静 态 加 压 溶 剂 提 取 -HPLC 法 测 定 马 兜 铃 属 植 物 中 的 马 兜 铃 酸 梁 庆 优, 郑 颖 *, 唐 海 谊, 李 绍 平, 王 一 涛 (. 澳 门 大 学 中 华 医 药 研 究 院, 澳 门 ;. 澳 门 理 工 学 院 高 等 卫 生 学 校, 澳 门 ) 第 一 作 者 简 介 : 梁 庆 优 (98 ), 男, 河 北 省 邯 郸 市 人, 澳 门 大 学 中 华 医 药 研 究 院 在 读 硕 士 研 究 生, 中 药 质 量 控 制 方 向 通 讯 地 址 : 澳 门 大 学 中 华 医 药 研 究 院, 澳 门 大 学, 澳 门 特 别 行 政 区 联 系 电 话 : 853-3974690 传 真 : 853-884358 电 子 邮 件 :njlqy@63.com * 通 讯 作 者 及 联 系 地 址 : 姓 名 : 性 别 : 职 务 : 郑 颖 女 助 理 教 授, 药 剂 学 博 士 通 讯 地 址 : 澳 门 大 学 中 华 医 药 研 究 院,3 座 30A 室, 澳 门 大 学, 澳 门 特 别 行 政 区 联 系 电 话 : 853-3974687 传 真 : 853-884358 电 子 邮 件 : yzheng@umac.mo 基 金 項 目 : 本 研 究 受 澳 門 科 学 技 术 发 展 基 金 ( 资 助 号 :049/005/A-R) 资 助
静 态 加 压 溶 剂 提 取 -HPLC 法 测 定 马 兜 铃 属 植 物 中 的 马 兜 铃 酸 梁 庆 优, 郑 颖 *, 唐 海 谊, 李 绍 平, 王 一 涛 (. 澳 门 大 学 中 华 医 药 研 究 院, 澳 门 ;. 澳 门 理 工 学 院 高 等 卫 生 学 校, 澳 门 ) 摘 要 : 目 的 建 立 并 优 化 从 马 兜 铃 药 材 中 提 取 马 兜 铃 酸 I 和 II 的 静 态 加 压 溶 剂 提 取 方 法, 考 察 各 因 素 对 提 取 效 率 的 影 响, 并 测 定 马 兜 铃 关 木 通 青 木 香 和 广 防 己 中 两 成 分 的 含 量 方 法 以 马 兜 铃 酸 I 和 II 的 含 量 为 指 标, 采 取 单 因 素 考 察 的 方 法, 分 别 优 化 提 取 溶 剂 药 材 粒 径 提 取 温 度 提 取 压 力 提 取 时 间 冲 洗 体 积 循 环 数 目 药 材 加 入 量 等 影 响 因 素 结 果 优 化 后 的 条 件 为 : 甲 醇 提 取, 药 材 粉 末 粒 径 00~0 目, 提 取 温 度 0, 提 取 压 力 500 psi, 静 态 提 取 时 间 0 min, 冲 洗 体 积 40%, 个 循 环, 药 材 加 入 量.00 g 结 论 本 法 可 一 次 将 马 兜 铃 酸 I 和 II 从 马 兜 铃 等 四 种 药 材 中 完 全 提 取, 显 示 了 良 好 的 适 用 性 经 比 较, 该 法 比 传 统 的 超 声 和 索 氏 提 取 方 法 提 取 效 率 更 高, 节 约 溶 剂, 省 时 省 力 ; 静 态 加 压 溶 剂 法 更 适 合 于 青 木 香 中 马 兜 铃 酸 的 提 取 关 键 词 : 静 态 加 压 溶 剂 提 取 ; 高 效 液 相 色 谱 ; 马 兜 铃 酸 ; 马 兜 铃 ; 关 木 通 ; 青 木 香 ; 广 防 己 ; 单 因 素 考 察 Pressurized Liquid Extraction-HPLC determination of Aristolochic Acids in Aristolochia Plants LIANG Qing-you, ZHENG Ying *,TONG Hoi-yee, LI Shao-ping, WANG Yi-tao (. Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Macao SAR, China;. School of Health Sciences, Macao Polytechnic Institute, Macao SAR, China) Abstract: Objective The present study aimed to optimize static pressurized liquid extraction (PLE) method for the extraction of aristolochic acids I & II (AAI & AAII) from Fructus Aristolochiae and study the influences of related factors. Methods The univariate design was introduced. The operational parameters, such as the type of solvent, particle size of the sample powder, extraction