N 末 端 添 加 一 个 或 数 个 ( 通 常 为 20 个 以 内, 较 佳 地 为 10 个 以 内, 更 佳 地 为 5 个 以 内 ) 氨 基 酸 例 如, 在 本 领 域 中, 用 性 能 相 近 或 相 似 的 氨 基 酸 进 行 取 代 时, 通 常 不 会 改 变 蛋 白 质 的 功 能 又 比 如, 在 C 末 端 和 / 或 N 末 端 添 加 一 个 或 数 个 氨 基 酸 通 常 也 不 会 改 变 蛋 白 质 的 功 能 该 术 语 还 包 括 LC1 蛋 白 的 活 性 片 段 和 活 性 衍 生 物 [0064] 多 肽 的 变 异 形 式 包 括 : 同 源 序 列 保 守 性 变 异 体 等 位 变 异 体 天 然 突 变 体 诱 导 突 变 体 在 高 或 低 的 严 紧 度 条 件 下 能 与 LC1 蛋 白 DNA 杂 交 的 DNA 所 编 码 的 蛋 白 以 及 利 用 抗 6

说 明 书 5/15 页 LC1 蛋 白 的 抗 血 清 获 得 的 多 肽 或 蛋 白 本 发 明 还 提 供 了 其 他 多 肽, 如 包 含 LC1 蛋 白 或 其 片 段 的 融 合 蛋 白 [0065] 任 何 与 所 述 的 LC1 蛋 白 同 源 性 高 ( 比 如 与 SEQ ID NO :2 所 示 的 序 列 的 同 源 性 为 70% 或 更 高 ; 优 选 的, 同 源 性 为 80% 或 更 高 ; 更 优 选 的, 同 源 性 为 90% 或 更 高, 如 同 源 性 95%,98% 或 99% ) 的 且 具 有 LC1 蛋 白 相 同 功 能 的 蛋 白 也 包 括 在 本 发 明 内 [0066] 发 明 还 提 供 LC1 蛋 白 或 多 肽 的 类 似 物 这 些 类 似 物 与 天 然 LC1 蛋 白 的 差 别 可 以 是 氨 基 酸 序 列 上 的 差 异, 也 可 以 是 不 影 响 序 列 的 修 饰 形 式 上 的 差 异, 或 者 兼 而 有 之 这 些 多 肽 包 括 天 然 或 诱 导 的 遗 传 变 异 体 诱 导 变 异 体 可 以 通 过 各 种 技 术 得 到, 如 通 过 辐 射 或 暴 露 于 诱 变 剂 而 产 生 随 机 诱 变, 还 可 通 过 定 点 诱 变 法 或 其 他 已 知 分 子 生 物 学 的 技 术 类 似 物 还 包 括 具 有 不 同 于 天 然 L- 氨 基 酸 的 残 基 ( 如 D- 氨 基 酸 ) 的 类 似 物, 以 及 具 有 非 天 然 存 在 的 或 合 成 的 氨 基 酸 ( 如 β γ- 氨 基 酸 ) 的 类 似 物 应 理 解, 本 发 明 的 多 肽 并 不 限 于 上 述 例 举 的 代 表 性 的 多 肽 [0067] 修 饰 ( 通 常 不 改 变 一 级 结 构 ) 形 式 包 括 : 体 内 或 体 外 的 多 肽 的 化 学 衍 生 形 式 如 乙 酰 化 或 羧 基 化 修 饰 还 包 括 糖 基 化 修 饰 形 式 还 包 括 具 有 磷 酸 化 氨 基 酸 残 基 ( 如 磷 酸 酪 氨 酸, 磷 酸 丝 氨 酸, 磷 酸 苏 氨 酸 ) 的 序 列 还 包 括 被 修 饰 从 而 提 高 了 其 抗 蛋 白 水 解 性 能 或 优 化 了 溶 解 性 能 的 多 肽 [0068] 在 本 发 明 中, LC1 蛋 白 保 守 性 变 异 多 肽 指 与 SEQ ID NO :2 的 氨 基 酸 序 列 相 比, 有 至 多 20 个, 较 佳 地 至 多 10 个, 更 佳 地 至 多 5 个, 最 佳 地 至 多 3 个 氨 基 酸 被 性 质 相 似 或 相 近 的 氨 基 酸 所 替 换 而 形 成 多 肽 这 些 保 守 性 变 异 多 肽 最 好 根 据 表 1 进 行 氨 基 酸 替 换 而 产 生 [0069] 表 1 [0070] 氨 基 酸 残 基 代 表 性 的 取 代 优 选 的 取 代 Ala(A) Val ;Leu ;Ile Val Arg(R) Lys ;Gln ;Asn Lys Asn(N) Gln ;His ;Lys ;Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro ;Ala Ala His(H) Asn ;Gln ;Lys ;Arg Arg Ile(I) Leu ;Val ;Met ;Ala ;Phe Leu 7

