<4D6963726F736F667420576F7264202D20C3E2D2DFD7E9BBAFB5C4B2A1C0EDD6C6C6ACBCBCCAF5B9E6B7B62E646F63>

一 H-E 技 术 操 作 规 范 1. 及 时 固 定 组 织 : 免 疫 组 化 的 病 理 制 片 技 术 的 规 范 应 采 用 10%~20% 甲 醛 液 (10% 甲 醛 液 即 用 浓 甲 醛 液 1 份 加 蒸 馏 水 9 份 稀 释 ) 固 定 组 织, 因 甲 醛 易 氧 化 成 甲 酸, 因 此 多 会 偏 酸 性, 最 理 想 的 是 配 成 中 性 甲 醛 液 巨 大 组 织 要 切 开 固 定, 小 块 组 织 的 固 定 时 间 约 4h 左 右, 然 后 取 材 时 修 切 成 大 小 约 22 x 22mm, 厚 不 超 过 2mm 的 组 织 块 进 行 脱 水 取 材 时 必 须 注 意 核 对 编 号 是 否 与 送 检 单 上 的 病 理 号 一 致, 并 记 录 好 对 大 体 标 本 的 描 述, 取 材 组 织 的 形 状 和 数 量 细 胞 爬 片 的 固 定 ;37 度 0.01M PBS ph7.0 洗 三 遍 置 37 PBS 中 10-30min, 透 析 残 留 培 养 基 37 0.01 M PBS ph7.0 洗 三 遍,4% 多 聚 甲 醛 固 定 细 胞 室 温 2h,0.01 M PBS 洗 三 遍, 晾 干 4 度 保 存 两 周 2. 脱 水 彻 底 : 脱 水 液 常 用 乙 醇, 用 乙 醇 脱 水 要 由 低 浓 度 逐 级 上 行 至 高 浓 度 ( 一 般 70%~100% 的 浓 度 ), 逐 步 置 换 组 织 内 的 水 份 组 织 在 乙 醇 脱 水 时, 低 浓 度 乙 醇 的 时 间 可 适 当 延 长, 高 浓 度 乙 醇 脱 水 时 间 不 能 过 长 3. 透 明 充 分 : min 透 明 液 多 采 用 二 甲 苯, 组 织 脱 水 后 转 入 二 甲 苯, 依 据 组 织 的 大 小 厚 薄, 约 置 30-90 4. 浸 蜡 足 够 : 浸 蜡 多 用 纯 净 而 熔 点 稍 低 (56-58 ) 的 石 蜡, 浸 蜡 时 采 用 三 级 或 四 级, 以 尽 量 清 除 二 甲 苯 浸 蜡 时 间 依 据 组 织 大 小 厚 薄 而 定, 一 般 为 1-2h 浸 蜡 时 包 埋 机 所 设 定 的 温 度 应 比 所 用 石 蜡 熔 点 稍 高 以 保 持 石 蜡 恰 在 熔 溶 状 态 这 样, 组 织 才 能 取 得 良 好 的 浸 蜡 效 果 如 浸 蜡 温 度 过 高, 导 致 组 织 收 缩, 变 硬 变 脆, 难 以 切 出 理 想 切 片 5. 包 埋 恰 当 : 包 埋 时, 包 埋 石 蜡 的 温 度 要 比 组 织 高 ( 约 3-5 ), 否 则 包 埋 冷 凝 后 组 织 与 包 埋 石 蜡 分 离, 特 别 是 在 冷 天 包 埋 时, 动 作 更 要 迅 速, 否 则 容 易 导 致 组 织 与 石 蜡 融 合 不 好, 影 响 切 片 包 埋 是 时 把 组 织 最 大 最 平 切 面 或 所 需 是 病 灶 切 面 向 下, 对 皮 肤 肠 管 和 囊 壁 等 层 次 清 楚 的 组 织 其 切 面 应 包 含 有 各 层 组 织 组 织 包 埋 完 后, 要 与 取 材 时 记 录 的 组 织 形 状 和 数 量 核 对, 发 现 问 题, 及 时 解 决 6. 切 片 要 薄 : 要 把 刀 架 上 的 切 片 清 除 角 调 至 2-5 度, 在 此 角 范 围 内, 才 能 切 出 良 好 蜡 片 使 用 一 次 性 刀 片, 可 转 动 刀 座 上 的 弧 形 刻 度 盘 选 取 最 合 适 的 刻 度 ( 该 合 适 刻 度 并 不 等 于 真 正 的 切 片 清 除 角 ) 切 片 前 要 把 切 片 机 上 有 关 的 各 螺 旋 拧 紧, 如 没 有 拧 紧 或 包 埋 少 组 织 蜡 块 过 硬 时 就 会 出

现 跳 片, 使 蜡 片 成 一 截 厚 一 截 薄 切 片 的 厚 度 应 为 3-4µm, 对 一 些 组 织 如 淋 巴 结 鼻 咽 和 扁 桃 体, 切 片 的 厚 度 应 为 2-3µm 7. 贴 片 烤 片 : 切 出 的 蜡 片 应 放 在 恒 温 贴 片 盆 内 展 开, 并 根 据 所 用 包 埋 石 蜡 的 温 度 调 节 水 温 在 42-46 度 左 右 为 了 利 于 展 平 蜡 片, 可 先 把 蜡 片 放 在 一 缸 缸 约 10-15% 乙 醇 内, 然 后 用 玻 片 再 将 蜡 片 移 至 恒 温 贴 片 盆, 由 于 水 的 表 面 张 力 比 乙 醇 大, 蜡 片 由 乙 醇 移 至 水 后 就 很 容 易 展 平 贴 片 时 再 注 意 定 点 和 定 向 最 后 即 可 置 入 约 60-65 度 的 烤 片 箱 内 烤 15-30min, 也 可 放 在 热 板 上 烘 干, 蜡 片 就 可 牢 固 地 粘 附 在 载 玻 片 或 盖 玻 片 上 8. 切 片 在 染 色 前 必 须 脱 蜡 干 净 : 未 完 全 脱 蜡 的 组 织 切 片, 染 色 后 组 织 和 细 胞 模 糊 不 清 脱 蜡 要 用 两 级 或 三 级 脱 蜡 剂 如 二 甲 苯, 时 间 为 10-20min, 应 视 所 用 二 甲 苯 的 新 旧 以 及 室 温 情 况 而 定 脱 蜡 时 间 宁 可 长 些, 不 应 过 短 9. 苏 木 素 染 液 一 定 要 配 好 : 苏 木 素 液 配 制 的 好 坏, 决 定 染 色 的 优 劣 苏 木 素 配 制 有 多 种 配 方, 关 键 在 于 氧 化 如 加 氧 化 汞 作 氧 化 剂 时, 要 防 止 氧 化 过 度, 同 时 注 意 形 成 的 氧 化 膜 污 染 切 片 加 碘 酸 钠 作 氧 化 剂 时, 就 无 需 把 苏 木 素 液 煮 沸 要 配 制 自 然 成 熟 的 苏 木 素 则 不 需 加 氧 化 剂, 但 要 较 长 时 间 才 能 氧 化 成 熟 不 同 苏 木 素 染 液 的 染 色 时 间 为 5-20min, 自 然 氧 化 成 熟 的 苏 木 素 液 染 色 时 间 可 以 更 长 10. 掌 握 好 盐 酸 酒 精 的 分 化 : 这 是 一 个 重 要 环 节 分 化 时 间 的 长 短 视 组 织 的 性 质, 切 片 的 厚 薄, 苏 木 素 染 色 的 深 浅 来 决 定, 一 般 是 1~2 秒, 若 切 片 不 分 化 或 分 化 不 足, 组 织 着 色 过 深 使 核 浆 的 景 界 不 清 楚 ; 若 分 化 过 度, 胞 核 过 淡 不 清 晰 用 Mayer`s 苏 木 素 染 色, 通 常 都 不 分 化 盐 酸 酒 精 分 化 后, 切 片 留 有 酸 液, 易 使 切 片 褪 色 另 一 方 面 苏 木 素 经 流 水 冲 洗 来 促 兰 流 水 冲 洗 一 般 需 15-30min 如 要 说 短 时 间, 可 用 碱 性 的 促 蓝 液 代 替 流 水 冲 洗 11. 曙 红 染 色 要 适 宜 : 曙 红 是 作 为 对 比 染 色, 染 色 时 不 应 染 的 太 红, 也 不 能 染 得 太 淡, 否 则 红 兰 对 比 不 鲜 明 每 200mL 曙 红 水 溶 液 加 一 滴 冰 醋 酸 可 起 促 染 作 用, 如 加 酸 太 多, 可 使 曙 红 沉 淀 而 慢 慢 失 效 曙 红 水 溶 液 易 发 霉, 每 缸 曙 红 液 加 入 甲 醛 液 1-2 滴 有 防 霉 作 用 12. 切 片 脱 水 透 明 要 彻 底 : H-E 染 色 后, 要 彻 底 脱 水 透 明, 才 能 进 行 树 胶 封 盖, 成 为 永 久 标 本 如 果 脱 水 透 明 不 彻 底, 封 片 后 呈 白 色 雾 状, 镜 下 模 糊 不 清, 过 一 段 时 间 染 片 就 褪 色 脱 水 要 经 过 多 次 无 水 乙 醇, 也 可 使 用 石 炭 酸 二 甲 苯 进 行 脱 水 如 采 用 后 者, 染 片 要 经 过 多 次 二 甲 苯 以 除 去 石 炭 酸

