Gel filtration 凝 胶 过 滤 层 析 技 术 Content 内 容 Content 内 容 What is gel filtration 凝 胶 过 滤 定 义? Gel filtration (GF) is a simple and reliable chromatographic method for separating molecules according to size and shape. 凝 胶 过 滤 层 析 是 根 据 分 子 大 小 和 形 状 的 差 异 进 行 分 离 的 一 种 简 单 可 靠 的 层 析 技 术 Gel structure 填 料 结 构 AGAROSE 琼 脂 糖 凝 胶 A good gel for gel filtration contains about 95% water 凝 胶 过 滤 分 离 原 理 : 空 间 排 阻 1. Spherical particles packed into a column. 凝 胶 过 滤 填 料 的 95% 为 水 2. Sample applied. 3. Buffer (mobile phase) and sample move through column. Molecules diffuse in and out of matrix 4. Large molecules leave the column first followed by smaller molecules in order of size. Molecules larger than the matrix pores pass straight through. - pores filled with eluent 孔 内 充 满 洗 脱 液 - carefully controlled size range 孔 径 精 密 控 制 - chemically /physically inert (lack of adsorptive properties) 惰 性 Diffusion Buffer Diffusion into the pores Buffer Diffusion out of the pores 1/
Steric exclusion leads to early elution 体 积 排 阻 程 度 决 定 洗 脱 位 置 Molecules elute in order of size. 不 同 分 子 按 照 大 小 顺 序 洗 出 Separation volumes 分 离 体 积 V o V t 1 2 3 4 void volume V o The largest molecules elute first; the smallest ones elute last. 大 分 子 先 洗 出, 小 分 子 后 洗 出 V c volume of the gel matrix V s pore volume V i V o = void volume 外 水 体 积 = retention volume or elution volume 保 留 体 积 / 洗 脱 体 积 V t = total liquid volume of the bed 总 液 体 体 积 V i = inner pore volume = V c -V s V o 内 孔 体 积 / 内 水 体 积 V c = total geometric volume of the column 柱 体 积 V s = volume of gel matrix 固 相 凝 胶 的 体 积 The void volume V o 外 水 体 积 V t and V c 总 液 体 体 积 和 柱 体 积 concentration 非 常 大 的 分 子 在 外 水 体 积 洗 出, V o concentration 非 常 小 的 分 子 的 洗 脱 体 积 为 内 水 + 外 水 V t = V +V i 柱 床 的 几 何 体 积, V c V o volume V o VR volume V t V c Distribution coefficient, K d 分 配 系 数 The coefficient K av -V K d = V c - -V V s i.e., = V o + K d * V i -V = V i - : 外 水 体 积 + 能 进 入 的 那 部 分 内 水 体 积 -K d : 溶 质 分 子 能 够 进 入 的 内 水 体 积 ( 内 水 体 积 ) 占 总 的 内 水 体 积 的 比 例 K d 较 难 测 定, 常 用 Kav 代 替 = 保 留 体 积 / 洗 脱 体 积 V o = 排 阻 体 积 / 外 水 体 积 V c = 层 析 柱 几 何 体 积 V s = 固 相 凝 胶 所 占 的 体 积 V i = 孔 内 体 积 / 内 水 体 积 = V c -V s V o V K R -V = av V c -V - 与 柱 子 大 小 和 填 装 无 关 - 可 以 用 于 比 较 不 同 的 纯 化 结 果 K av 容 易 得 到, 也 更 有 实 际 意 义 2/
K av for very large and very small molecules 非 常 大 的 分 子 在 V 处 洗 脱 = V V K R -V V -V = = = av V c -V V c -V K av 应 该 在 和 1 之 间 concentration elution volume when K av = 1 elution with K av > 1 Adsorption has occurred. 非 常 小 的 分 子 在 V t 处 洗 脱 = V t V K = R -V = av =1 -V V c -V -V V t volume elution with K av < Serious problem! 