说 明 书 Leu(L) Ile ;Val ;Met ;Ala ;Phe Ile 6/15 页 Lys(K) Arg ;Gln ;Asn Arg Met(M) Leu ;Phe ;Ile Leu Phe(F) Leu ;Val ;Ile ;Ala ;Tyr Leu Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr ;Phe Tyr Tyr(Y) Trp ;Phe ;Thr ;Ser Phe Val(V) Ile ;Leu ;Met ;Phe ;Ala Leu [0071] 本 发 明 还 涉 及 编 码 本 发 明 LC1 蛋 白 或 其 保 守 性 变 异 多 肽 的 多 核 苷 酸 序 列 所 述 的 多 核 苷 酸 可 以 是 DNA 形 式 或 RNA 形 式 DNA 形 式 包 括 cdna 基 因 组 DNA 或 人 工 合 成 的 DNA DNA 可 以 是 单 链 的 或 是 双 链 的 DNA 可 以 是 编 码 链 或 非 编 码 链 编 码 成 熟 多 肽 的 编 码 区 序 列 可 以 与 SEQ ID NO :1 所 示 的 编 码 区 序 列 相 同 或 者 是 简 并 的 变 异 体 如 本 文 所 用, 简 并 的 变 异 体 在 本 发 明 中 是 指 编 码 具 有 SEQ ID NO :2 的 蛋 白 质, 但 与 SEQ ID NO :1 所 示 的 编 码 区 序 列 有 差 别 的 核 酸 序 列 [0072] 编 码 SEQ ID NO :2 的 成 熟 多 肽 的 多 核 苷 酸 包 括 : 只 编 码 成 熟 多 肽 的 编 码 序 列 ; 成 熟 多 肽 的 编 码 序 列 和 各 种 附 加 编 码 序 列 ; 成 熟 多 肽 的 编 码 序 列 ( 和 任 选 的 附 加 编 码 序 列 ) 以 及 非 编 码 序 列 [0073] 术 语 编 码 多 肽 的 多 核 苷 酸 可 以 是 包 括 编 码 所 述 多 肽 的 多 核 苷 酸, 也 可 以 是 还 包 括 附 加 编 码 和 / 或 非 编 码 序 列 的 多 核 苷 酸 [0074] 本 发 明 还 涉 及 上 述 多 核 苷 酸 的 变 异 体, 其 编 码 与 本 发 明 有 相 同 的 氨 基 酸 序 列 的 多 肽 或 多 肽 的 片 段 类 似 物 和 衍 生 物 此 多 核 苷 酸 的 变 异 体 可 以 是 天 然 发 生 的 等 位 变 异 体 或 非 天 然 发 生 的 变 异 体 这 些 核 苷 酸 变 异 体 包 括 取 代 变 异 体 缺 失 变 异 体 和 插 入 变 异 体 如 本 领 域 所 知 的, 等 位 变 异 体 是 一 个 多 核 苷 酸 的 替 换 形 式, 它 可 能 是 一 个 或 多 个 核 苷 酸 的 取 代 缺 失 或 插 入, 但 不 会 从 实 质 上 改 变 其 编 码 的 多 肽 的 功 能 [0075] 本 发 明 还 涉 及 与 上 述 的 序 列 杂 交 且 两 个 序 列 之 间 具 有 至 少 50%, 较 佳 地 至 少 70%, 更 佳 地 至 少 80% 相 同 性 的 多 核 苷 酸 本 发 明 特 别 涉 及 在 严 格 条 件 下 与 本 发 明 所 述 多 核 苷 酸 可 杂 交 的 多 核 苷 酸 在 本 发 明 中, 严 格 条 件 是 指 :(1) 在 较 低 离 子 强 度 和 较 高 温 度 下 的 杂 交 和 洗 脱, 如 0.2 SSC,0.1% SDS,60 ; 或 (2) 杂 交 时 加 有 变 性 剂, 如 50% (v/v) 甲 酰 胺,0.1% 小 牛 血 清 /0.1% Ficoll,42 等 ; 或 (3) 仅 在 两 条 序 列 之 间 的 相 同 性 至 少 在 90% 以 上, 更 好 是 95% 以 上 时 才 发 生 杂 交 并 且, 可 杂 交 的 多 核 苷 酸 编 码 的 多 肽 与 SEQ ID NO :2 所 示 的 成 熟 多 肽 有 相 同 的 生 物 学 功 能 和 活 性 8

说 明 书 7/15 页 [0076] 本 发 明 还 涉 及 与 上 述 的 序 列 杂 交 的 核 酸 片 段 如 本 文 所 用, 核 酸 片 段 的 长 度 至 少 含 15 个 核 苷 酸, 较 好 是 至 少 30 个 核 苷 酸, 更 好 是 至 少 50 个 核 苷 酸, 最 好 是 至 少 100 个 核 苷 酸 以 上 核 酸 片 段 可 用 于 核 酸 的 扩 增 技 术 ( 如 PCR) 以 确 定 和 / 或 分 离 编 码 LC1 蛋 白 的 多 聚 核 苷 酸 [0077] 应 理 解, 虽 然 本 发 明 的 LC1 基 因 优 选 获 自 禾 本 科 植 物, 但 是 获 自 其 它 植 物 的 与 水 稻 LC1 基 因 高 度 同 源 ( 如 具 有 80% 以 上, 如 85% 90% 95% 甚 至 98% 序 列 相 同 性 ) 的 其 它 基 因 也 在 本 发 明 考 虑 的 范 围 之 内 比 对 序 列 相 同 性 的 方 法 和 工 具 也 是 本 领 域 周 知 的, 例 如 BLAST [0078] 本 发 明 的 LC 1 蛋 白 核 苷 酸 全 长 序 列 或 其 片 段 通 常 可 以 用 PCR 扩 增 法 重 组 法 或 人 工 合 成 的 方 法 获 得 对 于 PCR 扩 增 法, 可 根 据 本 发 明 所 公 开 的 有 关 核 苷 酸 序 列, 尤 其 是 开 放 阅 读 框 序 列 来 设 计 引 物, 并 用 市 售 的 cdna 库 或 按 本 领 域 技 术 人 员 已 知 的 常 规 方 法 所 制 备 的 cdna 库 作 为 模 板, 扩 增 而 得 有 关 序 列 当 序 列 较 长 时, 常 常 需 要 进 行 两 次 或 多 次 PCR 扩 增, 然 后 再 将 各 次 扩 增 出 的 片 段 按 正 确 次 序 拼 接 在 一 起 [0079] 本 发 明 也 涉 及 包 含 所 述 的 多 核 苷 酸 的 载 体, 以 及 用 所 述 的 载 体 或 LC1 蛋 白 编 码 序 列 经 基 因 工 程 产 生 的 宿 主 细 胞 [0080] 本 发 明 中,LC1 蛋 白 多 核 苷 酸 序 列 可 插 入 到 重 组 表 达 载 体 中 术 语 重 组 表 达 载 体 指 本 领 域 熟 知 的 细 菌 质 粒 噬 菌 体 酵 母 质 粒 植 物 细 胞 病 毒 哺 乳 动 物 细 胞 病 毒 或 其 他 载 体 总 之, 只 要 能 在 宿 主 体 内 复 制 和 稳 定, 任 何 质 粒 和 载 体 都 可 以 用 表 达 载 体 的 一 个 重 要 特 征 是 通 常 含 有 复 制 起 点 启 动 子 标 记 基 因 和 翻 译 控 制 元 件 [0081] 包 含 上 述 的 适 当 DNA 序 列 以 及 适 当 启 动 子 或 者 控 制 序 列 的 载 体, 可 以 用 于 转 化 适 当 的 宿 主 细 胞, 以 使 其 能 够 表 达 蛋 白 质 宿 主 细 胞 可 以 是 原 核 细 胞, 如 细 菌 细 胞 ; 或 是 低 等 真 核 细 胞, 如 酵 母 细 胞 ; 或 是 高 等 真 核 细 胞, 如 植 物 细 胞 代 表 性 例 子 有 : 大 肠 杆 菌, 链 霉 菌 属 农 杆 菌 ; 真 菌 细 胞 如 酵 母 ; 植 物 细 胞 等 [0082] 所 述 的 多 核 苷 酸 在 高 等 真 核 细 胞 中 表 达 时, 如 果 在 载 体 中 插 入 增 强 子 序 列 时 将 会 使 转 录 得 到 增 强 增 强 子 是 DNA 的 顺 式 作 用 因 子, 通 常 大 约 有 10 到 300 个 碱 基 对, 作 用 于 启 动 子 以 增 强 基 因 的 转 录 [0083] 本 领 域 一 般 技 术 人 员 都 清 楚 如 何 选 择 适 当 的 载 体 启 动 子 增 强 子 和 宿 主 细 胞 [0084] 用 重 组 DNA 转 化 宿 主 细 胞 可 用 本 领 域 技 术 人 员 熟 知 的 常 规 技 术 进 行 转 化 植 物 可 使 用 农 杆 菌 转 化 或 基 因 枪 转 化 等 方 法, 例 如 喷 洒 法 叶 盘 法 水 稻 幼 胚 转 化 法 等 对 于 转 化 的 植 物 细 胞 组 织 或 器 官 可 以 用 常 规 方 法 再 生 成 植 株, 从 而 获 得 叶 倾 角 性 状 发 生 改 变 的 植 物 [0085] 本 发 明 提 供 了 所 述 的 LC1 蛋 白 或 其 编 码 基 因 的 用 途, 用 于 调 节 植 物 的 叶 倾 角 的 大 小 ; 或 用 于 筛 选 对 于 调 节 植 物 叶 倾 角 大 小 有 用 的 物 质 ( 即 : 所 述 物 质 通 过 调 节 LC1 蛋 白 的 表 达 来 调 节 植 物 叶 倾 角 大 小 的 性 状 ) 作 为 一 种 优 选 方 式, 所 述 的 LC1 蛋 白 可 用 于 : 调 节 植 物 的 叶 倾 角 增 大 [0086] 本 发 明 还 涉 及 LC1 的 激 动 剂 或 拮 抗 剂 及 其 用 途 由 于 LC1 的 激 动 剂 或 拮 抗 剂 可 调 节 LC1 的 表 达 和 / 或 调 节 LC1 的 活 性 等, 因 此, 所 述 的 LC1 的 激 动 剂 或 拮 抗 剂 也 可 通 过 对 LC1 的 影 响 来 调 节 植 物 叶 倾 角 的 性 状, 从 而 达 到 改 良 植 物 ( 如 提 高 植 物 产 量, 改 变 植 物 的 株 型 或 增 加 植 物 的 观 赏 性 ) 的 目 的 9