temperature, pressure, static time, flush volume, the number of cycles, and the amount of sample were optimized. Results The optimized result employed methanol as extraction solvent, particle size of 00~0 mesh, extraction temperature of 0, extraction pressure of 500 psi, static time of 0 min, flush volume of 40%, cycle and sample amount of.00 g. And the method was applied for four Traditional Chinese Medicines including Fructus Aristolochiae, Caulis Aristolochiae manshuriensis, Radix Aristolochiae, and Radix Arsitolochiae fangchi. Conclusion This method can completely extract AAI & AAII from Fructus Aristolochiae in one extraction. The comparison shows that this static PLE method is better than ultrasonication and soxhlet methods with higher extraction efficiency and less time-consuming. It is also better than the dynamic one in the extraction of AAs from Radix Aristolochiae. Key words: Static Pressurized Liquid Extraction; High Performance Liquid Chromatography; Aristolochic Acid; Fructus Aristolochiae; Caulis Aristolochiae manshuriensis; Radix Aristolochiae; Radix Arsitolochiae fangchi; Univariate Design
马 兜 铃 为 马 兜 铃 科 植 物 北 马 兜 铃 Aristolochia contorta Bge. 或 马 兜 铃 Aristolochia debilis Sieb. et Zucc. 的 干 燥 成 熟 果 实, 具 有 清 肺 降 气, 止 咳 平 喘 和 清 肠 消 痔 等 功 效 [] 马 兜 铃 酸 是 马 兜 铃 属 植 物 中 的 主 要 成 分 之 一, 它 是 3,4- 次 甲 二 氧 基 -0- 硝 基 -- 菲 酸 的 衍 生 物, 其 中 尤 以 马 兜 铃 酸 I( 又 名 马 兜 铃 酸 A, AAI) 和 马 兜 铃 酸 II( 又 名 马 兜 铃 酸 B,AAII)( 图 ) 分 布 广 泛, 含 量 较 高 马 兜 铃 酸 (Aristolochic acids, AAs) 具 有 肾 毒 性, 还 有 致 癌 致 突 变 的 作 用 [, 3] 国 外 亦 报 道 了 多 起 马 兜 铃 酸 毒 副 作 用 的 案 例 [4], 甚 至 形 成 了 马 兜 铃 酸 肾 病 (Aristolochic Acid Nephropathy, AAN) 的 概 念 因 此 中 药 材 中 马 兜 铃 酸 的 检 测 应 引 起 我 们 的 重 视 马 兜 铃 酸 I Aristolochic Acid I 马 兜 铃 酸 II Aristolochic Acid II 图 马 兜 铃 酸 I 和 II 的 结 构 式 Fig Chemical structures of AAI & AAII 马 兜 铃 酸 的 分 析 方 法 报 道 的 比 较 多, 如 TLC [5] LC-ESI-MS [6] UV [7] 和 HPLC-DAD [8] 等, 而 提 取 则 通 常 使 用 传 统 方 法, 如 加 热 回 流 [], 超 声 和 索 氏 提 取 [8~] 方 法 等 鉴 于 传 统 方 法 费 时 费 力, 本 文 将 采 用 静 态 加 压 溶 剂 提 取 法 对 样 品 进 行 提 取 加 压 溶 剂 提 取 (Pressurized Liquid Extraction, PLE) 是 近 十 几 年 发 展 起 来 的 一 个 新 方 法, 它 利 用 给 提 取 溶 剂 施 加 高 压 大 幅 度 地 提 高 提 取 溶 剂 的 沸 点 以 进 行 高 温 提 取 [], 目 前 国 内 报 道 较 少 本 文 选 择 马 兜 铃 作 为 受 试 药 材, 以 高 效 液 相 色 谱 法 定 量, 建 立 并 优 化 提 取 马 兜 铃 酸 的 静 态 加 压 溶 剂 提 取 方 法, 并 测 定 几 种 药 材 中 AAI 和 AAII 的 含 量 最 后 与 传 统 提 取 方 法 和 动 态 加 压 溶 剂 提 取 方 法 进 行 比 较. 