氨 基 酸 和 生 物 资 源 2015,37(3):65~68 犃 犿 犻 狀 狅 犃 犮 犻 犱 狊 牔 犅 犻 狅 狋 犻 犮 犚 犲 狊 狅 狌 狉 犮 犲 狊 犇 犗 犐 :10.14188/j.ajsh.2015.03.014 全 细 胞 催 化 合 成 阿 糖 胞 苷 工 艺 的 研 究 李 鹏, 潘 婕, 周 鸣 飞 ( 湖 北 省 荆 门 市 第 一 人 民 医 院 肿 瘤 中 心, 湖 北 荆 门 448000) 摘 要 : 以 阿 糖 尿 苷 和 胞 嘧 啶 为 原 料, 采 用 枯 草 芽 胞 杆 菌 犅 犪 犮 犻 犾 狌 狊 狌 犫 狋 犻 犾 狊 A302 作 为 全 细 胞 催 化 剂 进 行 阿 糖 胞 苷 的 生 物 合 成, 通 过 单 因 素 与 正 交 试 验 的 考 察, 得 到 了 全 细 胞 催 化 合 成 阿 糖 胞 苷 的 最 佳 反 应 条 件 : 反 应 初 始 ph 为 7.0, 反 应 温 度 为 36, 催 化 剂 添 加 量 为 250mg, 摇 床 转 速 为 190rpm, 该 条 件 得 到 的 阿 糖 胞 苷 收 率 达 到 65.3% 该 方 法 操 作 简 单, 反 应 体 系 杂 质 较 少, 是 合 成 阿 糖 胞 苷 的 一 种 有 效 可 行 的 方 法 关 键 词 : 枯 草 芽 胞 杆 菌 ; 全 细 胞 ; 生 物 催 化 ; 阿 糖 胞 苷 中 图 分 类 号 :TQ463 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :1006 8376(2015)03 0065 04 犛 狋 狌 犱 狔 狅 狀 犆 狔 狋 犪 狉 犪 犫 犻 狀 犲 犛 狔 狀 狋 犺 犲 狊 犻 狊 犜 犲 犮 犺 狀 狅 犾 狅 犵 狔 犫 狔 犠 犺 狅 犾 犲 犆 犲 犾 犆 犪 狋 犪 犾 狔 狊 犻 狊 犔 犐 犘 犲 狀 犵, 犘 犃 犖 犑 犻 犲, 犣 犎 犗 犝 犕 犻 狀 犵 犳 犲 犻 (CenterofRadiationOncology,theFirstPeople'sHospitalofJingmen,Jingmen448000,Hubei,China) 犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋 :Accordingtosinglefactorexperimentandorthogonalexperiment, 犅 犪 犮 犻 犾 狌 狊 狌 犫 狋 犻 犾 狊 A302wasusedas wholecelcatalystanduracilarabinosideandcytosinewereusedasraw materialtosynthesiscytarabine.theoptimal conditionsaredeterminedasfolows:initialphof7.0,reactiontemperatureof36,amountofcatalystof250mg, androtatespeedof190rpm.theyieldofcytarabinewas65.3%.themethodhastheadvantagesofsimpleoperation, lessimpuritiesinthereactionsystem,soitisanefectiveandfeasiblemethodforthesynthesisofcytarabine. 