说 明 书 8/15 页 [0087] 任 何 可 提 高 LC1 蛋 白 的 活 性 提 高 LC1 蛋 白 的 稳 定 性 促 进 LC1 蛋 白 的 表 达 延 长 LC1 蛋 白 有 效 作 用 时 间 或 促 进 LC1 的 转 录 和 翻 译 的 物 质 均 可 用 于 本 发 明, 作 为 可 用 于 调 节 植 物 叶 倾 角 大 小, 特 别 是 增 大 植 物 叶 倾 角 的 物 质 任 何 可 降 低 LC1 蛋 白 的 活 性 降 低 LC1 蛋 白 的 稳 定 性 抑 制 LC1 蛋 白 的 表 达 减 少 LC1 蛋 白 有 效 作 用 时 间 或 降 低 LC1 的 转 录 和 翻 译 的 物 质 均 可 用 于 本 发 明, 作 为 LC1 的 下 调 剂 拮 抗 剂 或 抑 制 剂 ( 即 : 下 调 LC1 蛋 白 表 达 的 物 质 ), 如 抗 所 述 LC1 蛋 白 的 抗 体, 干 扰 所 述 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 表 达 的 干 扰 分 子 ( 如 可 形 成 microrna 的 干 扰 分 子, 反 义 分 子 ) 所 述 的 下 调 剂 拮 抗 剂 或 抑 制 剂 可 用 于 调 节 植 物 叶 倾 角 大 小, 特 别 是 减 小 植 物 的 叶 倾 角 在 得 知 了 靶 序 列 后, 制 备 干 扰 特 定 基 因 表 达 的 干 扰 分 子 的 方 法 是 本 领 域 人 员 熟 知 的 [0088] 本 发 明 还 涉 及 一 种 改 良 植 物 的 方 法, 该 方 法 包 括 调 节 所 述 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达 [0089] 一 方 面, 本 发 明 提 供 了 一 种 增 大 植 物 的 叶 倾 角 的 方 法, 所 述 的 方 法 包 括 : 使 所 述 植 物 过 量 表 达 LC1 蛋 白 [0090] 另 一 方 面, 本 发 明 还 提 供 了 一 种 减 小 植 物 叶 倾 角 的 方 法, 所 述 的 方 法 包 括 : 降 低 所 述 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达 ( 包 括 使 LC1 蛋 白 不 表 达 或 低 表 达 ) [0091] 在 得 知 了 所 述 的 LC1 蛋 白 的 用 途 后, 可 以 采 用 本 领 域 人 员 熟 知 的 多 种 方 法 来 调 节 所 述 的 LC1 蛋 白 的 表 达 比 如 可 通 过 本 领 域 人 员 已 知 的 途 径 将 携 带 LC1 基 因 的 表 达 单 位 ( 比 如 表 达 载 体 或 病 毒 等 ) 递 送 到 靶 点 上, 并 使 之 表 达 活 性 的 LC1 蛋 白 [0092] 此 外, 也 可 以 采 用 本 领 域 人 员 熟 知 的 多 种 方 法 来 降 低 LC1 蛋 白 的 表 达 或 使 之 缺 失 表 达, 比 如 将 携 带 反 义 LC1 基 因 的 表 达 单 位 ( 比 如 表 达 载 体 或 病 毒 等 ) 递 送 到 靶 点 上, 使 得 细 胞 或 植 物 组 织 不 表 达 或 降 低 表 达 LC1 蛋 白 [0093] 作 为 本 发 明 的 一 种 实 施 方 式, 将 编 码 LC1 蛋 白 的 基 因 通 过 常 规 的 方 法 克 隆 到 适 当 的 载 体 中, 将 所 述 的 带 有 外 源 基 因 的 重 组 载 体 导 入 到 可 表 达 所 述 LC1 蛋 白 的 植 物 细 胞 中, 使 所 述 的 植 物 细 胞 表 达 LC1 蛋 白 可 通 过 将 所 述 植 物 细 胞 再 生 成 植 物, 获 得 过 量 表 达 LC1 蛋 白 的 植 物 [0094] 优 选 的, 提 供 了 一 种 制 备 转 基 因 植 物 的 方 法, 包 括 : [0095] (1) 将 外 源 的 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 转 入 植 物 细 胞 组 织 器 官 或 组 织, 获 得 转 化 入 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 的 植 物 细 胞 组 织 器 官 ; 和 [0096] (2) 将 步 骤 (1) 获 得 的 转 入 了 外 源 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 的 植 物 细 胞 组 织 器 官 再 生 成 植 物 植 株 [0097] 作 为 一 种 优 选 的 实 例, 所 述 的 方 法 包 括 步 骤 : [0098] (s1) 提 供 携 带 表 达 载 体 的 农 杆 菌, 所 述 的 表 达 载 体 含 有 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 ; [0099] (s2) 将 植 物 细 胞 组 织 器 官 与 步 骤 (s1) 中 的 农 杆 菌 接 触, 从 而 使 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 转 入 植 物 细 胞, 并 且 整 合 到 植 物 细 胞 的 染 色 体 上 ; [0100] (s3) 选 择 出 转 入 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 的 植 物 细 胞 组 织 器 官 ; 以 及 [0101] (s4) 将 步 骤 (s3) 中 的 植 物 细 胞 组 织 器 官 再 生 成 植 物 [0102] 其 它 增 加 LC1 基 因 或 其 同 源 基 因 表 达 的 方 法 是 本 领 域 周 知 的 例 如, 可 通 过 用 强 启 动 子 驱 动 从 而 增 强 LC1 基 因 或 其 同 源 基 因 的 表 达 或 者 通 过 增 强 子 ( 如 水 稻 waxy 基 因 第 一 内 含 子 Actin 基 因 第 一 内 含 子 等 ) 来 增 强 该 LC1 基 因 的 表 达 适 用 于 本 发 明 方 法 的 10