13. 封 胶 要 求 中 性, 浓 度 适 宜 : 酸 性 的 树 胶 可 使 胞 核 褪 色, 如 树 胶 放 置 时 间 过 长, 因 氧 化 而 变 酸 国 产 树 胶 偏 酸, 易 使 切 片 褪 色 树 胶 过 浓, 封 片 时 容 易 导 致 气 泡, 树 胶 过 稀, 封 片 时 使 胶 外 溢, 影 响 美 观 14. 在 整 个 染 色 过 程 中 不 让 切 片 干 涸 : 切 片 完 全 干 涸, 会 使 组 织 收 缩 割 裂, 形 成 所 谓 龟 裂 现 象 也 会 使 部 分 细 胞 核 透 明 不 良, 看 起 来 像 黑 色 的 细 胞 核 H-E 切 片 的 质 量 要 求 一 张 高 质 量 的 HE 切 片 要 做 到 : 1. 切 片 完 整 贴 片 恰 当 2. 切 片 较 薄 而 均 匀 3. 无 皱 折 4. 无 刀 痕 5. 染 色 清 晰 核 浆 分 明 透 明 度 好 6. 无 固 缩 龟 裂 污 染 7. 封 胶 适 当 玻 片 清 洁 8. 字 体 端 正 号 码 清 楚 二 组 织 化 学 技 术 操 作 规 范 组 织 化 学 技 术 制 片 与 一 般 的 制 片 基 本 相 同, 但 在 操 作 上 有 其 特 殊 的 要 求 ( 一 ) 组 织 化 学 技 术 对 组 织 细 胞 前 处 理 的 要 求 1. 组 织 切 片 方 法 根 据 所 检 测 物 质 的 性 质 及 所 采 用 的 染 色 方 法, 组 织 切 片 分 为 冷 冻 切 片 和 石 蜡 切 片 ( 培 养 的 细 胞 也 可 分 为 细 胞 涂 片 细 胞 冷 冻 切 片 和 细 胞 石 蜡 切 片 ) 在 冷 冻 切 片 中, 组 织 细 胞 的 各 种 成 份 丢 失 最 少, 但 形 态 结 构 差, 可 溶 性 物 质 弥 散 ; 石 蜡 切 片 中 组 织 细 胞 的 许 多 特 殊 物 质 减 少 甚 至 丢 失, 酶 活 性 降 低 甚 至 失 去 活 性, 但 形 态 结 构 好, 所 需 显 示 的 物 质 定 位 清 晰 2. 组 织 的 固 定 无 论 用 于 冷 冻 切 片 的 组 织, 取 材 越 新 鲜 越 好, 以 保 持 生 物 体 的 原 状, 使 细 胞 内 的 化 学 成 份 尽 可 能 保 存 下 来 组 织 取 材 后 应 立 即 进 行 冷 冻 切 片, 切 片 可 于 -20 或 -80 保 存 若 作 石 蜡 切 片, 组 织 取 材 后 即 进 行 固 定, 因 所 检 测 的 物 质 不 同 选 用 不 同 的 固 定 液 及 固 定 时 间 最 常 用 的 固 定 方 法 是 用 固 定 液 浸 泡 组 织 固 定 液 有 多 种, 不 同 的 固 定 液 具 有 不 同 的 作 用, 至 今 还 没 有 一 种 固 定 液 能 用 于 所 有 染 色 的 组 织 固 定, 最 常 用 用 途 最 广 的 是 甲 醛 液 欲 保 存 固 定 肝 糖 原 则 不 能 用 甲 醛 固 定 液, 需 要 用 酒 精 固 定 液, 如,Gender 或 Cranky 氏 固 定 液 在 组 织 固 定 过 程 中, 不 能 溶 解 细 胞 内 的 化

学 物 质, 使 所 显 示 的 物 质 不 会 出 现 移 位 现 象, 定 位 准 确 如 用 酒 精 性 固 定 液 固 定 肝 糖 原, 会 将 糖 原 颗 粒 推 向 细 胞 的 一 边, 称 为 极 化 现 象, 属 于 一 种 人 为 改 变, 对 定 位 有 影 响, 在 观 察 时 应 注 意 ( 二 ) 组 织 化 学 染 色 方 法 的 基 本 要 求 1. 组 织 化 学 染 色 方 法 要 有 较 高 的 特 异 性, 能 特 异 地 显 示 所 需 要 观 察 的 物 质 组 织 化 学 染 色 与 常 规 HE 染 色 不 同, 每 种 组 化 反 应 都 需 要 某 种 特 殊 的 染 料 试 剂 或 底 物, 需 要 一 定 的 染 色 时 间 和 ph 环 境, 使 该 反 应 对 所 显 示 的 物 质 具 有 一 定 的 专 属 性 在 染 色 的 操 作 过 程 中, 应 采 用 已 知 含 有 或 不 含 有 所 显 示 的 物 质 的 标 本 进 行 阳 性 和 阴 性 对 照, 以 证 实 该 方 法 的 特 异 性 和 操 作 的 准 确 性 2. 组 织 化 学 染 色 方 法 要 具 有 一 定 敏 感 性, 方 法 越 是 敏 感, 越 能 检 测 组 织 细 胞 中 含 量 少 的 物 质 3. 组 织 化 学 染 色 在 组 织 或 细 胞 内 所 产 生 的 反 应 产 物 必 须 具 有 一 定 的 颜 色, 该 颜 色 越 鲜 艳 越 深 越 好 显 示 一 种 物 质 可 有 不 同 的 染 色 方 法, 阳 性 反 应 有 不 同 的 颜 色, 选 用 的 方 法 应 使 阳 性 物 颜 色 鲜 艳, 深 色, 而 复 染 的 底 色 要 浅 淡, 这 样 对 比 才 清 晰, 易 于 观 察 及 照 相 4. 组 织 化 学 染 色 最 后 显 示 出 来 的 物 质 要 具 有 稳 定 性, 尽 可 能 不 被 制 片 过 程 中 所 用 的 化 学 试 剂 所 影 响 在 染 色 过 程 中, 避 免 使 用 减 弱 破 坏 或 溶 解 阳 性 物 的 试 剂 如, 着 染 苏 丹 的 脂 肪 要 用 水 溶 性 胶 封 片, 不 能 经 二 甲 苯 透 明 和 中 性 树 胶 封 片 组 织 化 学 技 术 的 某 些 方 法 还 存 在 着 不 能 完 善 的 地 方, 如 要 保 持 较 好 的 组 织 细 胞 形 态 结 构, 使 被 检 测 的 物 质 定 位 准 确, 则 需 要 用 石 蜡 切 片 染 色, 但 组 织 在 制 作 石 蜡 切 片 的 固 定 脱 水 和 包 埋 过 程 中, 被 检 测 的 物 质 会 受 到 破 坏 甚 至 消 失 如 在 石 蜡 切 片 中, 肾 组 织 的 酸 性 磷 酸 酶 活 性 仅 保 留 20%; 心 肌 的 琥 珀 酸 脱 氢 酶 则 全 部 失 去 活 性 在 肝 糖 原 染 色 中 用 10% 甲 醛 液 固 定 肝 组 织 可 使 肝 糖 原 完 全 溶 解 消 失, 改 用 酒 精 性 固 定 液 可 保 存 肝 糖 原, 但 由 于 固 定 液 渗 透 作 用, 使 肝 糖 原 颗 粒 出 现 移 位 极 化 现 象 用 冷 冻 切 片 可 保 存 大 量 的 酶, 糖 原 丢 失 极 少, 又 不 会 出 现 极 化 现 象, 但 组 织 形 态 结 构 及 阳 性 物 质 定 位 较 差 此 外, 冷 冻 切 片 容 易 出 现 冰 晶, 破 坏 原 有 的 组 织 结 构, 影 响 观 察 有 些 存 在 于 组 织 细 胞 中 的 化 学 物 质 较 为 复 杂, 往 往 需 要 用 多 种 染 色 方 法 来 进 行 鉴 别, 如 用 AB(PH2.5) 法 可 显 示 一 般 的 粘 液 ; 要 区 分 中 性 和 酸 性 粘 液 需 要 用 AB-PAS 染 色 法 ; 酸 性 粘 液 中 要 区 分 硫 酸 粘 液 和 唾 液 酸 粘 液 要 用 HID-AB 染 色 法 免 疫 组 织 化 学 技 术 操 作 规 范 ( 一 ) 组 织 切 片 的 要 求 免 疫 组 织 化 学 技 术 适 用 于 冷 冻 切 片 和 石 蜡 切 片, 部 分 抗 体 只 能 用 于 冷 冻 切 片, 大 部 分 抗 体 可 用 于 石 蜡 切 片, 适 用 于 石 蜡 切 片 也 适 用 于 冷 冻 切 片 冷 冻 切 片 能 很 好 地 保 存 组 织 抗 原, 抗 原 丢 失 少, 但 形 态 结 构 差, 定 位 不 很 清 晰 ; 石 蜡 切 片 组 织 形 态 结 构 好, 定 位 清 晰, 但 在 组