犓 犲 狔 狑 狅 狉 犱 狊 : 犅 犪 犮 犻 犾 狌 狊 狌 犫 狋 犻 犾 狊 ;wholecel;biocatalysis;cytarabine 人 类 生 存 环 境 的 日 益 恶 化 使 癌 症 成 为 威 胁 人 类 健 康 的 最 大 杀 手 如 何 开 发 出 疗 效 好 安 全 性 高 副 作 用 小 的 新 型 药 物 对 抗 肿 瘤 治 疗 具 有 极 其 重 要 的 意 [1~3] 义 阿 糖 胞 苷 是 一 种 嘧 啶 类 抗 代 谢 药 物, 因 能 明 显 抑 制 细 胞 DNA 的 合 成, 干 扰 细 胞 的 增 殖 而 广 泛 用 于 白 血 病 淋 巴 瘤 肺 癌 等 疾 病 的 临 床 治 疗 该 药 物 进 入 体 内 后 经 膦 酸 激 酶 活 化 而 转 化 成 阿 糖 胞 苷 三 磷 酸, 后 者 通 过 抑 制 DNA 多 聚 酶 的 生 成 而 迫 使 [4,5] 细 胞 发 生 凋 亡, 发 挥 抗 癌 疗 效 目 前, 阿 糖 胞 苷 的 生 产 主 要 是 采 用 有 机 合 成 法, 该 法 合 成 的 阿 糖 胞 苷 具 有 收 率 高, 后 续 处 理 工 艺 简 单 的 优 点, 但 该 法 同 时 也 存 在 一 些 不 足, 如 工 艺 步 骤 [6] 复 杂 区 域 选 择 性 差, 环 境 污 染 严 重 等 问 题 人 们 针 对 以 上 问 题 提 出 了 全 细 胞 催 化 法, 通 过 采 用 完 整 [7] 的 生 物 有 机 体 作 为 催 化 剂 来 进 行 化 学 反 应 转 化 收 稿 日 期 :2015 04 23 修 回 日 期 :2015 06 12 作 者 简 介 : 李 鹏 (1979 ), 男, 硕 士, 主 治 医 师, 现 主 要 从 事 肿 瘤 放 化 疗 工 作 E mail:13908690751@163.com 该 方 法 具 有 条 件 温 和 反 应 周 期 短 及 环 境 友 好 等 优 点 因 此, 在 阿 糖 胞 苷 制 备 的 研 究 中, 本 文 选 取 具 有 高 活 性 的 核 苷 磷 酸 化 酶 枯 草 芽 胞 杆 菌 为 催 化 剂, 以 阿 糖 尿 苷 和 胞 嘧 啶 为 起 始 原 料, 通 过 对 全 细 胞 生 物 催 化 过 程 中 各 参 数 进 行 优 化, 探 讨 出 最 佳 反 应 条 件, 旨 在 为 工 业 化 中 全 细 胞 生 产 阿 糖 胞 苷 提 供 一 定 的 参 考 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 菌 种 培 养 基 和 缓 冲 溶 液 菌 种 : 枯 草 芽 胞 杆 菌 犅 犪 犮 犻 犾 狌 狊 狌 犫 狋 犻 犾 狊 A302, 本 单 位 实 验 室 保 藏 种 子 培 养 基 (g L -1 ): 葡 萄 糖 20, 蛋 白 胨 10, 牛 肉 膏 5,pH7.0,121 高 压 蒸 汽 灭 菌 15min 发 酵 培 养 基 (g L -1 ): 葡 萄 糖 50, 硫 酸 镁 5, 甘 油 20, 蛋 白 胨 10, 尿 素 5, 磷 酸 氢 二 钠 15 磷 酸 二 氢 钾 5,pH7.0,121 高 压 蒸 汽 灭 菌 15min 转 化 培 养 基 (g L -1 ): 葡 萄 糖 30, 阿 糖 尿 苷 20, 胞 嘧 啶 20, 吐 温 805, 硫 酸 镁 5, 硫 酸 锰 0.05, 氯
2 李 鹏 等 : 全 细 胞 催 化 合 成 阿 糖 胞 苷 工 艺 的 研 究 化 钠 0.6, 氯 化 铁 0.02,0.1 mol L -1 磷 酸 氢 二 钠 磷 酸 二 氢 钾 缓 冲 溶 液,121 高 压 蒸 汽 灭 菌 15min 1.2 主 要 试 剂 和 仪 器 1.2.1 试 剂 标 准 品 : 阿 糖 胞 苷 ( 美 国 Sigma 公 司 ); 阿 糖 尿 苷 胞 嘧 啶 ( 上 海 研 生 实 业 有 限 公 司 ); 磷 酸 氢 二 钠 磷 酸 二 氢 钾 硫 酸 镁 吐 温 80( 