说 明 书 9/15 页 强 启 动 子 包 括 但 不 限 于 :35s 启 动 子, 水 稻 玉 米 的 Ubi 启 动 子 等 [0103] 优 选 的, 还 提 供 了 一 种 降 低 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达 的 方 法, 所 述 的 方 法 包 括 : [0104] (1) 将 干 扰 LC1 基 因 表 达 的 干 扰 分 子 转 入 植 物 细 胞 组 织 器 官 或 种 子, 获 得 转 化 入 所 述 干 扰 分 子 的 植 物 细 胞 组 织 器 官 或 种 子 ; 和 [0105] (2) 将 步 骤 (1) 获 得 的 转 入 了 所 述 干 扰 分 子 的 植 物 细 胞 组 织 器 官 或 种 子 再 生 成 植 物 [0106] 作 为 一 种 优 选 的 实 例, 所 述 的 方 法 包 括 步 骤 : [0107] (i) 提 供 携 带 可 干 扰 基 因 表 达 的 载 体 的 农 杆 菌, 所 述 的 载 体 选 自 下 组 : [0108] (a) 含 有 反 方 向 启 动 的 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 或 基 因 片 段 ( 反 义 分 子 ) 的 载 体 ; [0109] (b) 含 有 可 在 植 物 体 内 形 成 特 异 性 干 扰 LC1 蛋 白 的 编 码 基 因 表 达 ( 或 转 录 ) 的 成 分 的 干 扰 分 子 的 载 体 ; [0110] (ii) 将 植 物 的 细 胞 组 织 或 器 官 与 步 骤 (i) 中 的 农 杆 菌 接 触, 从 而 使 所 述 载 体 转 入 植 物 细 胞 组 织 或 器 官 [0111] 较 佳 地, 所 述 方 法 还 包 括 : [0112] (iii) 选 择 出 转 入 了 所 述 载 体 的 植 物 细 胞 组 织 或 器 官 ; 和 [0113] (iv) 将 步 骤 (iii) 中 的 植 物 细 胞 组 织 或 器 官 再 生 成 植 物 [0114] 其 它 抑 制 LC1 基 因 或 其 同 源 基 因 表 达 的 方 法 是 本 领 域 周 知 的 [0115] 本 发 明 还 包 括 利 用 前 述 任 一 种 方 法 获 得 的 植 物, 所 述 的 植 物 包 括 : 转 入 了 LC1 基 因 或 其 同 源 基 因 的 转 基 因 植 物 ; 或 者 LC1 蛋 白 表 达 量 ( 包 括 低 表 达 或 不 表 达 ) 降 低 的 植 物 等 [0116] 可 采 用 任 何 适 当 的 常 规 手 段, 包 括 试 剂 温 度 压 力 条 件 等 来 实 施 所 述 的 方 法 [0117] 此 外, 本 发 明 还 涉 及 利 用 LC1 蛋 白 或 其 编 码 基 因 作 为 一 种 基 因 转 化 植 株 后 代 的 追 踪 标 记 本 发 明 还 涉 及 利 用 LC1 蛋 白 或 其 编 码 基 因 作 为 一 种 分 子 标 记, 通 过 检 测 植 物 中 LC1 蛋 白 的 表 达 情 况, 鉴 定 植 物 的 株 型 情 况 叶 倾 角 大 小 产 量 高 低 等 [0118] 此 外, 本 发 明 还 提 供 筛 选 可 调 节 植 物 叶 倾 角 大 小 的 潜 在 物 质 的 方 法 在 得 知 了 所 述 的 LC1 蛋 白 的 用 途 后, 可 以 采 用 本 领 域 熟 知 的 多 种 方 法 来 筛 选 调 节 植 物 叶 倾 角 大 小 的 潜 在 物 质 [0119] 在 本 发 明 的 一 种 优 选 方 式 中, 提 供 一 种 筛 选 调 节 植 物 叶 倾 角 大 小 的 潜 在 物 质 的 方 法, 所 述 的 方 法 包 括 : 将 候 选 物 质 与 表 达 LC1 蛋 白 的 体 系 接 触, 检 测 候 选 物 质 对 LC1 蛋 白 的 影 响 ; 若 所 述 候 选 物 质 可 提 高 或 降 低 LC1 蛋 白 的 表 达, 或 促 进 或 抑 制 LC1 蛋 白 的 活 性, 则 表 明 其 是 可 用 于 调 节 植 物 叶 倾 角 大 小 这 些 初 步 筛 选 出 的 物 质 可 构 成 一 个 筛 选 库, 以 便 于 人 们 最 终 可 以 从 中 筛 选 出 能 够 对 于 调 节 植 物 叶 倾 角 有 用 的 物 质 [0120] 因 此, 本 发 明 还 包 括 通 过 所 述 的 筛 选 方 法 获 得 的 物 质, 所 述 的 物 质 可 用 于 调 节 植 物 叶 倾 角 大 小 [0121] 本 发 明 利 用 叶 倾 角 发 生 改 变 的 水 稻 突 变 体 lc1, 通 过 Tail-PCR 的 技 术 首 次 在 水 稻 中 克 隆 到 了 LC1 基 因, 在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 网 站 做 BLAST 分 析, 找 到 了 该 基 因 在 水 稻 染 色 体 上 的 位 置 和 序 列 该 基 因 编 码 IAA-amino 合 成 酶, 在 水 稻 中 控 制 了 叶 倾 角 的 大 小 通 过 对 LC1 基 因 的 功 能 解 读, 进 一 步 阐 明 了 植 物 特 别 是 禾 本 科 植 物 叶 倾 角 发 育 的 遗 传 机 制 及 其 作 用 机 理, 为 理 想 株 型 育 种, 创 建 水 稻 新 种 质 打 下 基 础 11