织 的 固 定 脱 水 包 埋 过 程 中 容 易 破 坏 组 织 抗 原, 使 抗 原 的 免 疫 活 性 有 所 降 低 ( 二 ) 组 织 的 固 定 组 织 经 过 固 定 可 保 存 组 织 原 有 的 形 态 结 构, 防 止 组 织 抗 原 弥 散, 常 用 的 固 定 液 为 10% 甲 醛 液, 最 好 选 用 10% 中 性 甲 醛 液, 固 定 时 间 为 4-6 小 时 固 定 时 间 不 足, 组 织 结 构 不 佳, 组 织 抗 原 弥 散 ; 固 定 时 间 过 长, 可 封 闭 或 破 坏 组 织 抗 原 ( 三 ) 载 玻 片 的 处 理 组 织 切 片 贴 在 载 玻 片 上 进 行 免 疫 组 织 化 学 染 色, 由 于 染 色 工 程 操 作 步 骤 及 冲 洗 次 数 较 多, 容 易 出 现 脱 片 现 象, 因 此 将 载 玻 片 涂 胶 或 硅 化 是 必 要 的 较 常 用 较 好 的 是 采 用 APES 硅 化 玻 片 ( 四 ) 组 织 切 片 前 处 理 ( 免 疫 组 化 组 织 通 透 性 的 改 变 和 修 复, 以 便 充 分 暴 露 抗 原 ) 经 甲 醛 液 固 定, 石 蜡 包 埋 的 组 织 在 固 定 过 程 中, 组 织 中 的 抗 原 蛋 白 与 甲 醛 产 生 交 联, 使 得 组 织 中 抗 原 的 决 定 簇 被 封 闭, 抗 体 难 以 和 抗 原 充 分 结 合 因 此 要 进 行 组 织 切 片 前 处 理, 目 的 是 打 开 组 织 抗 原 蛋 白 与 甲 醛 的 交 联, 暴 露 组 织 抗 原, 以 提 高 组 织 抗 原 的 检 出 率 组 织 切 片 前 处 理 ( 也 称 抗 原 修 复 ) 常 用 的 主 要 有 以 下 方 法 : 1. 胰 蛋 白 酶 消 化 : 将 切 片 置 入 胰 蛋 白 酶 消 化 液 ( 0.2% 胰 蛋 白 酶, 0.1% 氯 化 钙 水 溶 液 ph 7.8) 消 化 30min,37 2. 微 波 加 热 : 将 切 片 置 入 0.01 mol/l 柠 檬 酸 缓 冲 液 (ph6.0) 内, 用 微 波 炉 最 大 功 率 加 热 10min, 自 然 冷 却 3. 水 煮 法 : 将 切 片 置 入 蒸 馏 水 内, 加 热 至 沸 腾 持 续 10min, 自 然 冷 却 4. 高 压 锅 加 热 法 : 用 高 压 锅 加 热 0.01 mol/l 柠 檬 酸 缓 冲 液 (ph6.0) 至 沸 腾, 放 入 切 片, 盖 紧 高 压 锅 盖, 继 续 加 热 至 减 压 阀 喷 气, 计 时 90 秒 钟 至 2min, 自 然 冷 却 5. 联 合 处 理 法 : 按 上 述 方 法 先 进 行 胰 蛋 白 酶 消 化, 然 后 再 进 行 水 煮 法 或 微 波 加 热 法 或 高 压 加 热 法 是 否 进 行 切 片 前 处 理 要 按 第 一 抗 体 说 明 书 的 要 求, 切 片 前 处 理 通 常 可 以 提 高 免 疫 组 化 染 色 的 阳 性 率, 但 并 非 所 有 的 抗 体 染 色 均 需 要 前 处 理 切 片 前 处 理 不 当 会 出 现 : 假 阳 性 假 阴 性 或 阳 性 定 位 改 变 ( 五 ) 内 源 性 过 氧 化 物 酶 的 消 除 组 织 中 的 粒 细 胞 单 核 细 胞 及 红 血 球 等 存 在 内 源 性 过 氧 化 物 酶, 可 与 显 色 剂 DAB AEC 起 反 应 而 造 成 假 阳 性, 因 此, 在 显 色 前 要 把 这 些 内 源 性 过 氧 化 物 酶 消 除, 方 法 是 用 3% 过 氧 化 氢 ( 用 90-100% 甲 醇 配 ) 作 用 15min 操 作 可 以 在 加 一 抗 之 前 也 可 以 在 加 一 抗 之 后 ( 六 ) 内 源 性 生 物 素 的 消 除 组 织 细 胞 中 存 在 着 内 源 性 生 物 素, 在 应 用 与 卵 白 素 结 合 或 生 物 素 标 记 抗 体 的 免 疫 组 化 检 测 系 统 检 测 组 织 细 胞 中 的 抗 原 时, 内 源 性 生 物 素 容 易 与 ABC 法 中 的 卵 白 素 (avidin) 或 S-P

(LSAB) 法 中 的 链 霉 菌 抗 生 物 素 蛋 白 (streptavidin) 结 合, 引 起 假 阳 性 因 此 在 加 一 抗 之 前 或 在 加 一 抗 之 后 需 要 消 除 内 源 性 生 物 素 消 除 内 源 性 生 物 素 的 方 法 有 :(1) 用 鸡 蛋 清 或 卵 白 素 封 闭 (2) 采 用 不 含 卵 白 素 或 生 物 素 的 免 疫 组 化 检 测 系 统 检 测 如 Envision/Elivision 二 步 法 和 EPOS 一 步 法 等 ( 七 ) 高 敏 感 免 疫 组 化 染 色 方 法 的 选 用 免 疫 组 织 化 学 技 术 的 特 点 之 一 是 敏 感 性 高, 就 是 能 把 抗 原 抗 体 结 合 物 特 异 性 地 放 大 目 前, 免 疫 组 化 染 色 方 法 有 一 步 法, 二 步 法 和 三 步 法 一 般 来 说, 抗 体 与 抗 体 的 连 接 步 骤 少, 特 异 性 高, 敏 感 性 低 ; 反 之, 连 接 步 骤 多, 特 异 性 低, 敏 感 性 高 但 是, 不 同 公 司 生 产 的 试 剂 盒, 技 术 由 于 不 断 地 改 进 和 提 高, 在 特 异 性 和 敏 感 性 方 面 各 有 特 点 各 实 验 室 可 以 根 据 自 己 的 实 际 情 况 对 照 比 较, 合 理 选 用 目 前 应 用 最 广 泛 的 是 S-P(LSAB) 三 步 法 和 Envision / Elivision 二 步 法 同 一 种 染 色 方 法, 因 检 测 试 剂 盒 的 不 同 其 敏 感 性 不 同, 第 一 抗 体 的 稀 释 度 也 不 同 ( 八 ) 酶 标 抗 体 系 统 中 的 酶 与 显 色 剂 在 LSAB 等 常 用 免 疫 组 化 方 法 中, 与 抗 体 连 接 的 酶 主 要 有 辣 根 过 氧 化 物 酶 (HRP) 和 碱 性 磷 酸 酶 (AP), 显 色 剂 有 DAB AEC 固 红 和 固 蓝 等 在 HRP 系 统 用 DAB 和 AEC 等 作 显 色 剂, DAB 显 色 阳 性 物 呈 棕 色,AEC 呈 红 色 ;AP 系 统 用 NBT/BCIP, 固 红 和 固 蓝 作 显 色 剂, 固 红 显 色 阳 性 物 呈 红 色, 而 固 蓝 呈 蓝 色 DAB 显 色 形 成 的 沉 淀 物 最 稳 定 和 不 易 褪 色, 较 为 常 用, 用 其 是 致 癌 物, 故 要 避 免 接 触 皮 肤 和 污 染 环 境 ( 九 ) 实 验 对 照 为 证 实 抗 体 和 检 测 试 剂 盒 效 价 是 否 可 靠, 染 色 操 作 是 否 正 确, 一 般 需 要 进 行 实 验 对 照, 以 避 免 试 剂 失 效 或 操 作 失 当 而 出 现 假 阴 性 和 假 阳 性, 确 保 染 色 结 果 的 可 靠 性 1. 阳 性 对 照 : 选 用 已 知 染 色 中 度 阳 性 以 上 的 组 织 切 片 染 色, 阳 性 切 片 应 呈 阳 性, 此 外 组 织 中 的 内 对 照 也 是 很 好 的 阳 性 对 照 初 学 者 应 设 阳 性 对 照 2. 阴 性 对 照 : 选 用 已 知 染 色 阴 性 的 组 织 切 片 染 色, 其 结 果 应 为 阴 性, 一 般 来 说, 阴 性 对 照 和 阳 性 对 照 同 时 进 行, 或 其 中 有 阳 性 染 色 结 果 时 才 有 意 义 ( 十 ) 抗 体 的 保 存 和 稀 释 抗 体 应 于 低 温 保 存, 第 一 抗 体 可 分 成 少 包 装 于 -20 保 存, 使 用 时 存 放 在 4, 不 宜 反 复 存 放 于 4 和 -20 之 间 检 测 试 剂 盒 一 般 存 放 于 4, 不 宜 于 -20 保 存, 如 长 时 间 不 用 可 存 放 于 -20, 解 冻 使 用 后 则 不 能 再 存 放 于 0 以 下, 因 为 反 复 冻 融 使 得 与 抗 体 结 合 的 酶 容 易 分 解, 导 致 检 测 的 敏 感 度 降 低