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 ); 蛋 白 胨 牛 肉 膏 ( 北 京 奥 博 星 生 物 技 术 有 限 责 任 公 司 ); 硫 酸 锰 氯 化 铁 氯 化 钠 尿 素 葡 萄 糖 ( 西 陇 化 工 股 份 有 限 公 司 ); 甘 油 ( 湖 南 尔 康 制 药 有 限 公 司 ) 1.2.2 仪 器 洁 净 工 作 台 (SW CF IF 上 海 博 讯 实 业 有 限 公 司 ); 高 效 液 相 色 谱 仪 (Agilent1200 美 国 安 捷 伦 公 司 ); 振 荡 培 养 器 ZHWY 111B( 上 海 智 城 分 析 仪 器 制 药 有 限 公 司 ); 高 速 冷 冻 离 心 机 H2050R 1( 湖 南 湘 仪 离 心 机 仪 器 有 限 公 司 ); 隔 水 式 恒 温 培 养 箱 GHP 9160( 上 海 一 恒 科 技 有 限 公 司 ); 水 浴 恒 温 摇 床 SHA B( 金 坛 市 国 旺 实 验 仪 器 厂 ); 冷 冻 干 燥 机 CoolSafe110 4 美 国 (Labconco 公 司 ) 1.3 实 验 方 法 1.3.1 全 细 胞 催 化 剂 制 备 取 斜 面 培 养 基 上 菌 苔 一 环 接 种 于 种 子 液 培 养, 200rpm,32, 培 养 24h; 将 培 养 好 的 种 子 培 养 基 按 10% 的 接 种 量 接 种 于 发 酵 培 养 基 中,200rpm, 32, 摇 瓶 培 养 48h; 培 养 结 束 后 发 酵 液 在 8000 rpm 离 心 30 min, 弃 上 清 液, 湿 菌 体 用 磷 酸 缓 冲 溶 液 洗 涤 2 次, 真 空 冷 冻 干 燥 24h, 获 得 冻 干 菌 体 即 为 全 细 胞 催 化 剂 全 细 胞 催 化 剂 于 4 冰 箱 中 密 封 贮 藏 1.3.2 阿 糖 胞 苷 合 成 用 0.1mol L -1 磷 酸 氢 二 钠 磷 酸 二 氢 钾 缓 冲 液 配 制 100 ml ph 7.0 的 转 化 培 养 基, 加 入 200 mg 全 细 胞 催 化 剂, 在 水 浴 恒 温 摇 床 ( 转 速 为 200 rmp, 温 度 36 ) 上 转 化 24h, 结 束 后 对 转 化 液 中 的 阿 糖 胞 苷 含 量 进 行 测 定 1.3.3 单 因 素 试 验 优 化 在 1.3.2 试 验 方 法 基 础 上 分 别 考 察 ph(4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0), 反 应 温 度 (28 30 32 34 36 38 40 ), 转 速 (40 160 180 200 220 240 rpm), 催 化 剂 用 量 (100 150 200 250 300mg) 对 全 细 胞 催 化 合 成 阿 糖 胞 苷 收 率 的 影 响, 每 次 实 验 只 改 变 一 个 因 素 1.3.4 正 交 试 验 设 计 根 据 单 因 素 试 验 所 得 结 果, 选 择 反 应 体 系 ph (A) 温 度 (B) 转 速 (C) 和 催 化 剂 用 量 (D)4 个 因 素, 以 阿 糖 胞 苷 收 率 为 衡 量 指 标, 进 行 4 因 素 3 水 平 L 9 (3 4 ) 的 正 交 试 验, 如 表 1 所 示, 确 定 全 细 胞 合 成 阿 糖 胞 苷 的 最 佳 反 应 条 件 表 1 正 交 试 验 因 素 及 水 平 犜 犪 犫.1 犗 狉 狋 犺 狅 犵 狅 狀 犪 犾 犲 狓 狆 犲 狉 犻 犿 犲 狀 狋 犪 犾 犳 犪 犮 狋 狅 狉 狊 犪 狀 犱 狋 犺 犲 犻 狉 犾 犲 狏 犲 犾 狊 水 平 因 素 A (ph) B ( 