说 明 书 10/15 页 [0122] 当 所 述 的 植 物 是 禾 本 科 植 物 时, 叶 片 倾 角 是 禾 本 科 植 物 理 想 株 型 的 重 要 组 成 部 分, 也 是 当 前 超 高 产 育 种 关 注 的 重 点 LC1 基 因 的 克 隆 和 应 用, 使 植 物 株 型 能 够 保 持 叶 片 挺 直, 减 小 叶 倾 角, 改 善 植 株 的 受 光 姿 态, 提 高 光 能 利 用 效 率 因 而, 本 发 明 能 对 叶 倾 角 进 行 改 良, 最 终 能 提 高 水 稻 产 量 [0123] 下 面 结 合 具 体 实 施 例, 进 一 步 阐 述 本 发 明 应 理 解, 这 些 实 施 例 仅 用 于 说 明 本 发 明 而 不 用 于 限 制 本 发 明 的 范 围 下 列 实 施 例 中 未 注 明 具 体 条 件 的 实 验 方 法, 通 常 按 照 常 规 条 件 如 J. 萨 姆 布 鲁 克 等 编 著, 分 子 克 隆 实 验 指 南, 科 学 出 版 社,2002 中 所 述 的 条 件, 或 按 照 制 造 厂 商 所 建 议 的 条 件 除 非 另 外 说 明, 否 则 百 分 比 和 份 数 按 重 量 计 算 [0124] 除 非 另 行 定 义, 文 中 所 使 用 的 所 有 专 业 与 科 学 用 语 与 本 领 域 熟 练 人 员 所 熟 悉 的 意 义 相 同 此 外, 任 何 与 所 记 载 内 容 相 似 或 均 等 的 方 法 及 材 料 皆 可 应 用 于 本 发 明 中 文 中 所 述 的 较 佳 实 施 方 法 与 材 料 仅 作 示 范 之 用 [0125] 实 施 例 1 基 因 的 分 离 [0126] 1 水 稻 材 料 [0127] 以 野 生 材 料 粳 稻 品 种 中 花 11 为 筛 选 对 象, 本 发 明 人 选 择 到 一 株 水 稻 (Oryza sativa L.) 突 变 体 lc1(leaf inclination 1), 该 突 变 体 的 叶 倾 角 比 野 生 型 大, 其 表 型 见 图 1 [0128] 2 TAIL-PCR 确 定 LC1 基 因 : [0129] 2.1 使 用 简 易 法 (TPS 法 ) 提 取 水 稻 基 因 组 DNA [0130] (1) 取 2cm 的 水 稻 叶 片 放 入 1.5ml 的 离 心 管 中, 加 入 200μl 的 TPS 抽 提 液, 用 1ml 的 枪 头 捣 碎 TPS 抽 提 液 的 配 制 :100mM Tris-Cl(pH 8.0),10mMEDTA(pH 8.0),1M KCl [0131] (2) 将 捣 碎 的 叶 片 放 入 75 水 浴 20 分 钟 [0132] (3)15000rpm 离 心 5 分 钟 [0133] (4) 取 120μl 上 清 液 于 96 孔 板 中, 加 入 等 体 积 的 异 丙 醇,3500rpm 离 心 10 分 钟 [0134] (5) 弃 上 清 保 留 沉 淀, 加 入 120μl 70% 的 乙 醇,3500rpm 离 心 [0135] (6) 弃 上 清, 将 沉 淀 干 燥, 加 入 30μl ddh 2 O [0136] 2.2 旁 邻 序 列 的 确 定 (TAIL-PCR) [0137] 1) 用 TPS 法 抽 提 得 到 的 水 稻 叶 片 基 因 组 DNA 作 为 PCR 模 板, 进 行 三 轮 PCR 反 应 引 物 序 列 : [0138] TDNA15 -TGCTTGATTTGAAGACATAGGG-3 (SEQ ID NO :3) ; [0139] TDNA25 -CGCCTATAAATACGACGGATCGTAA-3 (SEQ ID NO :4) ; [0140] TDNA35 -TAATAACGCTGCGGACATCTA-3 (SEQ ID NO :5) [0141] 随 机 引 物 (Arbitrary primer) : [0142] 5 -TGWGNAGSANCASAGA-3 (SEQ ID NO :6) ; [0143] 5 -AGWGNAGWANCAWAGG-3 (SEQ ID NO :7) ; [0144] 5 -NTCGASTWTSGWGTT-3 (SEQ ID NO :8) ; [0145] 5 -NGACGASWGANAWGAA-3 (SEQ ID NO :9) ; [0146] 其 中,W 表 示 A/T N 表 示 A/T/G/C S 表 示 G/C [0147] 第 一 轮 PCR : 以 提 取 的 基 因 组 DNA 为 模 板, 使 用 T-DNA1 引 物 和 随 机 引 物 PCR 反 应 体 系 : 总 体 积 20μl(PCR 缓 冲 液 :2μl,Mg 2+ :2μl,dNTP :0.2mM, 随 机 引 物 :2uM,TDNA1 引 物 : 12