流 动 相 中 需 要 加 入 15mM NaCl! Calibration curves 校 准 曲 线 Selectivity curves 选 择 性 曲 线 - 斜 率 越 陡, 洗 脱 体 积 差 异 越 大 - 仅 可 用 于 特 定 的 柱 子 Δ K av - 斜 率 越 陡, 洗 脱 体 积 差 异 越 大 - 与 柱 子 的 填 装 无 关, 可 以 用 于 不 同 填 料 的 性 质 比 较 K av Δ log M r Δ K av Δ log M r V o K av = V c V o log M r versus the logarithm of molecular mass log M r K av versus the logarithm of molecular mass Selectivity curves 选 择 性 曲 线 K av Δ K av Δ K av - 斜 率 越 陡, 洗 脱 体 积 差 异 越 大 - 与 柱 子 的 填 装 无 关, 可 以 用 K 于 不 同 填 料 的 性 质 比 较 av 1 Exclusion limit 排 阻 极 限 不 能 进 入 填 料 孔 的 最 小 的 分 子 量 Exclusion limit All molecules bigger than this elute in the void volume. 分 子 量 大 于 此 的 分 子 均 在 外 水 体 积 洗 出 Δ log M r V o K av = V c V o log M r K av versus the logarithm of molecular mass log (M r ) 3/
Fractionation range 分 级 范 围 Content 内 容 K av 1.7.1 K av =.1 to K av =.7 的 范 围 内, 选 择 性 曲 线 为 直 线 fractionation range 填 料 分 级 范 围 log (M r ) Resolution factor, R s 分 辨 率 Rs =.6 Rs = 1 Resolution: depends on 分 辨 率 取 决 于 selectivity 选 择 性 and efficiency 柱 效 high selectivity lower selectivity Selectivity 选 择 性 : 峰 分 离 的 量 度 高 选 择 性 可 以 达 到 基 线 分 离 高 选 择 性 可 以 弥 补 低 的 柱 效 - 峰 体 积 有 可 能 增 加 low selectivity R s = Rs = 4 V 2 -V 1 (W 1 + W 2 ) / 2 两 峰 相 对 于 其 峰 宽 而 言, 分 开 的 有 多 远 high selectivity high efficiency low efficiency Efficiency 柱 效 : 峰 宽 的 量 度 柱 效 越 高 峰 越 窄 高 柱 效 需 要 良 好 的 柱 填 装 技 术 高 柱 效 有 时 可 弥 补 选 择 性 不 足 high efficiency low efficiency 选 择 最 佳 的 凝 胶 (high selectivity) Fractionation Range 分 级 范 围 1k 1k 1k 1k K av 1.-.8-.6-.4-.2-1 2 4 5 3 1 1, 1, 1,, 1,, 6 7 1. Superdex Peptide 2. Superdex 75 3. Superdex 2 4. Sephacryl S-1 HR 5. Sephacryl S-2 HR 6. Sephacryl S-3 HR 7. Sephacryl S-4 HR 4/
Results depend on selectivity 分 离 结 果 与 选 择 性 有 关 Shape effects 形 状 的 影 响 排 阻 极 限 增 加 AU 28 Sephacryl S-3 Sephacryl S-2 BSA Cyt C b-l IgG Sephacryl S-1 Cytidine 1k-15k 适 合 较 大 分 子 5k-25k 最 佳 1k-1k 适 合 较 小 分 子 K av 1.7.1 denatured proteins 变 性 蛋 白 native proteins 天 然 蛋 白 log (M r ) A gel has different fractionation ranges for native, globular proteins and denatured proteins in random coil. 对 于 形 状 不 同 的 分 子, 某 填 料 的 分 级 范 围 不 同 4 8 12 ml Shape effects 形 状 的 影 响 Efficiency 柱 效 K av 1 linear polysaccharides 线 性 多 糖 K av 1 Molecules with different shapes have different selectivity curves. 对 于 形 状 不 同 的 分 子, 有 不 同 的 选 择 性 曲 线 Efficiency depends on 取 决 于 : flow rate 流 速 particle size of matrix 粒 径 大 小 particle size distribution of matrix 粒 径 分 布 globular proteins 球 蛋 白 log (M r ) packing quality of the column 层 析 柱 的 装 填 sample volume and viscosity 样 品 体 积 和 黏 度 Peak width depends on particle size 粒 径 影 响 柱 效 Superdex Peptide 13-15 µm.14 Superdex Peptide 13-15 µm.12.1.8.6.4.2 1 2 3 4 5 retention time min Superdex 3 prep grade 24-44 µm.6.5.4.3.2.1 1 2 3 4 5 6 retention time min Resolution depends on sample volume 进 样 体 积 影 响 柱 效 Superdex Peptide High Performance column 1/3_24ml.8.6.4.2 25µl A214.1 25 µl 5 1 15 2 25 Retention volume (ml).4.2.1.8 2 µl.6.4.2 5 1 15 2 25 Retention volume (ml) 2 µl.8.1% Vt.8% Vt 4 µl.6 5 1 15 2 25 Retention volume (ml) 4 µl <2% Vt 5/