温 度 )/ C ( 转 速 )/rpm D ( 催 化 剂 量 )/mg 1 6.5 35 170 240 2 7.0 36 180 250 3 7.5 37 190 260 1.3.5 阿 糖 胞 苷 的 测 定 阿 糖 胞 苷 均 采 用 高 效 液 相 色 谱 法 进 行 检 [8,9] 测 具 体 检 测 条 件 : 色 谱 柱 :SunFireTM C18, 4.6mm 250mm,5μm; 流 动 相 : 甲 醇 水 ( 犞 犞 ) =20 80; 流 速 :0.8mL min -1 ; 柱 温 :30 ; 进 样 量 :10μL; 检 测 波 长 :280nm 阿 糖 胞 苷 标 准 曲 线 制 作 : 精 密 称 取 阿 糖 胞 苷 标 准 品, 用 蒸 馏 水 分 别 配 制 成 浓 度 为 0.01 0.05 0.1 1.5 2g L -1 的 阿 糖 胞 苷 标 准 溶 液 和 阿 糖 尿 苷 标 准 溶 液 采 用 高 效 液 相 色 谱 对 阿 糖 胞 苷 进 行 检 测, 分 别 以 峰 面 积 对 阿 糖 胞 苷 浓 度 作 标 准 曲 线 样 品 的 测 定 : 取 5mL 转 化 液, 用 0.1mol L -1 的 磷 酸 缓 冲 溶 液 定 容 至 50mL, 轻 轻 摇 匀, 在 4 10000r min -1 条 件 下 离 心 10 min, 弃 沉 淀, 上 清 液 经 0.22μm 滤 膜 过 滤 后 进 行 HPLC 检 测 阿 糖 胞 苷 收 率 /%=( 阿 糖 胞 苷 浓 度 / 阿 糖 尿 苷 浓 度 ) 100% 2 结 果 2.1 全 细 胞 生 物 催 化 合 成 阿 糖 胞 苷 的 单 因 素 试 验 2.1.1 ph 对 阿 糖 胞 苷 合 成 的 影 响 转 化 体 系 的 ph 值 是 影 响 生 物 催 化 反 应 的 重 要 因 素 之 一 本 实 验 中 设 置 转 化 培 养 基 ph 分 别 为 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0, 其 他 试 验 条 件 同 1.3.2, 考 察 不 同 ph 的 转 化 培 养 基 对 阿 糖 胞 苷 合 成 的 影 响, 实 验 3 次, 结 果 如 图 1 所 示 从 图 中 可 以 看 出, 随 着 转 化 培 养 基 的 ph 值 的 增 大, 合 成 阿 糖 胞 苷 的 收 率 也 逐 渐 增 大, 当 ph 达 到 7.0 时, 阿 糖 胞 苷 的 收
氨 基 酸 和 生 物 资 源 3 率 最 高, 继 续 增 加 转 化 培 养 基 的 ph 值, 阿 糖 胞 苷 的 收 率 反 而 出 现 了 下 降, 这 可 能 是 因 为 过 高 的 ph 值 抑 制 了 细 胞 内 核 酸 酶 的 活 性, 导 致 阿 糖 胞 苷 合 成 反 应 受 阻 因 此, 选 择 ph 7.0 为 催 化 合 成 阿 糖 胞 苷 反 应 的 最 佳 ph 值 [11] 率 本 实 验 方 法 同 1.3.2, 反 应 体 系 ph 为 7.0, 水 浴 恒 温 摇 床 温 度 为 36, 考 察 不 同 转 速 (40 160 180 200 220 240rpm) 对 阿 糖 胞 苷 合 成 的 影 响, 实 验 3 次, 所 得 结 果 如 图 3 所 示 随 着 水 浴 摇 床 转 速 的 增 加, 阿 糖 胞 苷 收 率 也 相 应 增 加, 当 转 速 为 180 rpm 时, 阿 糖 胞 苷 收 率 达 到 最 大, 继 续 增 大 转 速, 阿 糖 胞 苷 收 率 则 下 降 这 可 能 是 由 于 转 速 过 大, 导 致 部 分 细 胞 附 着 在 反 应 瓶 壁, 不 能 与 反 应 介 质 充 分 接 触, 减 少 了 参 