浓 缩 的 抗 体 在 染 色 前 应 根 据 说 明 书 要 求 或 自 行 摸 索 出 的 最 佳 工 作 浓 度 进 行 稀 释 日 常 工 作 量 不 多 时, 可 将 抗 体 稀 释 至 1:5-20, 染 色 前 再 稀 释 成 工 作 液 浓 缩 液 抗 体 保 存 的 时 间 较 长, 反 之 稀 释 后 的 抗 体 保 存 的 期 限 较 短, 如 使 用 即 用 型 抗 体, 经 过 一 定 时 间 后 应 注 意 其 效 价 时 否 有 所 降 低, 避 免 出 现 假 阴 性 染 色 抗 体 稀 释 液 可 用 0.01mol/L PBS ph7.4, 在 PBS 中 加 入 1%BSA 和 1% 正 常 稀 释 后 的 稀 释 抗 体, 对 减 轻 非 特 异 性 背 景 染 色 有 所 帮 助 ( 十 一 ) 染 色 结 果 的 观 察 阳 性 结 果 应 定 位 在 细 胞 中 相 应 的 部 位, 在 细 胞 膜 表 达 的 抗 原 阳 性 结 果 应 定 位 在 细 胞 膜 上, 在 其 他 部 位 的 阳 性 反 应 均 为 非 特 异 性 染 色 不 当 的 抗 原 修 复 会 导 致 抗 原 在 组 织 细 胞 中 定 位 的 改 变 根 据 所 检 测 抗 原 的 不 同, 抗 原 分 别 定 位 在 :(1) 细 胞 膜, 如 LCA 和 UCHL1 等 ;(2) 细 胞 质, 如 Keratin 和 Lysozyme 等 ;(3) 细 胞 核, 如 PCNA 和 ER 等 ( 十 二 ) 免 疫 组 织 化 学 染 色 后 的 对 比 染 色 背 景 免 疫 组 织 化 学 染 色 后 需 要 对 比 染 色 细 胞 核, 以 将 组 织 细 胞 结 构 显 示 出 来, 使 免 疫 组 织 化 学 染 色 结 果 定 位 清 晰 免 疫 组 织 化 学 染 色 结 果 根 据 显 色 剂 的 不 同 而 不 同, 有 棕 色 蓝 色 和 红 色, 对 比 染 色 细 胞 核 的 颜 色 也 因 染 液 不 同 而 不 同, 一 般 有 蓝 色 ( 苏 木 素 ) 绿 色 ( 甲 基 绿 ) 和 红 色 ( 核 固 红 ) 三 种 应 根 据 颜 色 对 比 清 晰 的 原 则 进 行 搭 配, 常 用 的 是 DAB 显 色 呈 棕 色 Mayer`s 苏 木 素 复 染 细 胞 核 呈 蓝 色 ( 十 三 ) 染 色 操 作 注 意 事 项 1. 石 蜡 切 片 脱 蜡 要 彻 底 2. 第 一 抗 体 分 为 单 克 隆 ( 鼠 抗 ) 和 多 克 隆 ( 兔 抗 ) 抗 体, 检 测 试 剂 盒 中 的 第 二 抗 体 也 有 分 为 抗 鼠 和 抗 兔 抗 体, 不 能 连 接 错, 否 则 一 抗 二 抗 连 接 不 上 而 导 致 假 阴 性 的 染 色 结 果 最 好 比 选 用 即 是 抗 鼠 又 是 抗 兔 的 抗 体 3. 抗 体 孵 育 时 间 随 孵 育 温 度 升 高 而 减 少, 但 一 般 不 超 过 37 度 一 般 一 抗 置 于 4 度 孵 育 过 夜 较 佳 4. 滴 加 抗 体 应 完 全 覆 盖 组 织, 避 免 引 起 组 织 边 缘 效 应 5. 由 于 一 种 染 色 方 法, 因 试 剂 盒 的 不 同 其 敏 感 性 不 同, 第 一 抗 体 的 稀 释 度 也 不 同 6. 不 当 的 组 织 切 片 前 处 理 有 可 能 出 现 假 阳 性 或 假 阴 性 的 结 果 7. 组 织 的 周 边 刀 痕 皱 折 等 部 位 往 往 呈 阳 性 反 应, 但 绝 大 多 数 都 是 非 特 异 性 染 色 8. 染 色 结 果 呈 阴 性 并 非 都 是 抗 原 不 表 达, 要 考 虑 是 否 与 组 织 中 的 抗 原 受 到 破 坏 有 关 9. 组 织 切 片 背 景 深 与 下 列 因 素 有 关 : (1) 第 一 抗 体 浓 度 太 高 或 孵 育 时 间 过 长, 温 度 过 高 (2) 显 色 剂 DAB 浓 度 过 高 或 H2O2 太 多 (3) 正 常 血 清 封 闭 之 后 滴 加 第 一 抗 体 之 前 用 了 PBS 洗

(4) 抗 体 纯 度 不 高 (5) 抗 体 孵 育 切 片 后 冲 洗 不 干 净 ( 十 四 ) 抗 体 的 保 存 和 稀 释 抗 体 应 于 低 温 保 存, 第 一 抗 体 可 分 成 小 包 装 于 -20 保 存, 使 用 时 存 放 在 4, 不 宜 反 复 存 放 于 4 和 -20 之 间 检 测 试 剂 盒 一 般 存 放 于 4, 不 宜 于 -20 保 存, 如 长 时 间 不 用 可 存 放 于 -20, 解 冻 使 用 后 则 不 能 再 存 放 于 0 以 下, 因 为 反 复 冻 融 使 得 与 抗 体 结 合 的 酶 容 易 离 解, 导 致 检 测 的 敏 感 度 降 低 浓 缩 的 抗 体 在 染 色 前 应 根 据 说 明 书 要 求 或 自 行 摸 索 出 的 最 佳 工 作 浓 度 进 行 稀 释 日 常 工 作 量 不 多 时, 可 将 抗 体 稀 释 至 1:5-20, 染 色 前 再 稀 释 成 工 作 液 浓 缩 液 抗 体 保 存 的 时 间 较 长, 反 之 稀 释 后 的 抗 体 保 存 的 期 限 较 短, 如 使 用 即 用 型 抗 体, 经 过 一 定 时 间 后 应 注 意 其 效 价 是 否 有 所 降 低, 避 免 出 现 假 阴 性 染 色 抗 体 稀 释 液 可 用 商 品 化 的 抗 体 稀 释 液, 也 可 以 用 0.01mol/L PBS( ph7.4), 在 PBS 中 加 入 1%BSA 和 10% 正 常 血 清 后 稀 释 抗 体, 对 减 轻 非 特 异 性 背 景 染 色 有 所 帮 助 免 疫 组 化 异 常 染 色 结 果 的 评 价 良 好 的 免 疫 组 化 染 色 切 片 是 正 确 判 断 染 色 结 果 的 前 提 由 于 免 疫 组 化 染 色 过 程 中 存 在 很 多 步 骤, 每 一 个 步 骤 都 可 能 影 响 到 染 色 的 最 终 结 果, 因 此, 要 做 好 一 张 高 质 量 的 免 疫 组 化 切 片 并 不 是 一 件 非 常 容 易 的 事 虽 然 免 疫 组 化 染 色 可 以 存 在 各 种 各 样 的 问 题, 但 从 染 色 的 结 果 看, 一 般 可 分 为 两 类 : 无 色 片 ( 即 无 阳 性 信 号 ) 和 噪 音 染 色 片 ( 有 阳 性 信 号 ) 一 无 色 片 染 色 结 束 后, 切 片 中 见 不 到 任 何 阳 性 信 号 这 是 常 规 工 作 中 比 较 常 见 的 现 象, 出 现 这 种 现 象, 有 两 种 可 能 : 1. 真 阴 性 结 果 : 整 个 染 色 过 程 没 有 出 现 问 题, 组 织 或 细 胞 确 实 不 表 达 与 抗 体 相 关 的 抗 原 2. 假 阴 性 结 果 : 即 此 阴 性 结 果 不 是 真 实 的 反 映 假 阴 性 结 果 又 可 分 为 两 种 情 况 : (1) 切 片 中 根 本 就 不 包 含 所 预 期 检 测 的 组 织 或 细 胞 出 现 这 种 情 况, 要 么 是 选 择 错 了 切 片 或 抗 体 选 错 了 (2) 染 色 过 程 中 的 某 一 或 某 些 环 节 出 了 问 题 比 如, 组 织 未 进 行 抗 原 修 复, 有 的 组 织 必 须 经 过 抗 原 修 复 才 能 检 测 抗 原 表 达 ; 或 选 用 了 只 能 用 于 冰 冻 组 织 而 不 能 用 于 石 蜡 包 埋 组 织 的 抗 体 ; 或 一 抗 失 效, 虽 然 抗 体 失 效 在 理 论 上 是 一 个 逐 渐 的 过 程, 但 偶 尔 也 遇 到 突 然 失 效 的 情 况, 抗 体 长 期 不 用 和 / 或 已 超 过 有 效 期 是 主 要 的 原 因 也 可 见 于 染 色 过 程 中 漏 掉 了 某 一 环 节, 如 忘 记 加 二 抗 或 三 抗, 或 用 了 两 次 二 抗 而 缺 少 了 三 抗, 或 配 制 DAB 时 没 加 过 氧 化 氢 解 决 上 述 问 题 的 唯 一 办 法 是 写 好 实 验 记 录 解 决 阴 性 染 色 的 问 题 非 常 简 单, 就 是 设 立 阳 性 对 照 如 果 阳 性 对 照 有 了 表 达, 说 明 染