仪 器 试 药 与 材 料. 实 验 仪 器 :Agilent 00 系 列 高 效 液 相 色 谱 仪 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), 含 四 元 泵, 自 动 进 样 器 和 紫 外 二 极 管 阵 列 检 测 器, 数 据 处 理 采 用 Chemstation 工 作 站 ASE00 (Accelerated Solvent Extraction 00) 型 加 压 溶 剂 提 取 仪 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA), 氮 气 供 压 Knifetec 095 药 材 粉 碎 机 (Foss Tecator Company, Sweden) Transonic TI-H-5 型 超 声 仪 (Elma, Sweden) 545D 型 离 心 机 (Eppendorf, Barkhausenweg, 339 Hamburg, Germany). 试 药 与 材 料 : 马 兜 铃 (Fructus Aristolochiae) 青 木 香 (Radix Aristolochiae) 关 木 通 (Caulis Aristolochiae manshuriensis) 和 广 防 己 (Radix Arsitolochiae fangchi) 购 自 3
河 北 安 国 美 威 中 药 材 有 限 公 司, 经 本 院 李 绍 平 博 士 鉴 定 分 别 为 北 马 兜 铃 Aristolochia contorta Bge. 的 干 燥 成 熟 果 实 马 兜 铃 Aristolochia debilis Sieb. et Zucc. 的 干 燥 根 东 北 马 兜 铃 Aristolochia manshuriensis Kom. 的 干 燥 藤 茎 和 广 防 己 Aristolochia fangchi Y.C.Wu ex L.D. Chou et S.M. Hwang 的 干 燥 根 药 材 于 50 干 燥 小 时 后 打 粉, 过 筛 备 用 马 兜 铃 酸 对 照 品 购 自 西 格 玛 公 司 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 其 中 含 AAI 7%,AAII 65% 甲 醇 乙 腈 冰 醋 酸 乙 酸 乙 酯 均 为 色 谱 纯, 购 自 莫 克 公 司 (Merck, Darmstadt, Germany) 纯 水 采 用 Milli Q- Plus 系 统 制 备 (Millipore, Bedford, MA, USA).3 统 计 处 理 软 件 : 实 验 中 两 组 比 较 采 用 t- 检 验 ; 多 组 比 较 采 用 F- 检 验, 方 法 为 One-way ANOVA 在 Post Hoc 计 算 中, 采 用 LSD 算 法,α 取 0.05 统 计 软 件 为 SPSS4.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). 方 法 与 结 果. 色 谱 条 件 与 方 法 学 考 察.. 色 谱 条 件 : 本 实 验 使 用 安 捷 伦 公 司 生 产 的 Zorbax SB C-8 色 谱 柱 (50 mm 4.6 mm,5 μm) 和 预 柱 (.5 mm 4.6 mm,5 μm),0.0 M 的 醋 酸 水 溶 液 (A) 和 乙 腈 (B) 为 流 动 相 洗 脱 条 件 为 :0~4 min,b% 保 持 30%;4~5 min,b% 为 30%~4%;5~50 min,b% 为 4~44%, 最 后 用 00%B 冲 洗 5 min 进 样 量 0 [8,3] μl, 根 据 全 波 长 扫 描 和 文 献 选 择 54 nm 作 为 检 测 波 长 流 速.0 ml/min, 柱 温 5 通 过 与 标 准 品 比 较 保 留 时 间 和 紫 外 吸 收 光 谱 的 异 同 来 确 定 样 品 中 待 测 组 分 AAI 和 AAII 的 峰 位 置.. 