Resolution depends on sample viscosity 黏 度 影 响 柱 效 样 品 黏 度 过 高, 分 离 度 下 降. Resolution depends on column length 柱 高 影 响 分 辨 率 Increasing column length increases resolution 柱 高 加 长, 分 辨 率 提 高 relative viscosity: 1. 1. Haemoglobin and NaCl, viscosity changed by adding dextran.8.7.6.5.4 2 x Superdex Peptide High Performance column 1x3 mm i.d x bed height.8.7.6.5.4 1 x Superdex Peptide High Performance column 1x3 mm i.d x bed height relative viscosity: 4.2 4.2.3.2.3.2.1.1 relative viscosity: 11.8 1 2 3 4 5 retention time min 5 1 15 2 25 retention time min Content 内 容 Main purification tasks 主 要 应 用 Group separations 组 分 离 desalting, buffer exchange, removing reagents 脱 盐 / 换 缓 冲 液 Fractionation of proteins and peptides 精 细 分 离 complex samples, monomer/dimer 聚 集 体 去 除 Estimation size 测 定 分 子 量 Characterisation: size homogeneity 蛋 白 鉴 定 : 均 一 性 Group separations 组 分 离 Desalting proteins 蛋 白 质 快 速 脱 盐 Fractionation 精 细 分 离 Separating dimer and oligomers from monomer 去 除 蛋 白 聚 集 体 16% - 44% CV Column: Hitrap desalting 5ml Sample: HSA, 2 mg/ml, Load:.8, 1.3, 1.7, 2.2 ml ( 16-26% Vt ) Buffer: NaCl.5M 15 1 5 dimer monomer Column: Superdex 75 1/3 GL Tricorn Sample: reccys-prot., protein solution containing a mixture of dimers and monomers Sample volume: 2 µl (.8% Vt ) Elution buffer: 5mM TrisHCl, 1mM EDTA,.15M NaCl ph 8.4 filtered through.22 µm sterile filter Flow rate:.5 ml/min (38cm/h) System: ÄKTAexplorer 1 Detection: A 28 nm. 5. 1. 15. 2. 25. ml V c 组 分 离 : 柱 高 < 6cm, 进 样 体 积 较 大 (< 25% CV) 精 细 分 离 : 柱 高 3-1cm, 进 样 体 积 较 小 ( 一 般.5-5 % CV) 6/
Estimating molecular size 测 定 分 子 量 Measure elution position Calibration Curve 校 准 曲 线 Characterisation: size homogeneity 蛋 白 鉴 定 : 均 一 程 度 Log(M) log (M r ) 计 算 分 子 量 大 小 ~ Log (M r ) Superdex 2 HR 1/3 Main products 主 要 产 品 Superdex : 首 选 的 分 子 筛 填 料 Superdex : 首 选 的 分 子 筛 凝 胶 Highest selectivity 选 择 性 高, high speed 快 速, scale-up 可 放 大 Sephacryl HR complex samples, monomer/dimes 聚 集 体 去 除, 小 规 模 Superose Sepharose Virus, pdna, polysaccharides, 病 毒 /DNA/ 多 糖 etc Sephadex Fast desalting, buffer exchange, removing reagents 快 速 脱 盐, 置 换 缓 冲 液, 去 除 试 剂 - 葡 聚 糖 和 琼 脂 糖 交 联 而 成 - 高 选 择 性, 高 分 辨 率 - 速 度 快, 吸 附 最 低, 收 率 高 - 化 学 性 质 稳 定 - 流 速 快, 耐 压 性 能 好 常 用 于 对 分 辨 率 要 求 比 较 高 的 精 细 纯 化! Gel structure 填 料 结 构 A hypothetical structure for Superdex cross-linked agarose dextran Superdex Superdex Peptide M r 1-7 Superdex 75 M r 3-7 分 离 分 子 量 大 小 ( 球 状 蛋 白 质 ) Superdex 2 M r 1-6 cross-section from Superdex particle 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 Cross-linked agarose 交 联 琼 脂 糖 strong support 支 撑 Dextran chain 葡 聚 糖 链 controlled pore size for separation 控 制 孔 径 Tricorn Superdex 1/3GL_24ml Hiload Superdex 16/26 12ml /32ml 13um 34um 7/