色 的 全 过 程 和 所 有 试 剂 都 没 有 问 题 如 果 此 时 测 试 片 仍 为 阴 性, 便 是 真 实 的 阴 性, 说 明 组 织 或 细 胞 没 有 相 应 的 抗 原 表 达 反 之, 如 果 阳 性 对 照 没 有 着 色, 表 明 染 色 过 程 中 某 个 或 某 些 步 骤 出 了 问 题 或 试 剂 出 了 问 题 应 一 一 寻 找 原 因 阳 性 对 照 包 括 两 种, 一 种 称 为 自 身 对 照 或 内 部 对 照, 这 是 指 在 测 试 的 切 片 中 本 身 就 存 在 已 知 的 抗 原, 如 正 常 淋 巴 结 中 存 在 T 和 B 细 胞 抗 原,CD20 或 CD3 都 应 该 有 表 达 自 身 对 照 是 一 种 比 较 理 想 的 对 照, 对 照 和 测 试 组 织 或 细 胞 都 在 同 一 张 切 片 中, 都 处 于 相 同 的 试 验 条 件 下, 结 果 更 可 靠 也 更 具 有 可 比 性 在 选 择 自 身 对 照 片 时 最 好 选 择 既 有 病 变 组 织 同 时 又 有 正 常 组 织 的 部 分, 这 样 有 利 于 对 比 另 一 种 称 为 外 部 对 照, 有 时 在 测 试 的 切 片 中 不 存 在 已 知 的 抗 原, 如 在 胃 的 标 本 中 怀 疑 是 恶 性 黑 色 素 瘤, 需 要 用 HMB45 或 Mart-1 来 检 测, 在 正 常 的 胃 组 织 中 本 身 不 存 在 相 关 的 抗 原, 如 果 病 变 出 现 阳 性 反 应 结 果, 尚 能 提 示 是 恶 黑, 但 是 如 果 出 现 阴 性 结 果, 就 无 法 确 定 是 本 身 组 织 中 不 含 黑 色 素 瘤 抗 原, 还 是 技 术 问 题 因 此, 应 另 外 设 立 一 个 已 知 的 阳 性 对 照 这 种 在 测 试 组 织 之 外 的 阳 性 对 照 称 为 外 部 对 照 在 实 际 工 作 中 需 要 设 立 外 部 对 照 的 情 况 很 多, 如 果 每 一 种 抗 体 都 要 选 不 同 的 阳 性 对 照, 工 作 量 会 很 大 为 了 解 决 这 个 问 题, 目 前 国 内 外 有 单 位 将 多 种 不 同 组 织 集 成 在 一 起, 制 成 多 组 织 切 片 腊 肠 春 卷 切 片 组 织 芯 片 等, 其 连 续 切 片 储 备 待 用, 需 要 时 取 出 一 张 便 可 作 为 阳 性 对 照 另 外, 比 较 简 单 的 方 法, 是 采 用 阑 尾 作 为 阳 性 对 照, 因 为 与 人 体 其 它 组 织 器 官 比 较 阑 尾 包 含 的 组 织 种 类 较 多, 如 有 上 皮 淋 巴 组 织 平 滑 肌 间 质 神 经 血 管 间 皮 等 一 张 阑 尾 切 片 可 以 检 测 大 多 数 常 用 的 抗 体 抗 体 未 覆 盖 上 测 试 组 织 : 当 多 块 散 开 的 小 组 织 染 色 时, 可 能 漏 掉 某 块 组 织 染 色 二 噪 音 染 色 片 免 疫 组 化 除 正 常 的 真 实 的 阳 性 信 号 外 常 常 会 遇 到 不 正 常 的 背 景 着 色, 这 些 非 正 常 的 着 色 称 为 噪 音 染 色 噪 音 染 色 种 类 繁 多, 产 生 的 原 因 也 多 种 多 样 1. 整 片 着 色 整 片 着 色 是 指 整 个 切 片 全 都 染 上 了 颜 色, 着 色 的 强 度 可 深 可 浅, 总 之, 分 不 清 那 些 组 织 是 阳 性 那 些 组 织 是 阴 性 出 现 这 种 现 象 的 原 因 有 :(1) 抗 体 浓 度 过 高 : 一 抗 浓 度 过 高 是 常 见 的 原 因 之 一 解 决 办 法 是, 每 次 使 用 新 抗 体 前 应 当 对 其 工 作 浓 度 进 行 测 试, 使 每 一 抗 体 个 体 化, 找 到 适 合 自 己 实 验 室 的 理 想 工 作 浓 度, 既 使 是 即 用 型 的 抗 体 也 应 如 此, 不 能 只 简 单 的 按 说 明 书 进 行 染 色 (2) 抗 体 孵 育 时 间 过 长 或 温 度 较 高 : 解 决 办 法 是, 严 格 执 行 操 作 规 程, 最 好 随 身 佩 带 定 时 器, 及 时 提 醒, 避 免 因 遗 忘 而 造 成 时 间 延 长 现 在 流 行 的 二 步 法 (Polymer) 敏 感 性 很 高, 要 求 一 抗 孵 育 的 时 间 不 是 传 统 的 1 小 时, 而 是 30min, 因 此, 要 根 据 染 色 结 果 进 行 调 整 (3)DAB 变 质 和 显 色 时 间 太 长 :DAB 必 需 现 用 现 配, 如 有 沉 渣 应 进 行 过 滤 后 再 用 配 制 好 的 DAB 不 应 存 放 时 间 太 长, 因 为 在 没 有 酶 的 情 况 下, 过 氧 化 氢 也 会 游 离 出 氧 原 子

与 DAB 产 生 反 应 而 降 低 DAB 的 效 力, 剩 余 的 DAB 应 进 行 无 毒 处 理 后 废 弃, 不 要 再 次 使 用 DAB 的 显 色 在 显 微 镜 下 监 控, 达 到 理 想 的 染 色 程 度 时 立 即 终 止 反 应, 切 片 多 时 要 严 格 控 制 每 张 切 片 的 显 色 时 间 避 免 DAB 显 色 时 间 过 长 (30 分 为 宜 ) (4) 组 织 变 干 : 修 复 液 溢 出 后 未 及 时 补 充 液 体 染 色 切 片 太 多 动 作 太 慢 忘 记 滴 液 滴 液 流 失 等 都 是 造 成 组 织 变 干 的 原 因 解 决 的 办 法 是 操 作 要 认 真 仔 细, 采 用 免 疫 组 化 笔 如 DAKO 笔 或 PAP Pen 或 指 甲 油 或 树 胶 在 组 织 周 围 画 圈, 可 以 有 效 的 避 免 液 体 流 失, 也 能 提 高 操 作 速 度 (5) 切 片 在 缓 冲 液 或 修 复 液 中 浸 泡 时 间 太 长 ( 大 于 24 小 时 ) (6) 一 抗 失 效 质 量 差 的 多 克 隆 抗 体 : 注 意 抗 体 的 有 效 期, 过 期 的 抗 体 要 么 不 显 色 要 么 背 景 着 色 用 新 买 的 抗 体 时 最 好 设 立 阳 性 对 照 和 用 使 用 过 的 抗 体 作 比 较 2. 切 片 边 缘 着 色 切 片 边 缘 着 色 ( 边 缘 效 应 ) 也 是 一 种 常 见 的 现 象 主 要 原 因 有 :(1) 组 织 边 缘 与 玻 片 粘 贴 不 牢, 边 缘 组 织 松 脱 漂 浮 在 液 体 中, 每 次 清 洗 不 易 将 组 织 下 面 试 剂 洗 尽 所 致 解 决 办 法 : 制 备 优 质 的 载 玻 片 ( 如 用 APES 或 多 聚 赖 氨 酸 ), 切 出 尽 量 薄 的 组 织 切 片, 不 厚 于 4 微 米, 组 织 的 前 期 处 理 应 规 范, 尽 量 避 免 选 用 坏 死 较 多 的 组 织 (2) 切 片 上 滴 加 的 试 剂 未 充 分 覆 盖 组 织, 边 缘 的 试 剂 容 易 首 先 变 干, 浓 度 较 中 心 组 织 高 而 致 染 色 深 解 决 办 法 : 试 剂 要 充 分 覆 盖 组 织, 应 超 出 组 织 边 缘 2 mm 用 免 疫 组 化 笔 时, 为 了 避 免 油 剂 的 影 响, 画 圈 应 距 组 织 边 缘 3-4 mm 3. 阴 阳 脸 着 色 指 组 织 一 半 着 色 一 半 无 着 色, 形 成 交 界 清 晰 或 不 甚 清 晰 的 两 种 染 色 结 果 其 成 因 是 试 剂 仅 覆 盖 了 部 分 组 织 而 不 是 全 部 如 加 试 剂 后 未 让 试 剂 流 散 开 而 集 中 在 部 分 组 织 上 通 常 应 该 在 加 完 试 剂 后, 仔 细 看 一 遍, 是 否 有 的 组 织 未 被 试 剂 完 全 覆 盖, 如 有 这 种 情 况, 用 吸 头 将 试 剂 水 平 引 流 开 使 之 将 组 织 全 部 覆 盖 另 外, 染 片 盒 不 平, 切 片 倾 斜, 虽 然 开 始 试 剂 已 全 部 覆 盖 了 组 织, 但 后 来 试 剂 流 向 一 边, 部 分 组 织 未 被 试 剂 覆 盖 对 于 这 种 问 题, 只 要 留 心 或 想 到 了 很 容 易 发 现, 也 很 容 易 解 决 有 时, 用 免 疫 组 化 笔 画 圈 时, 划 线 太 靠 近 或 画 到 了 组 织 上, 由 于 笔 油 的 力 学 原 理, 试 剂 不 能 达 到 靠 近 划 线 附 近 的 组 织 还 有 气 泡 也 可 引 起 阴 阳 分 明 的 着 色, 只 是 不 着 色 区 域 是 圆 形, 由 于 气 泡 中 含 气, 试 剂 被 推 到 周 围, 因 此, 气 泡 中 心 的 组 织 不 着 色 解 决 办 法 是 滴 加 试 剂 时 手 法 要 轻, 有 气 泡 时 用 吸 头 捅 破 4. 灶 片 状 着 色 切 片 中 着 色 区 东 一 块 西 一 块, 呈 灶 片 状 分 布, 出 现 这 种 问 题 的 原 因 有 :(1) 裱 片 时 水 未 排 尽, 在 局 部 形 成 气 泡 使 组 织 突 起, 染 色 时 试 剂 渗 入 后 不 易 洗 尽, 显 色 过 深 所 致 解 决 办 法 是, 漂 片 盒 里 的 气 泡 应 去 尽, 晾 片 热 台 不 能 平 放, 应 有 45 度 左 右 的 斜 度, 利 于 水 流 走 和 蒸 发 (2) 坏 死 组 织 灶, 组 织 坏 死 后 细 胞 破 坏 酶 的 释 放 蛋 白 游 离 分 解, 复 杂 的 肽 链