线 性 范 围 最 低 检 测 限 与 最 低 定 量 限 : 精 密 称 取 7.3 mg 马 兜 铃 酸 混 标 标 准 品, 溶 于 0 ml 甲 醇 中, 得 标 准 品 储 备 液, 含 95. μg/ml AAI,469.95 μg/ml AAII, 保 存 于 -0 冰 箱 中 将 标 准 品 储 备 液 稀 释,AAI 和 AAII 分 别 取 五 个 浓 度 进 样, 用 峰 面 积 对 浓 度 计 算 标 准 曲 线 按 信 噪 比 (S/N) 决 定 最 低 检 测 限 LOD(S/N=3) 和 最 低 定 量 限 LOQ(S/N=0) 结 果 见 表 表 AAI 和 AAII 的 回 归 方 程 线 性 范 围 LOD 和 LOQ Table The regression equation, linearity range, LOD and LOQ of AAI & AAII 名 称 回 归 方 程 相 关 系 数 线 性 范 围 (μg/ml) LOD(ng) LOQ(ng) AAI y = 49.x - 8. r = 0.9998 3.00~48.0 0.488 0.976 AAII y = 64.46x - 6.6 r = 0.9995 0.8~9.78 0.94 0.587..3 精 密 度 与 准 确 度 : 将 标 准 品 稀 释, 分 别 在 AAI 和 AAII 的 线 性 范 围 内 取 高, 中, 低 三 个 浓 度 结 果 日 内, 日 间 精 密 度 RSD<.5%, 准 确 度 在 95.3%~03.9%(n=3), 表 明 该 色 谱 条 件 精 密 度 和 准 确 度 良 好..4 稳 定 性 重 复 性 与 加 样 回 收 率 : 取 AAI 和 AAII 的 标 准 品 溶 液,4 h 内 按 0,, 4, 8,, 4h 顺 序 分 别 进 样 6 次,RSD 均 为.7%, 说 明 AAI 和 II 的 标 准 品 溶 液 在 常 温 下 一 天 之 内 稳 定 性 良 好 分 别 称 取 0.5,.0,.5g 马 兜 铃 样 品 各 三 份, 按 下 文 优 化 好 的 条 件 提 取 并 分 析 后,RSD<% (n=3), 表 明 该 提 取 分 析 方 法 有 良 好 的 重 复 性 将 高 中 低 三 个 量 的 AAI 和 AAII 标 准 品 分 别 加 入 马 兜 铃 样 品 中, 按 上 法 提 取 分 析, 计 算 加 样 回 收 率, 结 果 在 94.4%~00.4% 之 间,RSD 在 0.45~3.5% 之 间 (n=3), 显 示 整 个 提 取 分 析 方 法 稳 定 可 靠. 加 压 溶 剂 提 取 各 影 响 因 素 的 考 察.. 提 取 方 法 : 本 实 验 将 使 用 单 因 素 考 察 的 方 法 进 行 条 件 优 化 将 受 试 药 材 粉 碎 成 适 当 目 数 后 称 取.00 g, 按 : (w/w) 称 取 硅 藻 土, 混 匀 并 装 入 提 取 罐, 开 始 优 化 时, 一 般 采 用 预 设 的 条 件 进 行 提 取, 条 件 为 提 取 压 力 500 psi, 温 度 00, 4
提 取 温 度 5 min, 置 换 体 积 40%, 个 循 环, 药 材 粉 末 粒 径 00~0 目 (0.5~0.54 mm), 甲 醇 提 取 以 后 有 关 参 数 则 使 用 优 化 的 条 件 优 化 时, 只 改 变 待 考 察 的 条 件, 其 它 条 件 不 变 提 取 完 毕 后, 将 提 取 液 转 移 至 5 ml 容 量 瓶 中 用 甲 醇 定 容, 过 0.45 μm 微 孔 滤 膜 后 进 样.. 提 取 溶 剂 的 影 响 : 对 提 取 溶 剂 的 优 化 结 果 如 表 所 示 本 实 验 分 别 选 择 纯 水 50% 水 +50% 甲 醇 纯 甲 醇 50% 甲 醇 +50% 乙 酸 乙 酯 四 种 不 同 极 性 的 提 取 溶 剂 进 行 了 实 验 虽 然 ( 水 + 甲 醇 ) 混 合 溶 剂 提 取 效 率 最 高, 但 是 从 操 作 的 简 便 性 和 定 量 的 准 确 性 的 角 度 来 考 虑, 最 终 选 择 纯 甲 醇 作 为 提 取 溶 剂 表 提 取 溶 剂 优 化 结 果 ( 单 位 :mg/g) Table Optimization results of extraction solvent (unit: mg/g) 纯 水 水 + 甲 醇 纯 甲 醇 甲 醇 + 乙 酸 乙 酯 AAI 0.7079±0.0087 0.775±0.043 0.7577±0.008 0.74±0.03 AAII 0.70±0.0009 0.399±0.0035 0.09±0.005 0.7±0.005 (n=3,rsd<3%,p<0.05)..3 药 材 粒 径 的 影 响 : 对 药 材 粒 径 的 优 化 结 果 如 表 3 所 示 由 表 可 见, 随 着 药 材 粒 径 的 减 小, 提 取 效 率 越 来 越 高, 但 是 由 于 00~0 目 和 0~40 目 的 提 取 效 率 之 间 没 有 显 著 性 差 异, 故 最 终 00~0 目 最 为 药 材 粒 径 表 3 药 材 粒 径 优 化 结 果 ( 单 位 :mg/g) Table 3 Optimization results of particle size (unit: mg/g) 