与 反 应 的 催 化 剂 用 量, 从 而 使 阿 糖 胞 苷 收 率 下 降 本 实 验 选 择 180rpm 为 催 化 反 应 的 最 佳 转 速 图 1 狆 犎 对 阿 糖 胞 苷 合 成 收 率 的 影 响 犉 犻 犵.1 犈 犳 犲 犮 狋 狊 狅 犳 犱 犻 犳 犲 狉 犲 狀 狋 狆 犎 狅 狀 狋 犺 犲 狔 犻 犲 犾 犱 狅 犳 犮 狔 狋 犪 狉 犪 犫 犻 狀 犲 2.1.2 温 度 对 阿 糖 胞 苷 合 成 的 影 响 全 细 胞 催 化 反 应 其 本 质 仍 是 酶 促 反 应, 因 此 温 [10] 度 也 是 影 响 全 细 胞 催 化 反 应 的 主 要 因 素 之 一 本 试 验 方 法 同 1.3.2, 在 ph7.0 的 反 应 体 系 下 考 察 不 同 反 应 温 度 (28 30 32 34 36 38 40 ) 对 阿 糖 胞 苷 收 率 的 影 响, 试 验 3 次, 所 得 结 果 如 图 2 所 示 从 图 2 可 以 看 出, 随 着 温 度 的 升 高, 阿 糖 胞 苷 收 率 也 逐 渐 升 高, 当 温 度 达 到 36 时, 其 收 率 达 到 最 大, 继 续 升 高 温 度, 阿 糖 胞 苷 的 收 率 出 现 下 降 的 趋 势, 原 因 可 能 是 温 度 升 高 使 细 胞 膜 的 通 透 性 增 加, 酶 与 底 物 间 的 有 效 碰 撞 增 多, 合 成 的 产 物 也 能 更 快 渗 透 到 胞 外, 但 过 高 的 温 度 会 导 致 反 应 中 的 酶 发 生 失 活, 催 化 反 应 速 率 随 之 降 低 因 此, 本 实 验 选 择 36 作 为 阿 糖 胞 苷 合 成 的 最 佳 反 应 温 度 图 3 转 速 对 阿 糖 胞 苷 合 成 收 率 的 影 响 犉 犻 犵.3 犈 犳 犲 犮 狋 狊 狅 犳 狉 狅 狋 犪 狋 犻 狅 狀 犪 犾 狊 狆 犲 犱 狅 狀 狋 犺 犲 狔 犻 犲 犾 犱 狅 犳 犮 狔 狋 犪 狉 犪 犫 犻 狀 犲 2.1.4 催 化 剂 量 对 阿 糖 胞 苷 合 成 的 的 影 响 实 验 方 法 同 1.3.2, 在 反 应 体 系 ph 为 7.0, 水 浴 恒 温 摇 床 温 度 为 36, 转 速 为 180rmp 的 条 件 下, 考 察 不 同 催 化 剂 用 量 (100 150 200 250 300 mg) 对 阿 糖 胞 苷 收 率 的 影 响, 试 验 3 次, 结 果 如 图 4 所 示 随 着 催 化 剂 用 量 的 增 加, 阿 糖 胞 苷 收 率 也 逐 渐 增 加, 当 催 化 剂 用 量 达 到 250mg 时, 继 续 增 加 催 化 剂 用 量, 阿 糖 胞 苷 收 率 则 下 降, 原 因 可 能 是 反 应 过 程 中 存 在 能 降 解 阿 糖 胞 苷 的 酶 系, 反 应 中 在 合 成 阿 糖 胞 苷 的 同 时 也 伴 随 着 降 解 因 此 本 实 验 选 择 催 化 剂 量 250mg 为 最 佳 值 继 续 进 行 下 一 步 实 验 图 2 温 度 对 阿 糖 胞 苷 合 成 收 率 的 影 响 犉 犻 犵.2 犈 犳 犲 犮 狋 狊 狅 犳 犱 犻 犳 犲 狉 犲 狀 狋 犲 犿 狆 犲 狉 犪 狋 狌 狉 犲 狅 狀 狋 犺 犲 狔 犻 犲 犾 犱 狅 犳 犮 狔 狋 犪 狉 犪 犫 犻 狀 犲 2.1.3 转 速 对 阿 糖 胞 苷 合 成 的 影 响 转 速 的 变 化 能 直 接 影 响 反 应 体 系 中 的 传 质 效 图 4 催 化 剂 量 对 阿 糖 胞 苷 合 成 收 率 的 影 响 犉 犻 犵.4 犈 犳 犲 犮 狋 狊 狅 犳 犮 犪 狋 犪 犾 狔 狊 狋 犪 犿 狅 狌 狀 狋 狅 狀 狋 犺 犲 狔 犻 犲 犾 犱 狅 犳 犮 狔 狋 犪 狉 犪 犫 犻 狀 犲