残 段 ( 如 Fc 段 ) 可 能 与 一 抗 或 / 和 二 抗 结 合 导 致 最 终 着 色 解 决 办 法 是 在 选 择 染 色 切 片 时 应 避 免 选 择 坏 死 组 织 较 多 的 切 片 (3) 制 作 APES 胶 片 时, 胶 的 浓 度 太 高, 干 燥 后 在 玻 片 上 留 下 白 色 小 点, 显 色 时 白 色 小 点 着 色 5. 间 质 着 色 着 色 部 位 主 要 在 间 质, 间 质 着 色 的 原 因 很 多, 如 抗 体 与 组 织 中 的 蛋 白 质 因 蛋 白 疏 水 基 团 相 互 作 用 形 成 非 特 异 性 的 连 接 而 着 色, 加 一 抗 前 的 血 清 封 闭 这 一 步 就 是 为 了 避 免 非 特 异 型 的 结 合 又 如 血 清 中 的 免 疫 球 蛋 白 常 常 渗 出 到 组 织 间 质, 很 容 易 与 抗 体 结 合, 造 成 间 质 着 色, 特 别 是 lambda 和 kappa 染 色 时 当 甲 状 腺 胶 质 外 溢 到 组 织 间 质 时, 做 甲 状 腺 球 蛋 白 染 色 也 会 出 现 间 质 着 色 抗 体 不 纯 或 抗 体 被 污 染 也 可 出 现 间 质 着 色, 我 们 曾 遇 到 CD20 抗 体 不 纯, 除 了 染 上 B 细 胞 外 还 染 上 了 间 质 6. 细 胞 浆 着 色 胞 浆 着 色 是 所 有 杂 音 染 色 中 最 具 有 欺 骗 性 的 着 色, 着 色 区 局 限 在 细 胞 内, 间 质 无 着 色, 看 上 去 与 真 实 的 免 疫 反 应 着 色 几 乎 一 样, 很 难 区 别 胞 浆 里 含 有 较 多 的 蛋 白 质, 因 此, 很 多 非 特 异 性 的 染 色 除 了 见 于 间 质 也 可 以 出 现 在 胞 浆 中 这 种 原 因 造 成 的 着 色, 可 以 通 过 血 清 封 闭 解 决 还 有 因 内 源 酶 造 成 的 着 色, 如 血 红 蛋 白 ( 红 细 胞 ) 肌 红 蛋 白 ( 肌 细 胞 ) 细 胞 色 素 ( 粒 细 胞 单 核 细 胞 ) 过 氧 化 氢 酶 ( 肝 肾 ), 这 些 可 用 过 氧 化 氢 进 行 封 闭 巨 噬 细 胞 吞 噬 各 种 抗 原 物 质 或 Fc 片 断 而 出 现 胞 浆 着 色, 这 种 着 色 不 易 避 免, 但 可 以 通 过 形 态 学 辨 认 出 巨 噬 细 胞 而 引 起 重 视 内 源 性 生 物 素 的 着 色 最 具 有 欺 骗 性, 因 为 它 广 泛 的 存 在 于 组 织 细 胞 中, 我 们 研 究 结 果 显 示 : 冰 冻 组 织 中 存 在 内 源 性 生 物 素, 经 福 马 林 固 定 石 蜡 包 埋 后 生 物 素 被 封 闭, 加 热 抗 原 修 复 后 造 成 内 源 性 生 物 素 暴 露, 内 源 性 生 物 素 暴 露 的 强 度 在 不 同 的 组 织 有 所 不 同, 从 弱 阳 性 (+) 到 强 阳 性 (+++), 内 源 性 生 物 素 在 组 织 中 的 分 布 形 式, 既 有 散 在 分 布 也 有 弥 漫 分 布, 主 要 以 颗 粒 状 形 式 存 在 于 胞 浆 中, 内 源 性 生 物 素 广 泛 存 在 于 上 皮 源 性 组 织, 特 别 是 腺 上 皮 组 织, 亦 存 在 部 分 非 上 皮 组 织, 内 源 性 生 物 素 不 仅 存 在 人 体 组 织 也 存 在 大 鼠 组 织, 内 源 性 生 物 素 暴 露 的 强 弱 与 修 复 液 有 关, 其 强 度 增 加 依 次 为 : 柠 檬 酸 EDTA EGTA, 热 抗 原 修 复 暴 露 的 内 源 性 生 物 素 可 被 鸡 蛋 清 封 闭, 非 生 物 素 检 测 系 统 Polymer 两 步 法 (EliVision EnVision) 可 避 免 生 物 素 干 扰 7. 细 胞 核 着 色 不 适 当 的 组 织 处 理 可 以 出 现 细 胞 核 着 色, 如 组 织 在 二 甲 苯 里 浸 泡 时 间 太 长 ( 如 从 星 期 五 浸 泡 到 下 星 期 一 ) 缓 冲 液 中 浸 泡 时 间 太 长 组 织 变 干 微 波 修 复 液 的 ph 值 和 修 复 时 间 不 当 或 修 复 过 程 中 修 复 液 留 下 得 太 少, 未 没 过 组 织 等 解 决 办 法 是 严 格 按 照 操 作 常 规 进 行 工 作 操 作 规 范 规 范 化 操 作 是 病 理 制 片 质 量 的 保 证, 而 量 化 的 管 理 增 加 了 病 理 制 片 质 量 的 稳 定 性 所 谓

规 范 化, 就 是 在 操 作 过 程 中, 对 使 用 试 剂 种 类 ph 值 浓 度 温 度 时 间 以 及 操 作 的 手 法 都 有 详 细 的 规 定, 尽 可 能 的 减 少 人 为 的 影 响, 减 少 变 量, 减 少 影 响 制 片 质 量 的 条 件 特 别 是 在 做 分 子 技 术 时, 更 应 严 格 按 操 作 规 则 做 所 谓 量 化, 就 是 把 以 前 经 验 的 东 西 用 量 来 判 定 比 如 说 我 们 更 换 脱 水 试 剂, 一 般 都 是 要 等 组 织 不 好 切 了 才 换, 这 样 总 有 几 天 片 子 质 量 不 好 ; 也 有 的 是 几 天 到 了 就 换, 组 织 多 时 脱 水 液 的 水 份 就 多, 后 面 几 天 可 能 组 织 就 脱 不 好 ; 组 织 少 了 脱 水 液 倒 了 很 浪 费, 我 们 通 过 几 年 的 实 验, 发 现 组 织 的 量 和 试 剂 的 更 换 时 间 有 一 定 的 规 律, 用 量 来 控 制 脱 水 的 更 换 时 间 更 具 科 学 性 还 有 苏 木 素 伊 红 也 是 如 此 要 想 搞 好 制 片 质 量, 各 地 必 须 建 立 质 控 组 织, 通 过 技 术 交 流 和 行 政 监 督 的 手 段, 促 进 病 理 技 术 的 发 展, 做 好 每 一 步 例 如 常 规 切 片 的 注 意 事 项 : 1. 取 材 取 材 的 好 坏, 直 接 影 响 切 片 的 质 量 取 材 时, 首 先 要 有 一 把 锋 利 的 取 材 刀, 在 切 割 组 织 时 要 避 免 取 材 刀 来 回 拖 拉, 切 取 的 组 织 块 厚 薄 要 均 匀, 一 般 厚 度 以 0.2 ~0.3cm 为 适, 较 容 易 发 脆 的 组 织 如 甲 状 腺 肝 脏 血 块 淋 巴 结 大 块 癌 组 织 等 可 适 当 厚 一 点, 而 脂 肪 组 织 肺 组 织 纤 维 性 肿 瘤 平 滑 肌 瘤 等 致 密 的 或 试 剂 不 易 渗 入 的 组 织 应 取 薄 一 些 ; 淋 巴 结 应 修 掉 两 侧 球 冠, 并 尽 量 剔 除 周 围 的 脂 肪 组 织 在 取 材 中 还 应 十 分 注 意 组 织 内 是 否 有 缝 线 或 骨 组 织, 如 碰 到 不 可 避 免 的 钙 化 组 织, 应 与 技 术 室 讲 明, 在 切 取 纤 维 组 织 肌 肉 组 织 胃 肠 道 时, 应 注 意 纤 维 及 肌 肉 的 走 向, 取 材 时 尽 可 能 按 与 纤 维 平 行 走 向 切 取 为 佳 2. 固 定 固 定 是 工 作 的 第 一 步, 也 是 在 整 个 制 片 过 程 中 无 法 补 救 的 一 步 所 谓 固 定, 就 是 组 织 离 体 后, 用 各 种 办 法 使 其 细 胞 内 的 物 质 尽 量 接 近 其 生 活 状 态 时 的 形 态 结 构 和 位 置 的 过 程 固 定 的 目 的 是 为 了 防 止 组 织 细 胞 自 溶 与 腐 败, 防 止 了 细 胞 内 的 酶 对 蛋 白 质 的 分 解 作 用, 使 细 胞 内 的 各 和 成 分 如 蛋 白 质 脂 肪 碳 水 化 合 物 或 酶 类 转 变 为 不 溶 性 物 质, 以 保 持 原 有 的 结 构 与 生 活 时 相 仿 另 外, 组 织 固 定 后, 均 呈 一 定 的 硬 化 状 态, 增 加 组 织 韧 性, 而 且 不 易 变 形, 有 利 于 以 后 的 组 织 处 理 所 以 组 织 一 旦 离 体 必 需 及 时 固 定, 固 定 液 的 量 应 为 组 织 的 5 倍 固 定 的 关 键 主 要 与 固 定 的 及 时 性 固 定 液 的 选 择 固 定 液 的 浓 度 固 定 的 温 度 和 时 间 有 关 最 常 用 的 固 定 液 为 10% 福 尔 马 林 10% 福 尔 马 林 由 于 受 到 福 尔 马 林 的 质 量 使 用 时 的 挥 发 和 取 材 时 带 入 的 水 分 影 响, 浓 度 被 降 低 致 组 织 固 定 不 足, 而 高 浓 度 的 福 尔 马 林, 降 低 了 对 组 织 的 穿 透 性, 形 成 周 围 固 定 好 而 中 央 固 定 不 到 的 现 象 以 酸 性 12~15% 的 福 尔 马 林 最 佳 大 标 本 (2cm 厚 ) 一 般 需 要 6~12 个 小 时, 小 标 本 一 般 需 要 3~6 个 小 时 ; 当 室 温 低 18 时, 可 在 37 以 下 的 温 箱 内 加 温 4~6 个 小 时 由 于 HE 染 色 最 佳 着 色 ph 为 3.5~4.5, 中 性 福 尔 马 林 对 苏 木 素 染 色 有 一 定 影 响, 细 胞 核 容 易 发 灰, 核 染 色 质 不 佳