40~60 目 60~80 目 80~00 目 00~0 目 0~40 目 AAI 0.4793±0.008 0.4855±0.0074 0.5559±0.005 0.7±0.00 0.7699±0.06 AAII 0.08463±0.006 0.08567±0.00 0.099±0.0009 0.36±0.0030 0.340±0.0037 (n=3,rsd<3%,p<0.05)..4 提 取 温 度 的 影 响 : 对 提 取 温 度 的 优 化 结 果 如 表 4 所 示 与 药 材 粒 径 的 优 化 相 似, 由 于 0 和 40 之 间 的 提 取 效 率 没 有 显 著 性 差 异, 故 最 终 选 择 0 最 为 提 取 温 度 表 4 提 取 温 度 优 化 结 果 ( 单 位 :mg/g) Table 4 Optimization results of extraction temperature (unit: mg/g) 80 00 0 40 AAI 0.6936±0.059 0.7080±0.004 0.788±0.093 0.739±0.056 AAII 0.±0.009 0.56±0.005 0.69±0.0034 0.34±0.004 (n=3,rsd<3%,p<0.05)..5 提 取 压 力 的 影 响 : 对 提 取 压 力 的 优 化 结 果 如 表 5 所 示 甲 醇 在 0 沸 腾 时 的 饱 和 蒸 汽 压 约 为 6 个 大 气 压, 约 合 90 psi, 因 实 验 点 均 高 于 此 值, 故 选 择 符 合 提 取 要 求 由 于 500 psi 时 的 提 取 效 率 显 著 高 于 其 它 三 者, 故 最 终 选 择 该 压 力 最 为 提 取 压 力 表 5 提 取 压 力 优 化 结 果 ( 单 位 :mg/g) Table 5 Optimization results of extraction pressure (unit: mg/g) 500 psi 000 psi 500 psi 000 psi AAI 0.799±0.06 0.75±0.0088 0.75±0.0088 0.75±0.0049 AAII 0.36±0.0060 0.76±0.005 0.76±0.005 0.6±0.004 (n=3,rsd<3%,p<0.05)..6 其 它 影 响 因 素 与 最 终 优 化 结 果 : 本 实 验 还 考 察 了 其 它 因 素 的 影 响, 比 如 静 态 提 取 时 间 冲 洗 体 积 ( 指 每 次 提 取 后 用 新 鲜 溶 剂 置 换 出 的 提 取 罐 中 提 取 液 的 比 例 ) 循 环 次 数, 样 品 加 入 量 等, 一 般 前 三 者 对 提 取 没 有 显 著 性 影 响 (P>0.05) 虽 然 有 些 因 素 如 样 品 加 入 量 等 影 响 较 大 (P<0.05), 但 综 合 考 虑 提 取 效 率 和 实 验 条 件, 最 终 确 定 的 条 件 为 : 甲 醇 提 取, 药 材 粉 末 00~0 目 (0.5~0.54 mm).00 5
g, 提 取 压 力 500 psi, 提 取 温 度 0, 静 态 提 取 时 间 0 min, 冲 洗 体 积 40%, 循 环 次..7 提 取 完 全 性 : 提 取 的 完 全 性 是 检 验 一 个 提 取 方 法 好 坏 的 主 要 指 标 之 一 PLE 提 取 的 完 全 性 常 用 回 收 率 来 表 示 [3], 定 义 为 在 对 同 一 份 样 品 用 同 一 种 方 法 连 续 的 几 次 提 取 中, 第 一 次 提 取 出 的 待 测 成 分 的 量 与 连 续 几 次 提 取 出 的 待 测 成 分 的 总 量 之 比, 即 A Recovery = 00% n Ai i= 其 中,Recovery 指 回 收 率,A 指 提 取 出 的 待 测 成 分 的 量 (mg),i 指 提 取 次 数 ( 通 常 到 待 测 成 分 不 再 被 检 出 为 止 ) 在 使 用 优 化 条 件 从 马 兜 铃 中 提 取 马 兜 铃 酸 时,AAI 和 AAII 的 回 收 率 分 别 为 95.40% 和 97.94% ( 表 6), 表 明 本 法 对 马 兜 铃 酸 I 和 II 的 提 取 较 为 完 全..8 本 提 取 方 法 的 适 用 性 : 为 了 考 察 本 PLE 提 取 方 法 对 其 它 药 材 中 同 类 成 分 的 提 取 效 率, 本 实 验 亦 对 关 木 通 青 木 香 和 广 防 己 进 行 了 加 压 溶 剂 提 取, 对 马 兜 铃 酸 I 和 II 的 提 取 回 收 率 做 了 考 察, 使 用 外 标 法.. 