4 李 鹏 等 : 全 细 胞 催 化 合 成 阿 糖 胞 苷 工 艺 的 研 究 2.2 全 细 胞 催 化 合 成 阿 糖 胞 苷 正 交 试 验 及 分 析 通 过 单 因 素 实 验 结 果 的 综 合 分 析, 根 据 表 1 做 4 因 素 3 水 平 正 交 试 验, 试 验 结 果 如 表 2 所 示, 以 阿 糖 胞 苷 的 收 率 为 衡 量 指 标, 确 定 全 细 胞 催 化 合 成 的 最 佳 反 应 条 件 实 验 号 表 2 正 交 试 验 结 果 犜 犪 犫.2 犚 犲 狊 狌 犾 狋 狊 狅 犳 狅 狉 狋 犺 狅 犵 狅 狀 犪 犾 犲 狓 狆 犲 狉 犻 犿 犲 狀 狋 因 素 A B C D 阿 糖 胞 苷 收 剂 量 率 /% 1 1 1 1 1 50.4 2 1 2 2 2 55.1 3 1 3 3 3 44.9 4 2 1 2 3 57.5 5 2 2 3 1 64.3 6 2 3 1 2 46.8 7 3 1 3 2 61.2 8 3 2 1 3 52.6 9 3 3 2 1 41.7 K1 50.13 56.37 49.93 52.13 K2 56.20 57.33 51.43 54.37 K3 51.83 44.47 56.80 51.67 R 6.07 12.87 6.87 2.70 通 过 表 2 正 交 试 验 结 果 可 以 看 出, 各 催 化 反 应 参 数 对 阿 糖 胞 苷 收 率 的 影 响 顺 序 大 致 为 : 反 应 温 度 > 转 速 >ph> 催 化 剂 量, 全 细 胞 催 化 合 成 阿 糖 胞 苷 的 最 佳 反 应 条 件 为 A 2B 2C 3D 2, 即 反 应 体 系 ph7.0, 反 应 温 度 36, 摇 床 转 速 为 190rmp, 全 细 胞 催 化 剂 的 量 为 250mg, 催 化 反 应 所 得 到 的 阿 糖 胞 苷 收 率 最 高 在 正 交 试 验 结 果 的 基 础 上, 进 一 步 对 其 进 行 方 差 分 析, 如 表 3 所 示, 通 过 表 示 可 以 看 出,B 因 素 相 比 其 他 因 素 对 催 化 反 应 影 响 最 显 著, 即 反 应 温 度 是 阿 糖 胞 苷 合 成 的 关 键 因 素 同 时, 可 以 看 出 反 应 最 佳 组 合 条 件 为 A 2B 2C 3D 2, 这 与 表 2 的 结 果 是 一 致 的 由 于 该 最 佳 组 合 条 件 在 正 交 试 验 设 计 中 未 出 现 过, 因 此 有 必 要 对 该 组 合 进 行 进 一 步 验 证 在 该 组 合 条 件 下 分 别 进 行 了 3 次 全 细 胞 催 化 合 成 阿 糖 胞 苷 的 实 验, 将 得 到 的 阿 糖 胞 苷 收 率 取 平 均 值, 最 终 得 到 阿 糖 胞 苷 收 率 为 65.3%, 比 正 交 试 验 设 计 中 出 现 的 结 果 高 表 3 全 细 胞 催 化 合 成 阿 糖 胞 苷 正 交 试 验 方 差 分 析 犜 犪 犫.3 犃 狀 犪 犾 狔 狊 犻 狅 犳 狏 犪 狉 犻 犪 狀 犮 犲 犻 狀 狅 狉 狋 犺 狅 犵 狅 狀 犪 犾 狋 犲 狊 狋 狅 犳 犮 狔 狋 犪 狉 犪 犫 犻 狀 犲 犫 狔 狑 犺 狅 犾 犲 犮 犲 犾 犮 犪 狋 犪 犾 狔 狊 犻 方 差 来 源 偏 差 平 方 和 自 由 度 F 比 F 临 界 值 显 著 性 A 58.76 2 4.70 19.000 B 308.10 2 24.66 19.000 C 78.20 2 6.26 19.000 D 12.50 2 1.000 19.000 误 差 12.50 2 3 结 论 本 研 究 以 枯 草 芽 胞 杆 菌 犅 犪 犮 犻 