说 明 书 11/15 页 0.2uM,Taq :0.08U, 基 因 组 DNA :1μl, 用 ddh 2 O 补 齐 至 20μl) [0148] 实 验 步 骤 : [0149] 步 骤 1 :4.0 2 分 钟 ; [0150] 步 骤 2 :93.0 1 分 钟 ; [0151] 步 骤 3 :95.0 1 分 钟 ; [0152] 步 骤 4 :94.0 30 秒 ; [0153] 步 骤 5 :62.0 1 分 钟 ; [0154] 步 骤 6 :72.0 2 分 钟 30 秒 ; [0155] 步 骤 7 : 从 步 骤 4 到 步 骤 6 重 复 4 次 循 环 ; [0156] 步 骤 8 :94.0 30 秒 ; [0157] 步 骤 9 :25.0 3 分 钟 ; [0158] 步 骤 10 :Ramp at 0.2 / 秒 升 至 72.0 ; [0159] 步 骤 11 :72.0 2 分 钟 30 秒 ; [0160] 步 骤 12 :94.0 10 秒 ; [0161] 步 骤 13 :68.0 1 分 钟 ; [0162] 步 骤 14 :72.0 2 分 钟 30 秒 ; [0163] 步 骤 15 :94.0 10 秒 ; [0164] 步 骤 16 :68.0 1 分 钟 ; [0165] 步 骤 17 :72.0 2 分 钟 30 秒 ; [0166] 步 骤 18 :94.0 10 秒 ; [0167] 步 骤 19 :44.0 1 分 钟 ; [0168] 步 骤 20 :72.0 2 分 钟 30 秒 ; [0169] 步 骤 21 : 从 步 骤 12 到 步 骤 20 重 复 14 次 循 环 ; [0170] 步 骤 22 :72.0 5 分 钟 ; [0171] 步 骤 23 :4.0 保 温 结 束 [0172] 第 二 轮 PCR : 以 第 一 轮 PCR 产 物 为 模 板, 使 用 T-DNA 2 引 物 和 随 机 引 物 [0173] PCR 反 应 体 系 : 总 体 积 20μl(PCR 缓 冲 液 :2μl,Mg 2+ :2μl,dNTP :0.2mM, 随 机 引 物 :2uM,TDNA1 引 物 :0.2uM,Taq :0.06U, 用 第 一 轮 的 PCR 产 物,DNA :1μl, 用 ddh 2 O 补 齐 至 20μl) [0174] 实 验 步 骤 : [0175] 步 骤 1 :4.0 2 分 钟 ; [0176] 步 骤 2 :94.0 10 秒 ; [0177] 步 骤 3 :64.0 1 分 钟 ; [0178] 步 骤 4 :72.0 2 分 钟 30 秒 ; [0179] 步 骤 5 :94.0 10 秒 ; [0180] 步 骤 6 :64.0 1 分 钟 ; [0181] 步 骤 7 :72.0 2 分 钟 30 秒 ; [0182] 步 骤 8 :94.0 10 秒 ; [0183] 步 骤 9 :44.0 1 分 钟 ; 13

说 明 书 12/15 页 [0184] 步 骤 10 :72.0 2 分 钟 30 秒 ; [0185] 步 骤 11 : 从 步 骤 2 到 步 骤 10 重 复 11 次 循 环 ; [0186] 步 骤 12 :72.0 5 分 钟 ; [0187] 步 骤 13 :4.0 保 温 结 束 [0188] 第 二 轮 PCR 产 物 需 要 用 1% 琼 脂 糖 电 泳 检 验, 有 条 带 的 样 品 才 进 行 第 三 轮 PCR [0189] 第 三 轮 PCR : 以 第 二 轮 PCR 产 物 为 模 板, 使 用 T-DNA 3 引 物 和 随 机 引 物 [0190] PCR 反 应 体 系 : 总 体 积 30μl(PCR 缓 冲 液 :3μl,Mg 2+ :1.5μl,dNTP :0.2mM, 随 机 引 物 :2uM,TDNA1 引 物 0.2uM,Taq :0.06U, 用 第 二 轮 的 PCR 产 物,DNA :1μl, 用 ddh 2 O 补 齐 至 30μl) [0191] 实 验 步 骤 : [0192] 步 骤 1 :4.0 2 分 钟 ; [0193] 步 骤 2 :94.0 10 秒 ; [0194] 步 骤 3 :44.0 1 分 钟 ; [0195] 步 骤 4 :72.0 2 分 钟 30 秒 ; [0196] 步 骤 5 : 从 步 骤 2 到 步 骤 4 重 复 19 次 循 环 ; [0197] 步 骤 6 :72.0 5 分 钟 ; [0198] 步 骤 7 :4.0 保 温 结 束 [0199] 2.3 基 因 预 测 和 比 较 分 析 [0200] 在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 网 站 做 Blastn 分 析, 将 获 得 的 旁 邻 序 列 与 已 知 的 水 稻 基 因 组 序 列 进 行 比 对 发 现,T-DNA 插 入 在 水 稻 第 一 染 色 体 的 33.3Mb 处 对 插 入 位 点 附 近 的 序 列 进 行 基 因 预 测, 结 果 显 示,T-DNA 插 入 了 一 个 预 测 基 因 的 上 游 启 动 子 内, 距 转 录 起 始 位 点 上 游 136bp 该 基 因 启 动 子 区 域 内 的 T-DNA 插 入 导 致 了 基 因 的 高 表 达 该 功 能 基 因 具 有 SEQ ID NO :1 所 示 的 DNA 序 列 ( 图 9), 预 测 功 能 蛋 白 具 有 SEQ ID NO :2 所 示 的 氨 基 酸 序 列 ( 图 10) [0201] 实 施 例 2 变 体 水 稻 的 PCR 鉴 定 [0202] 用 突 变 体 水 稻 DNA 作 为 模 板, 进 行 PCR 来 确 定 突 变 体 是 否 有 T-DNA 插 入 Hygromycin 抗 性 引 物 检 测 突 变 体 中 是 否 存 在 T-DNA 插 入 ; 根 据 Tail-PCR 推 测 T-DNA 插 入 位 点, 在 插 入 位 点 的 两 侧 设 计 引 物 : [0203] P1 :5 -TGCTTGATTTGAAGACATAGGG-3 (SEQ ID NO :10) ; [0204] P2 :5 -GATGTAGGCAGCGGTATGG-3 (SEQ ID NO :11) ; [0205] 在 T-DNA 左 边 界 区 段 设 计 引 物 : [0206] LB3 :5 -CCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGAAT-3 (SEQ ID NO :12) ; [0207] 用 P1 和 P2,P1 和 LB3 两 对 引 物 分 别 PCR 扩 增, 进 一 步 确 认 插 入 位 点 和 鉴 定 纯 系 以 野 生 型 植 株 的 DNA 为 模 板 时, 基 因 组 的 一 对 引 物 P1/P2 可 以 扩 增 出 预 期 的 597bp 的 条 带, 而 T-DNA 引 物 LB3 和 P2 组 合 则 不 能 扩 增 出 条 带 ; 以 突 变 体 植 株 的 DNA 为 模 板 时,T-DNA 引 物 LB3 和 P2 组 合 能 扩 增 出 482bp 的 条 带, 纯 合 的 突 变 体 中, 由 于 插 入 的 T-DNA 片 段 太 大, P1/P2 不 能 扩 增 出 条 带, 如 第 2 3 5-9 单 株 ; 而 T-DNA 杂 合 体 则 2 对 引 物 均 能 扩 增 出 对 应 大 小 的 条 带, 如 第 4 11 单 株 ( 图 2) [0208] 实 施 例 2 基 因 表 达 的 分 析 14