项 下 的 标 准 曲 线 计 算 药 材 中 的 马 兜 铃 酸 含 量, 结 果 见 表 6 结 合 马 兜 铃 的 回 收 率 可 见, 该 法 对 不 同 药 材 ( 来 自 不 同 植 物 或 不 同 药 用 部 位 ) 一 次 提 取 的 回 收 率 都 在 95% 以 上, 显 示 了 良 好 的 适 用 性, 这 提 示 该 法 具 有 推 广 价 值 现 把 四 种 药 材 中 马 兜 铃 酸 I 和 II 的 含 量 列 表 如 下, 如 表 7 所 示 表 6 关 木 通 青 木 香 广 防 己 和 马 兜 铃 的 PLE 提 取 回 收 率 (n=3) Table 6 The PLE recovery of Caulis Aristolochiae manshuriensis, Radix Aristolochiae, Radix Arsitolochiae fangchi and Fructus Aristolochiae. (n=3) 药 材 名 称 药 用 部 位 待 测 成 分 回 收 率 (%) 第 一 次 提 取 第 二 次 提 取 第 三 次 提 取 关 木 通 藤 茎 AAI 99.5±3.70 0.78±0.5 0.07±0.0 AAII 98.96±3.6.04±0.3 青 木 香 根 AAI 98.84±.40.6±0.5 AAII 98.3±.46.87±0.38 广 防 己 根 AAI 98.86±.33.4±0.80 AAII 马 兜 铃 果 实 AAI 97.94±.6.06±0.74 AAII 95.40±3. 4.60±0.74 表 7 关 木 通 青 木 香 广 防 己 和 马 兜 铃 中 马 兜 铃 酸 I 和 II 的 含 量 ( 单 位 mg/g,n=3) Table 7 The contents of AAI & AAII in Caulis Aristolochiae manshuriensis, Radix Aristolochiae, Radix Arsitolochiae fangchi and Fructus Aristolochiae. (unit: mg/g,n=3) 关 木 通 青 木 香 广 防 己 马 兜 铃 AAI.7307±0.0 0.9637±0.034 0.089±0.0009 0.748±0.08 AAII 0.687±0.049 0.3±0.0058 0.87±0.004 各 药 材 的 色 谱 图 如 图 所 示 : 6
mau 50 00 A 50 00 50 0 0 0 0 30 40 50 min mau 50 00 B 50 00 50 0 0 0 0 30 40 50 min mau 00 80 60 C 40 0 0 0 0 0 30 40 50 min 7
mau 00 000 D 800 600 400 00 0 0 0 0 30 40 50 min mau 350 300 E 50 00 50 00 50 0 0 0 0 30 40 50 min 图 标 准 品 和 四 种 药 材 加 压 溶 剂 提 取 的 色 谱 图 A: 马 兜 铃 酸 标 准 品 ;B: 马 兜 铃 ;C: 关 木 通 ;D: 青 木 香 ;E: 广 防 己 峰 的 编 号 及 名 称 : 马 兜 铃 酸 II; 马 兜 铃 酸 I Fig HPLC diagram of AA standards and the four plants. A. AA standards; B. Fructus Aristolochiae; C. Caulis Aristolochiae manshuriensis; D. Radix Arsitolochiae; E. Radix Arsitolochiae fangchi. Peaks:. Aristolochic acid II;. Aristolohchic acid I..3 与 其 它 方 法 的 比 较 [8].3. 超 声 提 取 方 法 : 根 据 张 翠 英 等 人 的 超 声 提 取 方 法, 本 实 验 作 适 当 修 正 后, 确 定 样 品 超 声 处 理 方 法 如 下 : 将 马 兜 铃 药 材 粉 碎 后 称 取.00 g, 装 入 50 ml 具 塞 锥 形 瓶 中, 精 密 加 入 0.00 ml 甲 醇, 超 声 提 取 5 min, 超 声 功 率.8 kw 超 声 完 毕 冷 却 后 补 重, 取 适 量 溶 液 离 心 (5400 r/min, 5 min), 过 0.45 μm 微 孔 滤 膜 后 进 样 [0].3. 索 氏 提 取 方 法 : 依 据 张 兰 桐 等 人 的 报 道, 并 结 合 实 验 时 的 实 际 情 况, 确 定 样 品 的 索 氏 提 取 方 法 如 下 : 将 马 兜 铃 药 材 粉 碎 后 称 取.00 g, 装 入 索 氏 提 取 仪 8