4 35 3 25 2 15 1 5 3 25 2 15 1 5 Superdex 75 1 3:1_UV1_28nm Superdex 75 1 3:1_Inject. 1. 2. 3. 4. min Superdex 75 nr 171:1_UV1_28nm Superdex 75 nr 171:1_Inject. 2. 4. 6. 8. 1. min 6 5 4 3 2 1. 2. 4. 6. 8. 1. min Peptide Purification 多 肽 纯 化 Aggregates Removal 聚 集 体 去 除 SDS-PAGE Superdex Peptide - 分 离 范 围 1-7 Da - 高 化 学 稳 定 性, ph1-14, 兼 容 有 机 溶 剂 ( 乙 腈 +TFA) - 和 RPC 衔 接, 用 于 peptide 的 高 效 分 离 纯 化 Requirement : Monomer > 95% Superdex 2 1/3GL 比 较 Superdex 75 5/15 GL & Superdex 75 1/3 GL Rapid purity check of r-protein 重 组 蛋 白 纯 度 快 速 检 测 Superdex 75 1/3 GL Column volume 24 ml Flow rate.6 ml/min Sample volume 1 μl Analysis time 47 min Recombinant protein ~17 kda. Truncated form ~1 kda. Recombinant protein Truncated protein 快 速 得 到 好 的 分 辨 率! Superdex 75 5/15 GL Column volume 3 ml Flow rate.3 ml/min Sample volume 12 μl Analysis time 12 min 47 min Column: Superdex 75 5/15 GL Buffer: PBS ph 7.4 Flow rate:.3 ml/min Sample volume: 4 µl Analysis time: 12 min/run System: Ettan LC 样 品 纯 度 检 测 非 常 快 可 以 粗 略 估 测 纯 度 精 确 的 定 量 分 析 请 选 择 1/3 GL 12 min! 12 min! Sephacryl HR - 由 葡 聚 糖 交 联 N,N- 亚 甲 基 二 乙 酰 胺 形 成 - 理 化 性 质 稳 定 - 系 列 全, 成 本 低 类 病 毒 颗 粒 的 纯 化 (VLP) HiPrep 16/6 Sephacryl S-5 HR Collaboration with Novavax Inc., US 8/
Act 1.5 1..5. 28813 4FF 11:1_UV3_26nm 28813 4FF 11:1_Fractions 28813 4FF 11:1_Inject 28813 4FF 11:1_Fractions@11,HIST1 28813 4FF 11:1_EditedBaseline 58.35 78.35 83.37 1.85 11.83 115.85 12.86 124.62 127.12 129.62 5 1 15 2 ml 134.62 14.84 147.12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 16.85 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 7577 W aste Act 3.5 3. 2.5 2. 1.5 1..5. 4 3 2 1 Manual run 1:1_UV1_26nm Manual run 1:1_UV3_28nm Manual run 1:1_Cond Manual run 1:1_Fractions Manual run 1:1_Inject Manual run 1:1_Fractions@11,HIST2 Manual run 1:1_Fractions@11,HIST1 Manual run 1:1_Fractions@15,BASEM Manual run 1:1_Logbook 28.52 115.5 1 2 Waste 3 4 5 6 Waste 7 8 9 1 11 12 Waste 21.96 238.97 5 1 15 2 25 ml 1-1 -2-3 -4-5 M anual run 1:1_UV1_26nm Ma nual run 1:1_U V3_28nm Manual run 1:1_Fractions M anual run 1:1_Inject % Waste 13 15 16 17 18 19 2 Waste 16 18 2 22 24 26 min Superose Sepharose - 高 度 交 联 的 琼 脂 糖 - 分 离 范 围 广 - 理 化 性 质 稳 定 - 交 联 的 琼 脂 糖 - 理 化 性 质 稳 定 - Fast Flow 填 料 流 速 快 :25-3cm/h Sepharose 4FF: 6kD~2MD Sepharose 6FF: 1kD~4MD - 常 用 于 疫 苗 领 域 Influ.& Rabies Vaccine Production 流 感 & 狂 犬 等 病 毒 类 疫 苗 的 生 产 Cell culture supernatant 多 糖 疫 苗 : 两 步 层 析 代 替 酚 抽 提 75k ultrafiltration SEC: Sepharose 4FF AEX: Q Sepharose FF 阴 离 子 交 换 Capto adhere Sepharose 4FF 杂 蛋 白 比 例 ultra-/diafiltration purified human influenza virus 终 产 品 蛋 白 残 留 < 1% 2. 1.5 1..5. 1.47.71.16.15 13-16 17 18 19-2 系 列 1 管 号 多 糖 疫 苗 的 检 定 药 典 CP25: 用 琼 脂 糖 -4B 或 CL-4B 凝 胶 过 滤 法 测 定, K D 值 应.4 ( 即 retention2 处 的 Kd2 值.4 ) K D 值 表 示 相 对 分 子 量, 多 糖 抗 原 分 子 量 要 大 于 1kd 才 具 有 免 疫 原 性 超 螺 旋 质 粒 pdna 纯 化 Clarified alkaline lysate 裂 解 液 HiTrap 26/1 Sepharose 6 FF 26 mm x 1 mm Vt: 53 ml RNA-removal Kd.4 HiTrap PlasmidSelect Xtra 16 mm x 25 mm Vt: 5 ml Supercoiled pdna capture Kd =.5 Purified supercoiled pdna 纯 化 的 pdna HiTrap SOURCE 3Q 16 mm x 25 mm Vt: 5 ml Supercoiled pdna polishing PlasmidSelect Xtra Starter Kit 9/