说 明 书 13/15 页 [0209] 1 水 稻 RNA 提 取 [0210] 取 水 稻 组 织 材 料 ( 约 100mg) 于 液 氮 中 充 分 研 磨 转 移 至 1.5ml 离 心 管 中, 加 入 1mL Trizol(Invitrogen,Cat.15596-018), 混 匀, 室 温 放 置 5min 12,000rpm 离 心 10min, 弃 沉 淀 上 清 中 加 入 600μL 三 氯 甲 烷, 混 匀,12,000rpm 离 心 10min 取 上 清, 加 入 等 体 积 异 丙 醇 -20 半 小 时 沉 淀 RNA 12,000rpm 离 心 10min, 用 70% 乙 醇 洗 涤 沉 淀 两 次, 真 空 干 燥, 溶 于 20-50μL H 2 O(RNase free) 将 RNA 用 Rnase free H 2 O 做 适 当 稀 释, 测 定 波 长 在 200nm-300nm 之 间 的 UV 吸 收 值 RNA 浓 度 = 40μg/mL A 260 稀 释 倍 数 A 260 /A 280 应 当 在 1.8 至 2.0 之 间 [0211] 2 RT-PCR 分 析 [0212] 水 稻 的 花 和 叶 的 总 RNA, 各 取 1μg 进 行 反 转 录, 稀 释 后 分 装,-70 保 存 反 转 录 按 照 大 连 宝 生 物 工 程 公 司 提 供 的 方 法 进 行 (RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1) 反 转 录 反 应 条 件 为 :30,10min ;42,30min ;99,5min ;4,5min 用 水 稻 ACTIN 基 因 引 物 : [0213] Actin-3 :5 -GAACTGGTATGGTCAAGGCTG-3 (SEQ ID NO :13) ; [0214] Actin-4 :5 -ACACGGAGCTCGTTGTAGAAG-3 (SEQ ID NO :14) ; [0215] 进 行 PCR 反 应 定 量 分 析 反 转 录 模 板 的 结 果, 确 定 不 同 的 edna 模 板 的 用 量, 以 基 因 特 异 引 物 : [0216] LC1-1 :5 -CACGTATTCCGGGTTGTATC-3 (SEQ ID NO :15) ; [0217] LC1-2 :5 -GGCTAAGTCGTCATCTCATAAC-3 (SEQ ID NO :16) ; [0218] 以 花 和 叶 组 织 总 RNA 反 转 录 的 edna 为 模 板, 用 RT-PCR 的 方 法 分 别 检 测 了 叶 和 花 中 LC1 基 因 的 表 达 情 况 相 对 于 野 生 型 植 株,lc1 突 变 体 的 叶 和 花 中 LC1 的 转 录 水 平 都 有 明 显 的 升 高 ( 图 3) [0219] 实 施 例 3 : 转 基 因 植 物 及 功 能 验 证 [0220] 1.LC1 基 因 的 正 义 载 体 和 反 义 载 体 的 构 建 [0221] (1) 正 义 双 元 载 体 [0222] 以 实 施 例 2 中 水 稻 花 的 edna 为 模 板, 采 用 以 下 引 物 对 进 行 PCR 扩 增 : [0223] LC1-55 CATGCCATGGATATGCCGGAAGCACCGACCG-3 (SEQ ID NO :17) ; [0224] LC1-65 CGGGATCCGAGGCGTCTCCCTTGCCGACCA-3 (SEQ ID NO :18) ; [0225] 以 pfu 聚 合 酶 扩 增 所 述 的 cdna,pcr 反 应 条 件 为 :94,3min,1 次 循 环 ;94, 30sec,58,40sec,72,150sec,28 次 循 环 ;72,10min,1 次 循 环 扩 增 产 物 经 测 序 验 证, 其 序 列 如 SEQ ID NO :1 所 示, 与 Genbank 基 因 库 登 录 号 为 AK063368 中 的 编 码 基 因 序 列 相 同, 表 明 克 隆 产 物 为 LC1 基 因 NcoI 和 SpeI 酶 切 后 连 入 到 经 过 同 样 酶 切 处 理 后 的 p35s-1302 双 元 载 体 ( 购 自 CAMBIA) 中, 构 建 成 为 CaMV35S 启 动 子 驱 动 的 LC1 正 义 双 元 载 体 (p35s-1302/ LC(pCAMBIA1302-LC1), 图 7) [0226] (2) 反 义 双 元 载 体 [0227] 采 用 以 下 引 物 : [0228] LC1-3 :5 GGACTAGTGCCTCAACCTGAATCCCATG-3 (SEQ ID NO :19) ; [0229] LC1-4 :5 AACTGCAGGGTAGACGCTGTTCAGTGCCT-3 (SEQ ID NO :20) ; [0230] PCR 扩 增 LC1 基 因 3 端 非 保 守 的 0.7kb 的 片 段 : [0231] BamHI 和 PstI 酶 切 后 连 入 同 样 酶 切 处 理 的 p35s-2301 双 元 载 体 中, 构 建 成 为 含 15