中, 用 80 ml 甲 醇 加 热 回 流 5 h 提 取 完 毕 后, 将 提 取 液 定 容 至 00 ml, 过 0.45 μm 微 孔 滤 膜 后 进 样.3.3 与 传 统 提 取 方 法 的 对 比 : 结 果 如 表 8 所 示 可 以 看 出, 三 种 方 法 中, 加 压 溶 剂 提 取 的 效 率 显 著 高 于 其 他 两 种 传 统 方 法 (P<0.05) 而 且 加 压 溶 剂 提 取 耗 时 短, 有 机 溶 剂 用 量 少 表 8 加 压 溶 剂 提 取 与 传 统 提 取 方 法 的 对 比 (n=3) 方 法 名 称 提 取 时 间 一 次 操 作 时 间 消 耗 的 溶 剂 提 取 效 率 (mg/g) (min) (h) (ml) AAI AAII 加 压 提 取 0 0.8 8 0.748±0.08 0.87±0.004 超 声 提 取 5 0 0.597±0.0055 0.094±0.0004 索 氏 提 取 300 6 80 0.64±0.06 0.065±0.005 3. 讨 论 通 过 上 面 的 讨 论, 可 以 看 出 提 取 溶 剂 药 材 粒 径 提 取 温 度 和 提 取 压 力 等 因 素 是 影 响 PLE 提 取 的 主 要 参 数 提 取 溶 剂 是 加 压 溶 剂 提 取 中 的 关 键 性 因 素 [4] 因 马 兜 铃 酸 带 有 一 个 羧 基, 具 有 一 定 极 性, 故 当 使 用 极 性 较 小 的 乙 酸 乙 酯 进 行 提 取 时, 效 率 较 低 甲 醇 的 溶 解 性 较 好, 是 常 用 溶 剂, 又 因 其 极 性 较 强, 故 对 马 兜 铃 酸 有 较 好 的 提 取 能 力 水 对 马 兜 铃 酸 的 提 取 也 较 好, 可 能 是 因 为 水 和 甲 醇 的 极 性 都 与 马 兜 铃 酸 相 近 的 缘 故 另 一 方 面, 由 于 水 对 药 材 基 质 有 溶 胀 作 用 [5], 故 水 的 加 入 对 于 提 取 有 利, 这 也 可 能 是 水 与 甲 醇 的 溶 剂 组 合 在 实 验 中 提 取 效 率 最 高 的 原 因 之 一 药 材 粉 末 的 目 数, 即 粒 度 分 布 同 样 是 影 响 提 取 效 率 的 一 个 重 要 因 素 通 常 药 材 粉 末 越 细, 提 取 效 率 越 高 因 为 一 方 面 当 药 材 粒 径 减 小 时 药 材 的 比 表 面 积 增 大, 与 溶 剂 接 触 更 加 充 分 ; 另 一 方 面 药 材 中 的 成 分 从 基 质 扩 散 到 表 面 的 时 间 更 短, 因 此 一 般 来 讲 粒 径 的 减 小 可 以 大 幅 度 提 高 提 取 效 率 [5] 温 度 是 PLE 提 取 中 最 关 键 的 参 数 之 一 一 方 面 温 度 提 高 了 溶 质 的 溶 解 平 衡, 即 提 高 了 溶 解 度, 另 一 方 面 也 大 大 加 快 了 溶 质 的 传 质 过 程, 也 就 是 提 高 了 扩 散 速 率 PLE 正 是 使 提 取 溶 剂 获 得 了 远 高 于 正 常 沸 点 的 高 温, 才 获 得 了 相 当 高 的 提 取 效 率 但 是 待 测 成 分 在 提 取 温 度 下 的 稳 定 性 是 一 个 需 要 考 虑 的 问 题, 在 本 实 验 中, 有 报 道 表 明 马 兜 铃 酸 在 高 温 (0 ) 下 稳 定 [6], 所 以 本 法 温 度 适 合 压 力 在 本 文 中 也 有 显 著 性 影 响 在 加 压 溶 剂 提 取 中 施 加 高 压 是 为 了 保 证 溶 剂 在 高 温 下 仍 旧 可 以 保 持 液 态, 同 时, 高 压 还 有 助 于 溶 剂 进 入 药 材 基 质 内 部, 打 断 被 提 取 成 分 与 基 质 之 间 的 作 用 力, 从 而 提 高 提 取 效 率 除 了 以 上 参 数 以 外, 提 取 方 式 也 是 一 个 需 要 注 意 的 因 素 Eng-Shi Ong 等 人 [6] 用 自 行 组 装 的 动 态 加 压 溶 剂 提 取 设 备 对 青 木 香 中 马 兜 铃 酸 I 和 II 的 提 取 条 件 进 行 了 优 化 但 该 法 的 提 取 时 间 需 5~0 min, 且 为 非 自 动 化, 操 作 相 对 复 杂, 故 本 实 验 中 静 态 提 取 的 方 法 优 势 较 明 显 当 然 由 于 动 静 态 提 取 都 在 进 一 步 发 展 中, 孰 优 孰 劣 还 需 深 入 研 究 4. 结 论 在 静 态 加 压 溶 剂 提 取 条 件 下, 提 取 溶 剂 种 类 药 材 粒 径 提 取 温 度 提 取 压 力 药 材 加 入 量 对 马 兜 铃 酸 I 和 II 的 提 取 效 率 影 响 显 著, 而 提 取 时 间 冲 洗 体 积 和 循 环 次 数 的 影 响 较 小 与 传 统 的 超 声 和 索 氏 提 取 对 比 后,PLE 方 法 显 示 了 更 高 的 提 取 效 率, 且 操 作 简 便, 耗 时 短, 重 现 性 好, 采 用 优 化 的 方 法 一 次 可 将 不 同 药 材 中 的 马 兜 铃 酸 提 取 完 全, 表 明 它 不 仅 适 用 于 马 兜 铃 药 材 的 提 取, 对 于 其 它 含 马 9