所 以, 尽 管 中 性 福 尔 马 林 对 抗 原 有 很 好 的 保 存 作 用, 但 酸 性 福 尔 马 林 对 绝 大 多 数 抗 原 来 说 也 有 很 好 的 保 存 作 用, 所 以 在 没 有 特 别 处 理 的 情 况 下 常 规 H-E 用 12~15% 酸 性 福 尔 马 林 也 可 以 ( 每 100 毫 升 12~15% 福 尔 马 林 液 内 加 5 毫 升 冰 醋 酸 ) 骨 髓 结 缔 组 织 固 定 以 Bouin 液 为 佳, 经 Bouin 液 固 定 后 的 组 织 必 须 流 水 冲 洗 4 小 时 以 上 有 条 件 的 单 位 可 根 据 不 同 要 求 选 用 二 种 或 二 种 以 上 的 固 定 液 ; 少 数 单 位 还 可 建 立 组 织 冷 冻 库, 以 便 适 应 各 种 特 殊 的 处 理 要 求 3. 水 洗 固 定 后 水 洗 (10~20min), 通 常 被 很 多 人 所 忽 视, 而 水 洗 不 彻 底, 容 易 造 成 脱 片 和 染 色 不 鲜 艳 对 需 做 免 疫 组 织 化 学 的 组 织, 更 不 应 当 忽 视 福 尔 马 林 不 利 于 组 织 块 内 抗 原 的 保 存 4. 脱 水 和 透 明 所 谓 脱 水 就 是 利 用 脱 水 剂 将 组 织 内 的 水 分 置 换 出 来, 以 利 于 有 机 溶 剂 的 渗 入, 这 一 过 程 称 为 脱 水 脱 水 是 否 彻 底, 直 接 关 系 到 组 织 是 否 能 充 分 透 明, 而 脱 水 过 度 ( 原 因 是 组 织 在 纯 酒 精 内 时 间 过 久, 发 生 组 织 质 地 发 生 变 化 ) 容 易 造 成 组 织 发 脆 造 成 组 织 发 脆 的 原 因 还 有 加 温 ( 温 度 超 过 35 ) 脱 水 剂 内 加 有 丙 酮 浸 蜡 用 的 石 蜡 中 二 甲 苯 过 多 等 等 一 般 认 为 组 织 发 脆 跟 高 浓 度 酒 精 有 关, 而 忽 视 了 与 低 浓 度 的 酒 精 关 系, 其 实 低 浓 度 的 酒 精 具 有 强 大 的 穿 透 力, 比 纯 酒 精 更 容 易 渗 透 到 组 织 块 内 部 使 之 脱 水, 组 织 如 果 在 低 浓 度 酒 精 里 充 分 脱 水, 在 高 浓 度 酒 精 里 只 需 脱 去 从 低 浓 度 到 高 浓 度 之 间 的 水 份, 因 此, 仅 需 短 时 间 就 可 完 成, 如 果 这 时 不 缩 短 纯 酒 精 的 时 间, 便 会 引 起 组 织 发 脆 ; 如 果 脱 水 时 加 温, 使 用 丙 酮, 还 可 引 起 组 织 收 缩, 并 影 响 免 疫 组 织 化 学 的 标 记 为 了 使 石 蜡 浸 入 到 组 织 块 内, 必 须 经 过 一 种 既 能 与 脱 水 剂 混 合, 又 能 与 石 蜡 相 溶 的 媒 介 物 质, 这 个 过 程 称 透 明 目 前 最 好 的 透 明 剂 是 二 甲 苯 很 多 人 认 为 二 甲 苯 极 容 易 使 组 织 发 脆, 这 个 观 点 很 片 面, 在 常 温 下, 如 果 不 是 时 间 过 长 ( 超 过 24 小 时 以 上 ) 二 甲 苯 并 不 会 引 起 组 织 过 份 发 脆, 相 反 会 使 某 些 组 织 结 构 比 较 质 韧 的 组 织 : 比 如 子 宫 肌 瘤 等 相 当 好 切 ), 但 是 当 二 甲 苯 温 度 超 过 35 以 后, 极 易 引 起 组 织 发 脆 所 以, 大 小 标 本 最 好 分 开 脱 水, 一 般 情 况 下, 大 标 本 脱 水 时 间 ( 室 温 18 ) 以 80% 酒 精 2 小 时 95% 酒 精 (2 道 ) 各 1 个 半 小 时 至 2h 纯 酒 精 (3 道 ) 各 1 个 半 小 时 至 2h, 二 甲 苯 (2 道 ) 各 30-60min 为 宜 ; 小 标 本 脱 水 时 间 应 相 应 缩 短 脱 水 时 间 长 短, 与 室 温 高 低 有 密 切 的 相 关 室 温 在 12~ 15 时, 可 作 为 一 个 临 界 温 度 范 围 当 室 温 高 于 此 温 度 范 围 时, 组 织 容 易 脱 水, 可 适 当 缩 短 脱 水 时 间 ; 而 室 温 低 于 该 温 度 范 围 时, 应 适 当 延 长 脱 水 时 间 ( 如 能 保 证 在 一 个 恒 定 的 温 度 下 最 佳 ) 更 换 试 剂, 应 以 量 为 基 础, 定 量 更 换, 不 能 等 到 切 片 不 好 时 再 去 更 换 否 则, 至 少 会 有 2~3 批 组 织 切 片 不 好 根 据 我 科 经 验, 如 试 剂 用 量 为 500mL, 每 500 个 蜡 块 更 换 一 次 为 宜

5. 浸 蜡 组 织 透 明 后, 在 熔 化 的 石 蜡 内 浸 渍 的 过 程 称 为 浸 蜡 用 其 他 浸 透 剂 ( 如 火 棉 胶 明 胶 等 ) 渗 入 组 织 内 部 的 过 程 可 称 为 浸 透 或 透 入 浸 蜡 温 度 过 高 ( 超 过 60 ), 在 蜡 内 加 入 二 甲 苯 蜡 或 由 于 透 明 时 带 进 的 二 甲 苯 过 多, 都 会 导 致 组 织 发 硬, 还 会 使 组 织 内 的 抗 原 受 到 破 坏 ; 所 以 作 者 主 张 浸 蜡 用 的 石 蜡 熔 点 在 56 ( 三 道 ), 第 一 道 : 石 蜡 30min; 第 二 道 : 石 蜡 90min; 第 三 道 : 石 蜡,90min 浸 蜡 温 度 控 制 在 56~58 左 右 ( 第 一 道 也 可 用 硬 脂 酸 石 蜡 1:3 混 合 浸 蜡, 不 仅 可 软 化 组 织, 特 别 适 用 于 比 较 韧 硬 的 组 织, 而 且 由 于 硬 脂 酸 是 弱 酸 性 的, 对 细 胞 核 有 媒 染 作 用, 核 浆 比 鲜 明, 但 容 易 脱 片 ; 同 时 对 疏 松 组 织 容 易 散 片 ) 有 条 件 的 可 以 每 天 打 开 第 一 道 石 蜡 的 盖 子, 让 二 甲 苯 挥 发 浸 蜡 所 用 的 石 蜡 如 有 杂 质 尽 可 能 过 滤, 以 防 附 在 组 织 上, 造 成 切 片 刀 刀 口 受 损, 或 切 片 破 碎 和 划 痕 增 多 6. 包 埋 用 包 埋 剂 来 支 持 组 织 的 过 程 称 包 埋 最 常 用 的 是 石 蜡 包 埋 法 包 埋 的 关 键 一 是 平 整, 二 是 方 位 要 求 在 包 埋 时, 应 采 用 镊 子 轻 压 组 织 块 拱 起 部 份, 使 之 平 贴 于 底 部, 通 常 采 用 组 织 的 最 大 面 包 埋 囊 壁 管 腔 组 织 应 竖 直 包 埋 小 块 多 颗 组 织, 应 尽 量 放 在 一 起, 并 保 证 在 一 个 平 面 上 修 去 两 边 的 余 蜡 ( 所 谓 的 两 边, 指 切 片 时 与 切 片 刀 垂 直 的 两 侧 ) 包 埋 时 还 应 注 意 有 无 缝 线, 纸 絮, 如 有 一 定 要 去 除 胃 黏 膜 活 检 标 本, 不 能 按 一 般 的 规 律 取 最 大 包 埋 面, 应 采 取 窄 面 竖 起 包 埋 包 埋 的 蜡 更 应 过 滤, 留 有 杂 质 的 石 蜡, 容 易 造 成 污 染 或 刀 口 受 损 蜡 的 熔 点 应 在 56~58 之 间 选 择, 不 提 倡 在 冬 天 使 用 软 蜡 因 为 用 软 蜡 包 埋 的 蜡 块, 到 了 夏 天, 会 粘 在 一 起, 不 利 于 资 料 的 保 存, 而 且 即 使 在 冬 天, 用 硬 蜡 包 埋 的 蜡 块 也 比 用 软 蜡 包 埋 的 蜡 块 要 好 切 7. 切 片 切 片 的 第 一 步 必 需 粗 切 粗 切 的 厚 度 大 约 在 10~50 微 米 左 右, 质 地 较 硬 的 组 织 或 较 小 的 组 织 应 再 薄 一 些, 粗 切 致 组 织 全 部 暴 露 后, 才 进 行 细 切 细 切 至 组 织 块 表 面 均 匀 一 致, 无 白 点 后, 再 把 切 的 蜡 片 放 入 温 水 中 切 片 时 要 求 用 力 均 匀 柔 和, 摇 速 不 易 过 快 或 过 慢 过 快 会 导 致 切 片 厚 薄 不 均, 机 器 磨 损 ; 过 慢 会 使 切 片 增 厚 切 片 厚 度 一 般 为 3~5 微 米 切 片 的 要 求 是 完 整 薄 均 匀 切 下 的 片 膜 其 大 小 形 状 应 与 组 织 块 一 致 在 切 片 放 蜡 块 时, 应 注 意 组 织 包 埋 的 方 向, 组 织 的 层 次, 纤 维 肌 肉 等 的 走 向 应 与 切 片 刀 平 行, 较 难 切 的 部 分 应 放 在 上 面, 如 皮 肤 的 表 皮, 肿 块 的 包 膜, 胃 肠 道 的 浆 膜 等, 这 样 可 以 减 少 组 织 的 断 裂 现 象 操 作 切 片 机 时 应 用 力 均 匀, 避 免 用 力 过 重 对 脱 钙 组 织 骨 髓, 以 及 已 知 的 钙 化 组 织, 应 选 用 固 定 的 刀 口, 以 减 少 其 他 部 位 出 现 缺 口 的 可 能 性 在 使 用 毛 笔 展 片 时 要 防 止 笔 丝 进 入 刀 口, 因 为 每 切 到 一 根 笔 丝, 就 会 增 加 一 个 缺 口 切 片 厚 度 一 般 为 4~6 微 米, 有 人 认 为 : 只 要 切 片 机 刻 度 标 着 几 个 微 米, 切 出 来 的 片 子 就 是 几 个 微 米 其 实 不 然, 当 切 片 刀 不 锋 利, 或 切 片