犾 狌 狊 A302 冻 干 菌 体 作 为 全 细 胞 催 化 剂, 通 过 单 因 素 和 正 交 试 验 对 阿 糖 胞 苷 的 合 成 条 件 进 行 了 优 化 优 化 后 的 最 适 条 件 为 : 反 应 初 始 ph 为 7.0, 反 应 温 度 为 36, 催 化 剂 添 加 量 为 250mg, 摇 床 转 速 为 190rpm 在 最 佳 反 应 条 件 下, 阿 糖 胞 苷 最 高 收 率 可 以 达 到 65.3% 采 用 全 细 胞 催 化 合 成 阿 糖 胞 苷, 无 需 破 碎 细 胞, 工 艺 大 大 得 到 简 化, 同 时, 还 减 少 了 反 应 杂 质, 为 后 续 阿 糖 胞 苷 的 分 离 纯 化 提 供 了 有 利 的 条 件 参 考 文 献 [1] ByersT,Nestle M,Mctiernan A.Americancancer societyguidelinesonnutritionandphysicalactivityfor cancerprevention:reducingtherisk ofcancer with healthyfoodchoicesand physicalactivity [J].CA CancerJClin,2002,52(2):92 119. [2] 陈 建 国, 陆 建 华. 国 内 外 癌 症 仿 制 现 状 [J]. 肿 瘤, 2007,27(9):755 759. [3] FerlayJ,Shin H R,BrayF.Estimatesofworldwide burdenofcancerin2008:globocan2008 [J].Int JCancer,2010,127(12):2893 2917. [4] 杨 蓉, 谢 晓 恬, 蒋 莎 义, 等. 阿 糖 胞 苷 代 谢 关 键 酶 活 性 与 大 剂 量 阿 糖 胞 苷 治 疗 时 药 物 血 浓 度 关 系 研 究 [J]. 中 国 肿 瘤 临 床,2010,37(13):742 748. [5] 刘 宇 宏, 曹 慧 琴, 葛 繁 梅, 等. 中 剂 量 阿 糖 胞 苷 联 合 氟 达 拉 滨 在 急 性 非 淋 巴 细 胞 白 血 病 巩 固 化 疗 中 的 应 用 [J]. 现 代 肿 瘤 医 学,2012,20(4):794 796. [6] 饶 哲, 张 珩, 杨 艺 虹, 等. 盐 酸 阿 糖 胞 苷 和 盐 酸 环 胞 苷 工 艺 研 究 [J]. 精 细 化 工 中 间 体,2013,43(6):29 32. [7] 许 杨, 陈 芳, 林 白 雪, 等. 全 细 胞 催 化 生 产 N 乙 酰 神 经 氨 酸 的 条 件 优 化 [J]. 微 生 物 学 通 报,2013,40(8): 1331 1338. [8] 王 涛, 吕 冬 梅, 邱 述 玲, 等.HPLC 法 同 时 测 定 血 浆 中 阿 糖 胞 苷 及 阿 糖 尿 苷 浓 度 [J]. 药 学 与 临 床 研 究, 2009,17(5):435 437. [9] 许 双 临, 陈 子 春, 林 宇 涵, 等. 大 剂 量 阿 糖 胞 苷 治 疗 时 血 浆 阿 糖 胞 苷 及 阿 糖 尿 苷 的 HPLC 测 定 方 法 [J]. 海 峡 药 学,2013,25(7):128 130. [10] 万 红 贵, 赵 宗 松, 蒋 导 航, 等. 微 生 物 全 细 胞 催 化 技 术 在 工 业 生 产 中 的 应 用 [J]. 安 徽 农 业 科 学,2011,39 (4):1917 1919. [11] 郭 明, 胡 昌 华. 生 物 转 化 从 全 细 胞 催 化 到 代 谢 工 程 [J]. 中 国 生 物 工 程 杂 志,2010,30(4):110 115.
氨 基 酸 和 生 物 资 源 5