说 明 书 14/15 页 有 35S 启 动 子 驱 动 的 LC1 反 向 序 列 的 的 反 义 双 元 载 体 (p35s-2301/ 反 义 LC1( 又 称 为 : pcambia2301-a-lc1 或 p35s-2301-a-lc1), 图 4), 即 LC1 基 因 5 端 的 位 置 与 载 体 的 启 动 子 位 置 相 远 离, 而 3 端 终 止 密 码 子 的 位 置 与 载 体 的 启 动 子 位 置 相 靠 近 [0232] 2 菌 种 构 建 [0233] 以 常 规 的 CaCl 2 处 理 法 ( 参 见 分 子 生 物 学 实 验 技 术 ; 郝 福 英 等 编 著, 北 京 大 学 出 版 社, 北 京,1998) 制 备 根 癌 农 杆 菌 EHA105(CAMBIA 公 司 ) 感 受 态, 通 过 电 击 转 化 法 将 LC1 基 因 的 正 义 载 体 和 反 义 载 体 分 别 转 入 农 杆 菌 中, 在 含 抗 生 素 如 卡 那 霉 素 (Km) 的 LB 培 养 基 ( 胰 蛋 白 胨 10g/L, 酵 母 提 取 物 5g/L,NaCl10g/L, 琼 脂 15g/L, 卡 那 霉 素 50mg/L, 用 NaOH 调 ph 至 7.5) 上, 于 28 下 培 养 2 大 [0234] 挑 取 单 菌 落, 在 含 抗 生 素 的 YEP 酵 母 培 养 基 ( 蛋 白 胨 10g/L, 酵 母 浸 膏 10g/L,NaCl 5g/L, 卡 那 霉 素 50mg/L,pH 7.0) 中 28 培 养 约 24 小 时 至 对 数 期 按 1% 的 量 接 种 到 相 同 的 培 养 基 中,28 下 培 养 24 小 时 将 培 养 液 于 4 3000rpm 下 离 心 10min, 取 沉 淀 ( 菌 体 ), 用 等 体 积 AAM-As 培 养 基 (AA 培 养 基 无 机 盐 和 氨 基 酸 MS 维 他 命, 干 酪 素 500mg/L, 蔗 糖 68.5g/ L, 葡 萄 糖 36g/L, 乙 酰 丁 香 酮,pH 5.2) 悬 浮, 静 置 2 小 时 [0235] 3 共 培 养 外 植 体 ( 幼 胚 ) 的 准 备 [0236] 取 粳 稻 ( 中 花 11 或 lc1 突 变 体 ) 未 成 熟 种 子, 经 75% 的 乙 醇 漂 洗 1min 后 用 无 菌 水 漂 洗 3 遍, 之 后 用 0.1% 升 汞 浸 泡 15min, 再 用 无 菌 水 漂 洗 3 遍 ; 然 后 取 幼 胚 接 种 于 ND2 培 养 基 (N6 大 量 元 素,N6 微 量 元 素 和 N6 维 他 命, 脯 氨 酸 500mg/L, 干 酪 素 300mg/L, 蔗 糖 30g/ L,2,4-D 2mg/L, 琼 脂 8g/L,pH 5.8) 上, 在 25 黑 暗 条 件 下 培 养 三 天 [0237] 4 转 化 外 植 体 [0238] 将 经 培 养 后 的 外 植 体 浸 入 上 述 2 所 得 菌 体 悬 液, 静 置 20min, 用 无 菌 滤 纸 吸 干 后 转 移 到 ND2-As 培 养 基 (ND2 培 养 基 加 入 乙 酰 丁 香 酮 (30μmol/L)) 上,25 黑 暗 条 件 下 共 培 养 3 天 [0239] 用 无 菌 水 将 培 养 后 的 外 植 体 洗 涤 5 次 以 除 去 表 面 吸 附 的 农 杆 菌, 然 后 用 含 羧 苄 青 霉 素 250mg/L 和 头 孢 霉 素 100mg/L 的 无 菌 水 浸 泡 2 小 时 用 无 菌 滤 纸 吸 干 后 转 移 至 ND2CH(ND2 培 养 基 加 入 水 解 酪 蛋 白 500mg/L,2,4- 二 氯 苯 氧 乙 酸 2mg/L) 培 养 基,25 下 培 养, 筛 选 抗 性 愈 伤, 每 两 周 继 代 一 次 [0240] 5 再 生 [0241] 筛 选 得 到 的 抗 性 愈 伤 转 移 到 NN1B2H 分 化 培 养 基 (N6 大 量 元 素 N6 微 量 元 素 N6 维 他 命, 干 酪 素 300mg/L, 蔗 糖 30g/L 6- 苄 基 腺 嘌 呤 2mg/L, 潮 霉 素 50mg/L, 琼 脂 10g/L, ph 5.8) 上,25 下 培 养 分 化 分 化 出 来 的 小 苗 转 移 到 含 抗 性 如 潮 霉 素 的 MS 分 化 培 养 基 (DUCHEFA BIOCHEMIE 公 司 ) 上,25 下 培 养 至 约 10cm 高, 移 至 人 工 气 候 室 培 养 至 成 熟 [0242] 水 稻 在 人 工 气 候 室, 每 天 于 26 下 培 养 12 小 时 ; 再 于 18 下 培 养 12 小 时 [0243] 对 植 株 进 行 鉴 定 和 连 续 的 观 察, 发 现 转 入 反 义 载 体 的 突 变 体 植 株 (lc1pa-lc1) 的 叶 倾 角 变 小, 恢 复 了 正 常 形 态, 见 图 5 和 图 6 [0244] LC1 正 义 转 基 因 植 株 (po-lc1), 其 叶 倾 角 明 显 大 于 野 生 型 植 株, 见 图 8 [0245] 在 本 发 明 提 及 的 所 有 文 献 都 在 本 申 请 中 引 用 作 为 参 考, 就 如 同 每 一 篇 文 献 被 单 独 引 用 作 为 参 考 那 样 此 外 应 理 解, 在 阅 读 了 本 发 明 的 上 述 讲 授 内 容 之 后, 本 领 域 技 术 人 员 可 以 对 本 发 明 作 各 种 改 动 或 修 改, 这 些 等 价 形 式 同 样 落 于 本 申 请 所 附 权 利 要 求 书 所 限 定 的 范 16

围 说 明 书 15/15 页 17

序 列 表 1/9 页 [0001] [0002] 18

序 列 表 2/9 页 [0003] 19

序 列 表 3/9 页 [0004] 20

序 列 表 4/9 页 [0005] 21

序 列 表 5/9 页 [0006] 22

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序 列 表 7/9 页 [0008] 24

序 列 表 8/9 页 [0009] 25

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说 明 书 附 图 1/4 页 图 2 图 1 图 3 图 4 27

说 明 书 附 图 2/4 页 图 5 图 6 图 7 28

说 明 书 附 图 3/4 页 图 8 图 9 29

说 明 书 附 图 4/4 页 图 10 30