兜 铃 酸 的 药 材 中 马 兜 铃 酸 类 物 质 的 提 取 也 有 很 好 的 适 用 性 与 动 态 加 压 溶 剂 提 取 的 对 比 显 示 静 态 提 取 的 方 法 耗 时 短, 操 作 简 便, 因 此 在 马 兜 铃 酸 的 提 取 中 更 具 优 势 致 谢 本 文 作 者 感 谢 博 士 生 杨 丰 庆 高 建 莉 和 李 鹏 对 本 研 究 的 宝 贵 指 导, 感 谢 实 验 室 技 术 员 黎 畅 明 对 本 实 验 的 大 力 支 持, 感 谢 梁 雪 丹 同 学 的 重 要 帮 助 参 考 文 献 [] Ch P( 中 国 药 典 )[S]. Vol I. 005. [] Tong Y Q,Hou H M,Piao Z X,et al. The mechanism of aristolochic acid nephropathy [J]. International Journal of Urology and Nephrology( 国 际 泌 尿 系 统 杂 志 ),006,6():7-73. [3] Arlt VM,Stiborova M, Schmeiser HH. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review [J]. Mutagenesis,00, 7(4):65-77. [4] Vanherweghem JL,Depierreux M,Tielemans C,et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs [J]. Lancet,993,34:387-39. [5] Jean-Robert loset, Guy Emmanuel Raoelison, Kurt Hostettmann. An LC/DAD-UV/MS method for the rapid detection of Aristolochic Acid in plant preparations [J]. Planta Med,00,68:856-858. [6] Shun-An Chan,Ming-Jyh Chen,Tsung-Yun Liu,et al. Determination of aristolochic acids in medicinal plant and herbal product by liquid chromatography-electrospray-ion trap mass spectrometry [J]. Talanta,003, 60:679-685. [7] Li L,Wang Z M,Gao H M,et al. Determination of total aristolochic acid in traditional Chinese medicines containing aristolochic acid by ultraviolet spectrophotometry [J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae( 中 国 实 验 方 剂 学 杂 志 ),006,():-3. [8] Zhang C Y,Wang X,Shang M Y,et al. Simultaneous determination of five aristolochic acids and two aristololactams in Aristolochia plants by highperformance liquid chromatography [J]. Biomed. Chromatogr,006,0: 309-38. [9] Jiang X,Wang Z M,You L S,et al. Determination of aristolochic acid A in Radix Aristolochiae and Herba Asari by RP-HPLC [J]. China Journal of Chinese Materia Medica( 中 国 中 药 杂 志 ),004,9(5):409-4. [0] Zhang L T,Cui X H,Yuan Z F,et al. RP-HPLC assay of aristolochic acid A in Chinese traditional Medicine materials and their compound preparations [J]. Chin J Pharm Anal( 药 物 分 析 杂 志 ),003,3(3):5-8. [] Zhao N,Lai J F,Bi K S. Determination of aristolochic acid A in Radix Aristolochiae by RP-HPLC [J]. Journal of Shengyang 0
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