时 速 度 不 匀, 或 切 的 较 慢 时, 切 的 片 子 都 会 变 厚, 只 有 在 切 片 刀 十 分 锋 利 切 片 匀 速 的 情 况 下, 才 能 真 正 保 证 其 厚 度 切 片 时 碰 到 的 问 题 的 原 因 及 可 能 处 理 的 方 法 : (1) 组 织 发 脆 : 一 般 是 脱 水 透 明 浸 蜡 时 间 过 长 温 度 过 高, 并 与 组 织 本 身 质 地 也 有 关, 在 切 片 时, 边 切 边 用 嘴 向 蜡 片 吹 气, 可 能 会 好 些 或 用 10-50% 乙 酸 (2) 切 片 卷 起, 可 能 是 刀 不 锋 利, 或 刀 锋 在 另 一 面, 或 刀 角 度 过 大, 切 片 太 厚 等 等 (3) 蜡 片 弯 曲 : 可 能 是 刀 锋 不 均, 切 片 刀 与 蜡 块 不 平 行 (4) 透 明 浸 蜡 时 间 过 长 温 度 过 高, 并 与 组 织 本 身 质 地 也 有 关 (5) 厚 薄 不 均 : 可 能 是 刀 刀 座 及 蜡 块 未 夹 紧, 组 织 太 硬, 或 切 片 机 主 轴 太 向 前, 或 切 片 机 已 磨 损 (6) 切 片 出 现 裂 痕 : 可 能 是 刀 有 缺 口, 石 蜡 内 有 杂 质, 组 织 内 有 钙 化 骨 片 或 有 线 结, 也 可 能 会 有 棉 纸 纤 维 等 (7) 切 片 不 连 片, 切 不 下 片, 切 片 很 厚, 或 者 切 片 后 蜡 块 发 白, 内 陷 : 组 织 脱 水 不 佳 补 救 办 法 : 可 先 将 蜡 块 溶 解, 取 出 组 织, 放 入 加 热 水 浴 的 丙 酮 内 (80 ),30~60min, 再 进 行 透 明 浸 蜡 包 埋 切 片, 也 许 会 好 一 点 8. 展 片 与 捞 片 展 片 水 温 应 在 42 至 47 之 间, 这 主 要 和 包 埋 蜡 的 熔 点 有 关, 水 温 过 高, 会 引 起 组 织 细 胞 散 开, 水 温 过 低, 切 片 皱 摺 无 法 摊 平 包 埋 蜡 中 如 有 二 甲 苯, 也 会 造 成 石 蜡 溶 解 现 象 而 用 一 次 性 刀 片 切 的 片 子, 一 碰 到 热 水, 片 子 上 的 皱 摺 就 无 法 再 展 开, 解 决 方 法 : (1) 可 以 在 切 片 时 边 切 边 向 蜡 片 吹 气, 这 样 的 片 子 就 会 非 常 平 整, 放 到 热 水 里 就 会 自 然 展 开, 比 较 方 便 快 捷, 但 这 样 的 片 子 会 略 微 厚 一 点 ; (2) 在 切 完 片 子 后, 先 把 切 片 放 在 30% 酒 精 水 溶 液 中, 让 酒 精 的 张 力 自 动 把 皱 摺 展 开, 然 后 再 将 切 片 移 到 热 水, 这 样 的 片 子 会 较 薄 ; 如 酒 精 浓 度 过 高, 容 易 引 起 切 片 破 碎, 出 现 裂 隙, 像 脂 肪 之 类 细 胞 间 粘 附 性 较 小 的 组 织 一 碰 到 酒 精 就 会 散 开, 故 不 能 用 此 法 最 后 捞 片 时 玻 片 要 干 净, 要 选 择 那 些 完 整 无 皱 摺 的 切 片, 粘 贴 于 玻 片 中 1/3 和 下 1/3 的 中 间 9. 烤 片 和 脱 蜡 烤 片, 一 般 在 60 的 温 箱 内 烤 片 0.5~1 小 时 左 右, 温 度 过 高, 会 引 起 切 片 细 胞 收 缩 ; 时 间 太 短 ( 少 于 20min), 容 易 造 成 脱 片 脱 蜡 也 相 当 重 要, 如 果 脱 蜡 不 干 净, 切 片 不 易 着 色 或 着 色 不 匀, 所 以, 脱 蜡 用 的 二 甲 苯 要 经 常 更 换, 一 般 用 3 道 二 甲 苯, 每 500mL 液 体, 处 理 500 张 切 片 后 更 换 一 次 为 宜 当 室 温 低 于 18 时, 必 须 将 切 片 从 温 箱 拿 出 后 立 即 放 入 二 甲 苯 中 脱 蜡, 或 将 二 甲 苯 放 入 温 箱 内 预 热 (37 左 右 ) 脱 蜡, 最 高 不 得 超 过 60 然 后 经

高 浓 度 的 酒 精 到 低 浓 度 的 酒 精 洗 去 二 甲 苯, 至 水 10. 染 色 苏 木 素 染 色 时 间 要 根 据 染 料 的 新 旧 温 度 切 片 的 类 型 而 定, 一 般 为 5-15min 经 水 略 洗 后, 用 盐 酸 酒 精 分 化, 分 化 程 度 必 须 用 显 微 镜 控 制 分 化 水 洗 后, 可 用 温 水 或 自 来 水 蓝 化, 并 充 分 水 洗 ( 流 水 冲 洗 5min 以 上 ), 以 防 盐 酸 残 留 导 致 切 片 褪 色 不 提 倡 使 用 碱 性 溶 液 ( 释 氨 水 肥 皂 水 等 ) 促 蓝, 尽 管 蓝 化 效 果 很 好, 但 从 实 践 的 结 果 来 看, 用 碱 性 溶 液 促 蓝 的 切 片 不 能 长 期 保 存, 容 易 褪 色 最 后 入 伊 红 复 染 (5-20 秒 ) H-E 染 色 的 关 键 在 于 深 浅 适 度, 对 比 鲜 明, 一 般 有 经 验 的, 肉 眼 就 能 判 断, 但 偶 而 也 会 出 现 失 误, 所 以 用 显 微 镜 控 制 是 最 保 险 的 方 法 其 关 键 的 步 骤 在 于 苏 木 素 染 好 后 的 分 化 及 蓝 化 过 程, 在 蓝 化 结 束 后, 应 在 显 微 镜 下 观 察 细 胞 核 着 色 是 否 合 适, 核 结 构 是 否 清 晰, 胞 浆 内 是 否 有 残 留 的 苏 木 素 等 等 染 色 理 想 的 切 片 在 显 微 镜 下 应 是 : 细 胞 核 与 细 胞 浆 应 蓝 红 相 映, 鲜 艳 美 丽 ; 核 浆 对 比 明 显, 核 膜 及 核 染 色 质 颗 粒 清 晰 可 见 11. 脱 水 和 封 片 切 片 脱 水 应 从 低 浓 度 的 酒 精 到 高 浓 度 的 酒 精,80% 酒 精 1 道,95% 酒 精 2 道, 纯 酒 精 2 道,( 正 丁 醇 1 道 ), 二 甲 苯 2 道 浓 度 低 的 酒 精 比 浓 度 高 的 酒 精 更 容 易 脱 水, 但 也 容 易 使 伊 红 退 色, 故 脱 水 时 间 可 短 一 点, 每 道 3-5min, 纯 酒 精 每 道 10min 为 增 加 酒 精 与 二 甲 苯 的 相 融 性, 可 在 二 甲 苯 前 面 增 加 一 道 正 丁 醇 ; 石 碳 酸 - 二 甲 苯 液 也 有 此 效, 但 用 石 碳 酸 时 如 不 洗 净, 可 引 起 切 片 退 色, 不 利 于 切 片 久 存, 故 不 作 推 荐 切 片 经 二 甲 苯 透 明 后, 用 中 性 树 胶 封 固 为 增 加 切 片 的 透 明 度, 防 止 细 胞 收 缩 龟 裂 或 切 片 出 现 黑 色 结 晶 样 小 点 所 以 切 片 必 须 湿 封, 不 得 用 温 箱 烤 干 或 电 吹 风 吹 干 后 干 燥 封 片 在 南 方 冬 春 霉 雨 季 节, 封 片 时 要 防 止 口 鼻 呼 出 的 气 体 接 触 到 切 片 ; 在 天 气 较 潮 湿 的 日 子 里, 不 宜 一 次 将 多 张 切 片 取 出 待 封, 以 免 切 片 还 潮, 形 成 透 明 不 佳, 出 现 云 雾 状 水 珠 脱 水 剂 的 更 换 也 应 有 一 定 的 时 间 规 定 一 般 是 每 500mL 液 体, 处 理 500 张 切 片 后 更 换 一 次 为 宜 封 片 树 胶 不 能 过 稀, 封 片 时 树 胶 要 均 匀 充 满 盖 玻 片 且 树 胶 不 及 外 溢 为 佳 要 将 组 织 全 部 覆 盖, 也 不 能 有 气 泡 最 后, 粘 贴 标 签, 标 签 必 须 贴 于 玻 片 上, 编 号 书 写 清 楚, 最 好 能 打 印