Sephadex - 由 葡 聚 糖 交 联 异 表 氯 醇 形 成 的 多 孔 结 构 - Sephadex G1: 1-7 Da 多 肽 纯 化, oligo 脱 盐, 抗 生 素 聚 集 体 质 控 分 析 -Sephadex G25: 1k 5kDa MW>5kD 蛋 白 快 速 脱 盐 Buffer exchange using 使 用 脱 盐 柱 快 速 脱 盐 HiPrep 26/1 Desalting Column Sample: BSA dissolved in 5 mm piperazine,.5 M sodium chloride, ph 6.2 Column: HiPrep 26/1 Desalting_53ml Buffer: 2 mm sodium phosphate,.15 M sodium chloride, ph 7. System: ÄKTAprime, 2 ml/min Content 内 容 4 key questions 4 个 问 题 1. What is the aim of the experiment? 实 验 目 的? - High resolution fractionation 精 细 分 离 or 还 是 - Group separation (desalting, buffer exchange)? 组 分 离, 缓 冲 液 置 换? High resolution fractionatio 精 细 分 离 : Superdex, Superose, Sephacryl Group separation 组 分 离 : Sephadex 4 key questions 4 个 问 题 4 key questions 4 个 问 题 2. What is the molecular weight of the target protein/contaminants? 目 标 蛋 白 和 杂 质 的 分 子 量 Choose a gel filtration medium with the fractionation range that covers the molecular weight values of interest in your sample and that gives highest difference in size of target protein/contaminants/salt 选 择 分 级 范 围 能 包 含 目 标 蛋 白, 且 使 杂 质 和 目 标 蛋 白 的 分 离 度 最 大 的 填 料 3. How much sample are they loading? 进 样 量 是 多 少? Desalting 脱 盐 25% CV PD-1 (gravity) loading capacity 2.5 ml HiTrap 5 ml loading capacity 1.5 ml HiPrep 53 ml loading capacity 15 ml Fractionation polishing 精 细 纯 化 μl analytical column 分 析 1%CV - 1/3 loading capacity 25 μl - 5/15 loading capacity 5 μl ml preparative column 制 备 5%CV - 16/6 loading capacity 5 ml - 26/6 loading capacity 13 ml 更 大 规 模, 可 以 自 行 填 装 柱 子 1 /
4 key questions 4 个 问 题 如 何 得 到 满 意 的 结 果? 4. Will you be scaling up? 是 否 打 算 放 大 Superdex - $$$ (1 st choice 首 选 ) Sephadex - $ (desalting 脱 盐 ) Sephacryl - $$ (large column packing is difficult 放 大 较 困 难 ) Appropriate industrial chromatography system and column available? 是 否 有 合 适 的 工 业 层 析 系 统 和 层 析 柱? 使 用 选 择 性 最 高 的 填 料! 使 用 预 装 柱! 尽 量 使 用 粒 径 小 而 均 一 的 填 料 合 理 的 进 样 量 / 柱 高 - Group separation 组 分 离 : < 25% CV, 短 - Fractionation 精 细 分 离 :.5-5% CV, 3-1cm 注 意 样 品 黏 度 降 低 流 速 以 改 善 传 质 速 度 ( 通 常 5-2cm/h) 流 动 相 中 推 荐 使 用 15mM NaCl Content 内 容 Pros 优 点 Simple 简 单 Separates by size 根 据 大 小 分 离 Fast method for buffer exchange 快 速 缓 冲 液 置 换 Very gentle, high yields 温 和, 高 收 率 Works in any buffer solution buffer 没 有 特 殊 要 求 Removes dimers and aggregates 去 除 聚 集 体 Cons 缺 点 Limited sample volume 处 理 体 积 有 限 Dilute the sample 会 产 生 一 定 的 稀 释 Low flow rate 流 速 慢, 分 离 时 间 长 Scale-up 大 规 模 放 大 有 一 定 的 困 难 Q & A Please visit: www.gehealthcare.com/protein-purification 11 /